Karotis Cisimlerinde Leptin Sinyalizasyonunu Ve Solunum Kontrolüüzerindeki Etkilerini İncelemek İçin Deneysel Yaklaşım

Özet

Çalışmamız da karotis cisimdeki leptin sinyalinin (CB) hipoksik ventilatör yanıtı (HVR) üzerine etkileri üzerinde yoğunlaştır. CB denervasyonu ndan sonra leptinin HVR üzerindeki etkisini ölçen 'fonksiyon kaybı' deneyleri ve CB'deki leptin reseptörünün aşırı ekspresyonundan sonra HVR'ı ölçen 'fonksiyon kazancı' deneyleri yaptık.

Özet

Bir adiposit üretilen hormon leptin güçlü bir solunum uyarıcı, obezite solunum fonksiyonunu savunmada önemli bir rol oynayabilir. Periferik hipoksik duyarlılığın önemli bir organı olan karotis cisim (CB), leptin reseptörünün uzun fonksiyonel izoformunu ifade eder (LepR^b) ancak solunum kontrolünde leptin sinyalizasyonunun rolü tam olarak açıklanmamıştır. C57BL/6J farelerde bazinde ve CB denervasyonundan sonra leptin infüzyonu öncesi ve sonrası hipoksik ventilatör yanıtı (HVR) (1) incelendi; (2) LepR^b-eksik obez db/db farelerde taban çizgisi ve CB'lerde LepR^b aşırı ekspresyonu sonrası. C57BL/6J farelerde leptin hvr artmış ve leptinin HVR üzerindeki etkileri CB denervile ortadan kaldırılmıştır. Db/db farelerde CB'deki LepR^b ifadesi HVR'yi artırdı. Bu nedenle, leptin in CB'de hipoksiye verilen yanıtları arttırdığı sonucuna varıyoruz.

Giriş

Bir adiposit üretilen hormon leptin hipotalamus gıda alımını bastırmak ve metabolik hızı artırmak için hareket eder. Laboratuvarımızda yapılan çalışmalar^1,2 ve diğer araştırmacılar tarafından^3,4 leptin hiperkapnik ventilatör yanıtı artırır gösterdi (HVR) leptin obezite hipoventilasyon önlenmesi eksik obezite. Ancak, obez bireylerin çoğunluğu yüksek plazma leptin düzeyleri var ve hormon metabolik ve solunum etkilerine direnç göstermek^5,6,7,8. Leptin direnci multifaktöriyel, ancak kan-beyin bariyerinin sınırlı geçirgenliği (BBB) leptin önemli bir rol oynar. Leptinin obez bireylerde solunumu savunmak için periferik hipoksik duyarlılık, karotis cisim (CB) önemli bir organda BBB altında hareket etmesini öneriyoruz. CBs leptin reseptörünün uzun fonksiyonel izoformunu ifade, LepR^b, ancak leptin solunum etkileri CB rolü yeterince açıklanmış olmamıştır^9,10.

Yöntemimizin amacı CB'deki leptin sinyalinin HVR üzerindeki etkisini incelemekti. Mantığımız (a) farelerde bozulmamış karotis cisimleri ve denervated karotis cisimleri ile HVR ölçümleri ile leptin infüzyon fonksiyon deneyleri kaybı gerçekleştirmek oldu; (b) LepR^b'denyoksun db/db farelerde fonksiyon deneylerinin kazanımı, hvr'ı taban çizgisinde ve LepR^b'nin sadece CB cinsinden ifadesinden sonra ölçtük. Tekniklerimizin avantajı, tüm deneylerimizi uyku ve uyanıklık sırasında kontrolsüz anestezisiz farelerde yapmamızdı. Önceki araştırmacılar ya anestezi altında deneylerini yaptı⁹ veya uyku sırasında leptin etkilerini ölçmek vermedi¹⁰. Buna ek olarak, çalışmamız yukarıda açıklanan CB seçici LepR^b ifadesi ile fonksiyon yaklaşımıbenzersiz bir kazanç kullanmak için ilk.

