Bölünmüş Luciferase Assay Sistemi Kullanarak HBx-DDB1 Etkileşiminin Inhibitörlerinin Belirlenmesi

Özet

Burada, bölünmüş luciferase tsay sistemi kullanarak HBx-DDB1 etkileşimini inhibe eden anti-hepatit B viral ajanların taranması için bir yöntem salıyoruz. Bu sistem protein-protein etkileşimlerinin kolay algılanmasını sağlar ve bu etkileşimlerin inhibitörlerini belirlemek için uygundur.

Özet

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu için yeni terapötik ajanlara acil ihtiyaç vardır. Şu anda mevcut nükleos(t)ide analogları viral replikasyonu güçlü bir şekilde inhibe etseler de, viral kovalent olarak kapalı dairesel DNA'dan (cccDNA) transkripsiyonu yapılan viral proteinlerin ekspresyonu üzerinde doğrudan bir etkiye sahip değildirler. Yüksek viral antijen yükü bu kronik ve HBV ile ilişkili karsinogenezde rol oynayabileceğinden, HBV tedavisinin amacı viral proteinleri ortadan kaldırmaktır. HBV düzenleyici protein X (HBx) kromozomların yapısal bakımını bozacak şekilde konak DNA hasar bağlayıcı protein 1 (DDB1) proteinine bağlanır (Smc5/6), cccDNA'dan viral transkripsiyon aktivasyonu ile sonuçlanır. Burada, bölünmüş luciferase kompleman teşeleme sistemi kullanarak, HBx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini belirlemek için kapsamlı bir bileşik tarama sistemi salıyoruz. Protokolümüz, etkileşim dinamiklerinin canlı hücreler içinde gerçek zamanlı olarak kolayca algılanmasını sağlar. Bu teknik HBV enfeksiyonutedavisi için yeni terapötik ajanlar keşfetmek için önemli bir tetki olabilir.

Giriş

Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunudur, yıllık tahminlere göre 240 milyon kişi kronik HBV ile enfekte ve 90.000 ölüm enfeksiyon komplikasyonları nedeniyle, siroz ve hepatosellüler karsinom da dahil olmak üzere (HCC)¹. Mevcut anti-HBV terapötik ajanlar, nükleos(t)ide analogları, yeterince viral ters transkripsiyon inhibe rağmen, nadiren viral proteinlerin ortadan kaldırılması elde, hangi uzun vadeli klinik hedeftir. Viral protein eliminasyonu üzerindeki kötü etkileri, hepatosit çekirdeğindeki epizomal viral kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA) minikromozomlarından viral transkripsiyon üzerinde doğrudan etki olmamasından kaynaklanmaktadır².

HBV transkripsiyonu HBV düzenleyici X (HBx) protein³ile aktive edilir. Son çalışmalar HBx kromozomlar yapısal bakım bozunr ortaya 5/6 (Smc5/6), cccDNA HBV transkripsiyon blokları bir konak kısıtlama faktörü, bir DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligaz kompleksi kaçırma yoluyla^4,5,6. Bu nedenle, cccDNA viral transkripsiyon teşvik önemli bir adım HBx-DDB1 etkileşimi olduğu düşünülmektedir. HBx ve DDB1 arasındaki bağlanmayı inhibe edebilen bileşikler viral transkripsiyonengelleyebilir, ve gerçekten nitazoxanide bizim laboratuvar da geliştirilen bir tarama sistemi ile HBx-DDB1 etkileşiminin bir inhibitörü olarak tespit edilmiştir⁷.

Burada, hbx-DDB1 etkileşiminin inhibitörlerini tanımlamak için kullanılan uygun tarama sistemimizi sıyoruz, bu da 7^,8'likbölünmüş luciferase tamamlayıcı^birteşp. Split luciferase alt birimleri HBx ve DDB1'e kaynaştırılır ve HBx-DDB1 etkileşimi alt birimleri yakınbir yere getirerek parlak parlak bir sinyal üreten işlevsel bir enzim oluşturur. Alt birimler arasındaki etkileşim tersine çevrilebildiği için, bu sistem hbx-DDB1 proteinlerinin hızla ayrıştırıcı olduğunu algılayabilir(Şekil 1). Bu sistemi kullanarak, büyük bir bileşik kitaplığı kolayca taranabilir, hangi verimli HBx-DDB1 etkileşimini inhibe yeteneğine sahip yeni bileşiklerin keşfi neden olabilir.

Protokol

NOT: Bölünmüş luciferase tamsasının şematik gösterimi Şekil 1A'dagösterilmiştir ve isme işlemi Şekil 1B'deözetlenmiştir. Etkileşim dinamiği hücre lisisi olmadan gerçek zamanlı olarak ölçülebilir.