Geniş bağlamda, yaklaşımımız CB ile ifade edilen diğer reseptörlere ve hipoksik duyarlılıktaki rollerine genellenebilir. Araştırmacılar ilgi reseptörüne bir ligand aşılayabilir ve temel ve CB denervasyon sonra HVR ölçmek. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, cb ve HVR ölçümlerinde ilgi reseptörü aşırı ifade edilebilir önce ve bu makalede açıklanan teknolojiile aşırı ekspresyon dan sonra yapılabilir.

Protokol

Tüm deneysel protokoller Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (MO18M211) tarafından onaylanmıştır.

1. Leptin İnfüzyonu

NOT: Leptinin solunum üzerindeki etkisini incelemek için, obez farelerde gözlenen ler için dolaşımdaki leptin düzeylerini yükseltmek için bir ozmotik pompa ile yağsız C57BL/6J farelere deri altı leptin aşıladık.

1. Ozmotik pompa hazırlama
   1. Boş pompayüklü çözeltinin net ağırlığını kontrol etmek için tartın.
   2. Ozmotik pompaya Leptin (5 mg/mL) ekleyin (3 gün boyunca 1 μL/h). Pompayı küçük bir şırınga (1 mL) ile doldurun. Doldurduktan sonra, sağlanan künt uçlu 27 gauge dolum tüpü ile pompa kapatın.
      NOT: Şırınga ve bağlı tüp hava kabarcıkları ücretsiz olmalıdır.
   3. Doldurduktan sonra, çözeltinin net ağırlığını kontrol etmek için pompayı tekrar tartın.
   4. Leptin pompasını interscapular alana deri altı içine yerleştirin.
      NOT: İnfüzyona hemen başlamak istiyorsanız, steril saline önceden doldurulmuş pompayı en az 4-6 saat (tercihen bir gecede) 37 °C'de tüphaline alın.

2. Hipoksik Ventilasyon Yanıtı (HVR)

NOT: Termonötr koşullar, soğuk ortam sıcaklığının dayattığı stresli faktörleri ortadan kaldırır ve farelerdeki metabolizmayı önemli ölçüde değiştirir. Bu nedenle tüm solunum ölçümleri termonötr koşullarda (t = 30 °C) neonatal inkübatör¹² (Şekil 1A)kullanılarak yapılmalıdır. Tüm vücut pletimografi odası (WBP) tüm ölçümler için kullanılmıştır. Tüm hayvanlar HVR ölçümlerinden 3-5 gün önce sonraki nabız oksimetri kaydı için barometrik pletimografi odasına ve sahte boyun yakasına alışmalıdır. HVR arasında kaydedilir 10 ve 5 PM. HVR uyku sırasında bastırılır, bu nedenle uyku ve sessiz uyanıklık sırasında ayrı ayrı ölçülebilir¹³. HVR ölçümü sırasında hayvanın özel uyku-uyanıklık evresini sağlamak için, EEG/EMG elektrotları daha önce açıklandığı gibi EEG/EMG headmount olarak yerleştirilmelidir¹⁴. Hayvanların baş atlayıştan sonra en az 72 saat iyileşmelerine izin verilmelidir. Uyku evreleme 5 s çağlarda yapılmalıdır. NREM uykusu, çağın %50'sinden daha fazla sını kaplayan yavaş dalga EEG aktivitesi ile tanınır. Sessiz uyanıklık hareketlerin yokluğunda alfa EEG aktivitesi ile kendini gösterir. REM uykusu, EMG'de azalmış kas tonusu varlığında baskın alfa ve teta EEG aktivitesi ile tanımlanır. Tipik olarak, REM uykusu HVR gaz sorunları sırasında gözlenmez.

1. HVR kayıt protokolü
   1. WBP haznesini aşağıdaki boyutta kullanın: 80 mm iç çapı, yüksekliği 50,5 mm ve hacim 0,4 L. WBP odası iki oda, mühürlü ve referans odaları ve fare¹⁴ (Şekil 1B)yerleştirmek için dairesel bir platform oluşur. Oda içindeki giriş ve çıkış, atmosfer basıncını koruyan pozitif ve negatif basınç kaynakları tarafından kontrol edilir. Bu denetim haznede sabit bir sapma akışı oluşturur ve CO₂ tutmasını önler. WBP kurmak hakkında daha fazla bilgi için, Hernandez ve meslektaşları¹⁵bakın.
   2. Fareyi WBP'ye yerleştirmeden önce odaiçindeki sıcaklığı ve odadaki bağıl nemi ölçün.
   3. Vücut ağırlığını ve rektal sıcaklığı ölçün.
   4. Oksimetre yakasını farenin boynuna koyun (alan daha önce tıraş edilmelidir).
   5. Fareyi WBP'nin içine yerleştirin ve hava sızıntılarını önlemek için odanın tamamen kapalı olduğundan emin olun.
   6. Fare sessiz ve oda sabit bir hacimde olana kadar yaklaşık 30 dakika bekleyin.
   7. Normoksia: 30 dakika sonra, fare sessiz ise, solunum sinyalleri ve periferik oksijen doygunluğu (SpO₂) normoksia fazında kayıt başlar (21% FiO₂ basınç 1 atm) için 20 dk, LabChart 7 Pro kullanarak (sürüm 7.2).
   8. Hipoksi: sessiz normoksi 20 dakika sonra, akut hipoksi ve SpO₂ilk döngüsü kaydetmeye başlar. Hipoksi fazı için, hayvanları 5 dk için %10 O₂ ve %3 CO_2'den oluşan sabit bir karışık gaz akışına maruz bırakın.
      1. Hipoksinin ilk 30 sn sırasında, karışık gaz fio_2% 21 (basınç 1 atm)% 10 düşmesine izin tabanında 2 küçük yan bağlantı noktası üzerinden oda akar.
      2. İlk 30'lardan sonra, WBP odasının küçük yan bağlantı noktalarından birini kapatın ve sabit hipokside %10 FiO_2'de 5 dakika boyunca kaydı tutun.
         NOT: Hipokside %10 O₂ ve %3 CO₂ karışımı eukapne^11'ikorumak için kullanılır.
   9. 5 dk hipoksiden sonra, giriş kaynağını değiştirerek fareyi tekrar oda havasına (1 atm basınçta %21 FiO₂₎ maruz bırakın.
   10. Ventilatör roll-off fenomeni önlemek için önceki hipoksik maruziyet kurtarmak için bir sonraki normoksia kaydı kadar en az 30 dakika bekleyin (yani, hipoksi sırasında solunum merkezi bastırma^16).
       NOT: Ölçümlerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için normoksia/hipoksi döngülerini her farede üç kez tekrarlayın. Bizim deneyim, ek (belirli bir günde 3 kez daha fazla) hipoksik maruzkalma kaçınılmalıdır, ventilatör adaptasyon nedeniyle (roll-off fenomen).