1. Hücre Hazırlama

1. Dulbecco'nun modifiye Eagle'S orta (DMEM) % 10 v / v fetal sığır serum (FBS), 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kültürlü HEK293T hücreleri korumak 37 ° 20% O₂ ve% 5 CO₂.
2. 10 mL DMEM ile 100 mm'lik bir tabağa 5 x 10⁶ hücre tohumu ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. Aşağıdaki yönteme göre hücrelere bölünmüş luciferases ile HBx ve DDB1 geçici transfect 1 μg.
   NOT: Transzmid DNA'sının miktarı kullanılan transfeksiyon naibine bağlı olabilir. Hedef proteine kaynaşmış bölünmüş luciferasein optimal pozisyonu önceden belirlenmelidir. Bu durumda, HBx, C-terminus'ta LgBit'e (HBx-LgBit) ve DDB1'de DDB1'in N-terminus'unda (SmBit-DDB1) SmBit'e kaynaşmış olarak erimiş ve en iyi sonuçları (yani en parlak luciferase sinyalleri) sağlamıştır. Bu işlem daha önce ayrıntılı olarak bildirilmiştir⁷.
   1. DNA yoğuşma tamponunda(MalzemeTablosu)DNA plazmidini ifade eden 1 μg HBx-LgBit ve 1 μg SmBit-DDB1 toplam 300 μL hacmine seyreltin.
   2. 16 μL arttırıcı çözelti(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 1 s girdap ile karıştırın.
   3. Numuneyi oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. Numuneye 60 μL transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve 10 s girdap ile karıştırın.
   5. Numuneyi 8 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
   6. Kuluçka sırasında, çanak (adım 1.2 hazırlanan) kültür ortamı aspire ve fosfat tamponlu salin (PBS) 5 mL ile hücreleri yıkayın. Aspirasyon aspirasyon ile PBS kaldırın ve DMEM 7 mL ekleyin.
   7. Transfeksiyon komplekslerini içeren tüpe 3 mL DMEM ekleyin. Pipetleme ile karıştırın ve 10 cm çanak hücre üzerine transfection kompleksleri ekleyin.
4. Hücreleri 37 °C'de bir kuvözde %5 CO_2'nin altında 10 saat kuluçkaya yatırın.
5. Aşağıdaki yönteme göre 50 μL orta/iyi de 50 μL'lik hücrelerde hücreleri beyaz 96 kuyu plakasına yeniden yerleştirin.
   1. Harcanan hücre kültürünü orta çıkarın ve 5 mL PBS ile hücreleri yıkayın.
   2. Aspirasyon ile PBS'yi çıkarın, 1 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
   3. 4 mL DMEM ekleyin ve hücre tabakasının yüzeyine birkaç kez boru tutarak orta yıkın. Hücre süspansiyonuna bir tüp aktarın.
   4. Oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g santrifüj hücreleri.
   5. Supernatant atın ve PBS 1 mL hücre pelet resuspend.
   6. Hücre süspansiyonuna 500 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj edin ve süpernatant atın.
   7. 1.0 x 10⁶ hücre/mL bir tohumlama yoğunluğuna% 10 FBS ile desteklenen tamponlu hücre kültür ortamı(Malzeme Tablosu)ile hücre pelet seyreltmek.
   8. Pipet 50 μL hücre süspansiyonu 96 kuyunun her kuyusu içine ve hücreleri kuvöze geri döndürün.
6. 37 °C'de %5 CO_2'nin altında 10 saat boyunca kuluçka yakan hücreler.

2. Bileşik Tarama

1. Kuluçka sırasında, 13.5x konsantrasyonda tarama bileşiklerini(Malzeme Tablosu)ve çözücü (dimetil sülfoksit [DMSO]) seyreltin. Örneğin, stok 10 mM ve tarama konsantrasyonu 10 μM ise, 73,1 μL arabelleğe alsa 1 μL stok çözeltisi ekleyin.
2. Her kuyuya 12,5 μL'lik parlak substrat(Malzeme Tablosu)ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Negatif kontroller olarak plakanın her iki ucundaki kuyular (yani, sütun 1 ve 12) parlak bir substrat içermemelidir.
3. Bir luminometre(Malzeme Tablosu)kullanarak temel parlaklığı ölçün.
4. İlk ölçümden hemen sonra, 5 μL bileşik ekleyin ve her kuyuya 2,1 adımda seyreltilmiş DMSO'yu kontrol edin.
   NOT: Son konsantrasyon 10 μM olacaktır.
5. Luminesans değerlerini her 30 dk'da 2 saat ölçün.
   NOT: Plaka oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya yatırılmalıdır.
6. Temel sinyallere normalleştirme den sonra kontrol DMSO tedavisi ile karşılaştırıldığında inhibitör etkileri hesaplayın.
   NOT: Her bileşiğin yinelenen veya üç leme halinde taranması varyasyonu azaltabilir.

Sonuçlar

Bu protokolün kullanımını izleyen temsili sonuçlar Şekil 2A,B'degösterilmiştir. Sinyal-arka plan oranı 80'den büyüktü ve Z' faktörü⁹ (yüksek işlem taraması için altın standart kalite endeksi) 0,5'ten büyüktü ve bu da bu test sisteminin yüksek işlem taraması için kabul edilebilir olduğunu gösteriyordu. Eşik olarak belirlenen >40% inhibisyon kontrol ile karşılaştırıldığında (Sadece DM...

Tartışmalar

HBx-DDB1 bağlayıcı inhibitörlerini bulmak için split luciferase tsay kullanarak uygun bir tarama yöntemi geliştirdik. Hücre lisisine gerek kalmadan canlı hücrelerde etkileşim dinamiği gerçek zamanlı olarak saptanabilir. HBx-DDB1 etkileşiminin inhibisyonu Smc5/6'nın restorasyonuna yol açar, bu da viral transkripsiyon, protein ekspresyonu ve cccDNA üretiminin bastırılmasıyla sonuçlanır⁷. Antiviral eylem bu yeni mekanizma mevcut HBV tedavilerin yetersizlikleri üstesinden geleb...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049