   11. Deneyin sonunda, odanın tabanındaki küçük yan bağlantı noktalarından birine takılı bir şırınga ile 3 kez 1 mL oda havası enjekte ederek WBP odasını (fare hala içeride) kalibre edin.
   12. Odadaki hayvanı tekrar ölçün.
   13. Odayı açın ve fareyi ev kafesine geri koymadan önce rektal sıcaklığı ölçün.
2. HVR hesaplama
   1. HVR hesaplaması için tüm sinyalleri 1.000 Hz (kanal başına örnekleme frekansı) olarak dijitalleştirin.
      NOT: WBP gelgit hacim analizi Drorbaugh ve Fenn denklemi¹⁷dayalı Lab Chart 7 yapılır. Gerekli değişkenler fare rektal sıcaklığı ve oda sıcaklığı (HVR ölçümü öncesi ve sonrası), bağıl nem ve oda gazı sabitini kapsar. Bu sabit, kalibrasyon aşamasında ki 1 mL hava enjeksiyonundan sonra WBP basınç saptırıcılığısonucu ortaya çıkar. Daha fazla bilgi için, Hernandez ve meslektaşları¹⁵bakın.
   2. Drorbaugh ve Fenn denklemini hesapladıktan sonra, gelgit hacmi (Vt) oda kanalını sabitle çarpın.
   3. Analiz için kayıtların seçimi
      1. Normoxia: sabit gelgit hacmi ile sürekli nefes sadece bölümleri seçin. Farenin hareketlerine yakın bölümlerden kaçının.
      2. Hipoksi: O₂ düzeyleri %21'den %10'a düştüğünde ilk 30 s'yi atın, 30 s'den 2 dakikaya kadar %10 O₂ pozlama (90 s aralığı) bölümlerini seçin. Bu aralıkta, sabit gelgit hacmiile sabit nefes alan yalnızca bölümleri seçin. Farenin hareketlerine yakın bölümlerden kaçının. Her döngüde en az 10 s hipoksi seçilirse analiz güvenilirdir.
         NOT: CB tarafından yönetilen chemoreflex periferik bileşeni maruz kalma ilk 1-2 dakika sırasında hakim^16,18,19. İkinci aşamada, 2 dakika ile 5 dk arasında hipoksik maruziyet, hem periferik hem de santral bileşen rol oynar. Son olarak, üçüncü faz, > 5 dk, hipoventilasyon ile karakterizedir (roll-off fenomeni) merkezi kemoreseptörler tarafından ağırlıklı olarak yönetilir. Deneyimlerimiz, hava akımı kaynağındaki manuel anahtarlar nedeniyle farelerin hipoksik sergi sırasında genellikle uyanık olduğunu göstermektedir.
   4. Seçimden sonra, normoksik ve hipoksik koşullarda ortalama dakika ventilasyonunu (V_E)formül V_E = solunum hızı X gelgit hacmini kullanarak hesaplayın.
   5. Normoksi ve hipoksi koşullarında ortalama SpO_2'yi hesaplayın.
   6. HVR formülünü kullanarak HVR'ı manuel olarak hesaplayın = (V_E (%10 O₂) - V_E (21%O₂)) / (SpO₂ (%10 O₂) – SpO₂ (%21 O₂)).
      NOT: C57BL/6J farelerde, leptin infüzyonu için ozmotik pompa boyun yaka tarafından doğru SpO₂ sinyal algılama bozabilir. Bu durumda HVR normoksik ve hipoksik koşullarda FiO₂ değerlerine göre HVR = ΔV_E / ΔFiO₂¹¹olarak hesaplanır.

3. Karotis Vücut Denervasyon veya Karotis Sinüs Sinir Diseksiyonu (CSND)

NOT: Bir hafta arayla kombine cerrahi ve kimyasal denervasyon uyguladık, çünkü cerrahi denervasyon tek başına hipoksik chemoreflex'i ortadan kaldırmaz.

1. Cerrahi hazırlık
   1. Yetişkin erkek C57BL/6J fareler üzerinde tüm prosedürleri gerçekleştirin. Tüm cerrahi aletleri sterilize edin. Steril cerrahi eldivenler, şırıngalar ve pamuk uçlu aplikatörler kullanın.
   2. Bir burun konisi kullanarak% 1-2 isofluran ile erkek C57BL/6J fareler anestezi ve hipotermi önlemek için sıcak bir battaniye yerleştirin. Isoflurane 1 Hz (60 nefes/dk) solunum hızını korumak için dikkatle titre edilir. Ameliyatlara başlamadan önce anestezinin yeterliliği solunum sıklığı, hareketlerin ve duyulabilir seslerin yokluğu, dokunsal uyaranlara yanıt olmaması ve ön veya arka bacak pedalı çekilme refleksi ile değerlendirilecektir.
   3. Ağrı rahatsızlıklarını önlemek için buprenorfin (0.05 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayın. Boynun ventral bölgesinde saç çıkarın ve betadine ve alkol ile bölgeyi dezenfekte.
   4. Kornea nın kurumasını önlemek için, anestezi sırasında farelerin gözlerini steril oftalmik merhem ile yağlatın.
2. CSND prosedürleri
   Evre 1: Cerrahi denervasyon
   1. Orta hat insizyonu sonra, bağ dokuları ve yağ dokusu kaldırarak ortak karotis arterlerin bifurkasyon ortaya.
   2. Hipoglossal sinir tanımlayın, genellikle çok belirgindir, ve sonra hemen altında glossopharyngeal sinir ortaya çıkarmak için yukarı kaldırın. Mikro yay makaskullanarak karotis sinüs sinirlerini iki taraflı olarak diseksiyon.
   3. Kesiyi 6-0 ipek sütür ile kapatın.
   4. Dehidratasyonu önlemek için 1 mL normal tuzlu su altı deri sini uygulayın.
   5. Fareleri bir kurtarma odasında barındırın ve fareler göğüs selremiyetini korumak için bilincini geri kazanana kadar ilk 15 dakikada bir davranışlarını izleyin. Fareler tamamen iyileştikten sonra ev kafeslerine geri dönün. Önümüzdeki 3 gün boyunca günde iki kez fareleri izlemeye devam edin. Fareler ağrı belirtileri gösteriyorsa ek buprenorfin verin (örn. iştah azalması, huzursuzluk).
      Aşama 2: Kimyasal denervasyon
   6. Ameliyattan bir hafta sonra, kaftanofarengeal sinirden CB'nin kranial direğine dallanma noktalarında etanolle seyreltilmiş %2 fenol çözeltisi ile karotis arteri boyayın. Cerrahi denervasyon bölümünde yukarıda açıklandığı gibi kimyasal denervasyon dan sonra aynı postoperatif bakım sağlanmalıdır.
      NOT: Sahte cerrahi grubu için karotis sinüs sinir diseksiyonu dışında aynı işlemler yapılır.
   7. HVR ölçümlerini yapmadan önce hayvanların 5-7 gün iyileşmesini sağlar.

4. Cb'de LepR^b'nin adenoviral vektör(Ad-LepR^b) vs kontrol (Ad-LacZ) kullanarak ekspresyonu

1. Ad-LepR^b ve Ad-LacZ süspansiyon
   1. Transfect adenovirüs ile fareler (Ad-LepR^b-GFP, 2-5x10¹⁰ pfu/mL aşırı ekspresyon için, Ad-Lacz, 1 x 10¹⁰ pfu/mL kontrol için) CB alanına.
   2. Matrigel matrisini bir gecede 4 °C'lik bir buzdolabında şişeyi buza batırarak eritin.
   3. Sıvı Matrigel matrisindeki adenovirüs hafifçe 1:5'te (1 μL Matrigel matrisi ve 4 μL adenovirüs iki taraflı olarak uygulanır).
   4. CB'de uygulanana kadar her zaman viral süspansiyonu buzüzerinde tutun.
2. Cerrahi hazırlık
   1. CSND protokolü ile aynı cerrahi aletleri kullanın.
   2. Bir burun konisi kullanarak% 2-2.5 izofluran ile LepR^b-eksik db/db fareler anestezi ve hipotermi önlemek için sıcak bir battaniye üzerine hayvanları yerleştirin. Isoflurane 1 Hz (60 nefes/dk) solunum hızını korumak için dikkatle titre edilir. Anestezinin yeterliliği solunum sıklığı, hareketlerin ve duyulabilir seslerin yokluğu, dokunsal uyaranlara yanıt ın olmaması ve ön veya arka bacak pedalı çekilme refleksi ile değerlendirilecektir.
   3. Buprenorfin (0.05 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayın.
   4. Boynun ventral bölgesindeki tüyleri çıkarın ve CSND protokolünde olduğu gibi bölgeyi betadin ve alkolle dezenfekte edin.
   5. Kornea nın kurumasını önlemek için, anestezi sırasında farelerin gözlerini steril oftalmik merhem ile yağlatın.
3. CB adenovirüs tedavisi
   1. CSND protokolünde açıklandığı gibi CB'leri ortaya çıkarın ve viral süspansiyonun 5 μL'sini CB bölgesine iki taraflı olarak uygulayın.
   2. Sıvı Matrigel matris bir jel haline gelene kadar 2-3 dk bekleyin. Viral süspansiyonun kapatıldığını doğruladıktan sonra, kesiyi 6.0 ipek sütür ile kapatın.
4. Ameliyat sonrası
   1. Fareleri bir kurtarma odasında barındırın ve fareler göğüs selremiyetini korumak için bilincini geri kazanana kadar ilk 15 dakikada bir davranışlarını izleyin. Fareler tamamen iyileştikten sonra ev kafeslerine geri dönün. Önümüzdeki 3 gün boyunca günde iki kez fareleri izlemeye devam edin. Fareler ağrı belirtileri gösteriyorsa ek buprenorfin verin (örn. iştah azalması, huzursuzluk).
   2. Postoperatif dönemde ağrı rahatsızlıklarını önlemek için gerektiğinde Buprenorfin (0.05 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulayın.
   3. Adenovirüs transfeksiyonundan 9 gün sonra HVR ölçün.

Sonuçlar

Yalın C57BL/6J farelerde sürekli leptin infüzyonu HVR'ı 0,23'ten 0,31 mL/dk/g/ΔFiO_2'ye yükseltti (P < 0,001, Şekil 2)¹¹. CSND, Leptin infüzyonu sonrası sham cerrahi grubunda CSND'nin HVR üzerinde zayıflatıcı etkisi gözlenmezken, HVR'da leptin kaynaklı artışı(Şekil 2)ortadan kaldırmış ve hiçbir zayıflatıcı etkisi gözlenmemiştir.

LepR^b-eksik obez...

Tartışmalar

Çalışmamızın ana odak noktası CB'de leptin sinyalinin solunum etkilerini incelemekti. Çeşitli protokoller mekanistik bir şekilde leptin rolünü değerlendirmek için geliştirilmiştir. İlk olarak, CB'nin HVR'ye özel katkısı hipoksik maruziyetin ilk 2 dakikasında HVR'nin dikkatli bir şekilde ölçülmesi ile analiz edildi. İkinci olarak, solunum kontrolünün leptin aracılı yukarı düzenlenmesinde CB'nin önemi iki tamamlayıcı yaklaşımla incelenmiştir. Düşük leptin düzeylerine sahip yalın ya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Insulin Syringes	BD Biosciences	309311
1x PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023	500 ml
Ad-Lacz	Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)		1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFP	Vector Biolabs	ADV-263380	2-5 x 1010 pfu/mL
Anesthetic cart	Atlantic Biomedical
Betadine	Purdue Products Ltd.	12496-0757-5
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	0.3 mg/mL
C57Bl/6J	Jackson laboratory	000664	Mice Strain
Cotton Gauze Sponges	Fisherbrand	22-362-178
db/db	Jackson laboratory	000697	Mice Strain
Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Isoflurane	Vetone	502017
Lab Chart	Data Science International (DSI)		Software
Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
Micro Spring Scissors	World Precision Instruments (WPI)	14124
Mouse Ox Plus	STARR Life Sciences Corp.		Software
Mouse Ox Plus Collar Sensor	STARR Life Sciences Corp.	015022-2	Medium Collar Clip Special 7”
Mouse Whole Body Plethysmography Chamber	Data Science International (DSI)	PLY3211
Ohio Care Plus Incubator	Ohmeda	HCHD000173
Operating Scissors	World Precision Instruments (WPI)	501753-G	Straight
Osmotic Pump	Alzet	1003D	1 μL/h, 3 days
Phenol	Sigma-Aldrich	P4557
Recombinant Mouse Leptin protein	R&D systems	498-OB-05M	5 mg
Saline	RICCA Chemical	7210-16	0.9% Sodium Chloride
Sterile Surgical Suture	DemeTech	DT-639-1	Silk, size 6-0
Thermometer	Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)	EW 20250-91