Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

Özet

Astrositler serebral korteksi düzgün bir şekilde döşer ve karmaşık morfolojilerinin analizini hücresel düzeyde zorlaştırır. Burada sağlanan protokol, kortikal astrositleri ayırmak ve hacimlerini ve morfolojilerini kullanıcı dostu bir görüntü analizi ardışık düzeni ile analiz etmek için rahim elektroporasyonunu temel alan çok renkli etiketleme kullanır.

Özet

Fare serebral korteksinde bulunan protoplazmik astrositler (PrA) sıkıca yan yana getirilir ve yetişkin aşamalarında görünüşte sürekli üç boyutlu bir matris oluşturur. Şimdiye kadar, hiçbir immünostaining stratejisi onları ayıramaz ve morfolojilerini olgun hayvanlarda ve kortikogenezi boyunca segmentlere ayıramaz. Kortikal PrA, dorsal palyumda bulunan progenitörlerden kaynaklanır ve bütünleştirici vektörlerin utero elektroporasyonunda kullanılarak kolayca hedeflenebilir. Bu hücreleri, belirli hücre altı bölmelere hitap eden farklı floresan proteinleri (mavi, siyan, sarı ve kırmızı) stochastically ifade etmek için piggyBac / Tol2 transpozisyonuna ve Cre /lox rekombinasyonuna dayanan çok adresli genom bütünleştirici renk (MAGIC) İşaretleyici stratejisi ile etiketlemek için bir protokol sunulmaktadır. Bu çok renkli kader haritalama stratejisi, gliogenez başlamadan önce yakındaki kortikal progenitörleri renk belirteçlerinin kombinasyonlarıyla işaretlemeyi ve bireysel hücre düzeyinde embriyonikten yetişkin aşamalarına kadar astrositler de dahil olmak üzere soyundan gelenleri izlemeyi sağlar. Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk İşaretleyicileri (MAGIC Markers veya MM) tarafından sağlanan elektroporlu vektörlerin ve renk kontrastlarının konsantrasyonunu ayarlayarak elde edilen yarı seyrek etiketleme, yoğun anatomik düzenlemelerine rağmen astrositleri bireyselleştirmeyi ve bölgelerini ve karmaşık morfolojilerini ayırmayı sağlar. Burada sunulan, elektroporasyon prosedürünün ayrıntılarını, konfokal mikroskopi ile çok kanallı görüntü yığınlarının alımını ve deneycinin bireysel PrA hacmini ve morfolojisini değerlendirmesini sağlayacak bilgisayar destekli üç boyutlu segmentasyonu içeren kapsamlı bir deneysel iş akışı sunulmaktadır. Özetle, MAGIC Marker'ların elektroporasyon, çok sayıda astrositleri ayrı ayrı etiketlemek ve anatomik özelliklerine farklı gelişim aşamalarında erişmek için uygun bir yöntem sağlar. Bu teknik, transgenik muhabir çizgilerine sahip karmaşık haçlara başvurmadan çeşitli fare modellerinde kortikal astrosit morfolojik özelliklerini analiz etmek için yararlı olacaktır.

Giriş

Astrositler beyin gelişiminde ve fizyolojisinde çok sayıda hayati fonksiyon oynar¹. Besin alımını ve kan akışını düzenledikleri kan-beyin bariyerindeki rollerinin yanı sıra, nöronal aktiviteyi ve davranışı değiştirebilecek nöromodülatörler üretirken sinaps oluşumuna ve işlevine aktif olarak katkıda bulunurlar². Ayrıca, astrosit disfonksiyonu çeşitli nörolojik bozukluklara katkıda bulunur³. Serebral kortekste bulunan astrositler, nöronal süreçlerle kapsamlı temas sağlayan ayrıntılı bir morfoloji gösterir. Devre fonksiyonu için gerekli olan bu kontaklar, hücre yapıştırma proteinleri aracılığıyla astrosit morfogenez ve sinaptogenez de kontrol eder⁴. Nörobilimciler, ilgi duydukları nörolojik modellerinde astrosit gelişimini ve morfogenezini araştırmak için uygun ve sağlam araçlara ihtiyaç duyarlar. Bununla birlikte, astrositlerin komşularına yakın apsesi ve tek tip üç boyutlu döşemeleri nedeniyle, kortikal astrositleri ayırt etmek ve immünobelerler kullanarak morfolojilerini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek zordur.

Şu anda, iki ana genetik mühendislik stratejisi kortikal astrositlerin yerinde etiketlenmesini ve bireyselleştirilmesini sağlar: transgenik fare çizgilerinde seyrek muhabir aktivasyonu veya muhabir plazmidlerinin elektroporasyonunu kullanarak somatik transgenez. İlk strateji, tamoksifen teslimatında özellikle astrositlerde aktive edilen indükleyici bir Cre rekombinaz formunu ifade eden farelerle floxed bir muhabir fare hattının yetiştirilmesine dayanır (örneğin, Aldh1l1-CreERT2^5). Bu strateji ile çeşitli dezavantajlar ilişkilidir. İlk olarak, üreme transgenik fareler çok sayıda hayvan gerektirir ve kortikal astrositlerin yeterince seyrek etiketlenilmesini sağlamak için uygun tamoksifen dozunu belirlemek için tipik olarak çoklu testlere ihtiyaç vardır. Kortikal astrosit fenotiplerinin genetik bir fare modelinde analiz etmek daha da fazla üreme ve fare tüketimi gerektirecektir. Ayrıca, rahim tamoksifen enjeksiyonunun parturition'a müdahale etmesi bilinmektedir, bu da bu stratejinin astrosit gelişiminin en erken aşamalarının incelenmesine uygulanmasını zorlaştırır. In vivo DNA elektroporasyon, minimum sayıda hayvana dayanan alternatif bir tamoksifen içermeyen stratejidir⁶. Embriyonik veya postnatal evrelerde gerçekleştirilen bu yaklaşım, kemirgenlerin lateral ventriküllerine muhabir plazmidlerinin enjekte etmesi ve ardından hücre zarında gözenekler oluşturan elektrik darbelerinden oluşur, bu nedenle DNA'nın ventrikül astarlı progenitör hücrelere girmesini sağlar. Daha sonra, elektroporlu plazmidler tarafından taşınan muhabir transgenleri hedeflenen hücre makineleri tarafından işlenir ve⁷ifade edilir. Daha önce fare kortikal astrositlerini etiketlemek için iki elektroporasyon yöntemi tanımlanmıştır: 1) Doğum sonrası astrosit Etiketleme elektroporasyon (PALE), erken doğum sonrası aşamalarda 1-2 tek renkli epizomal muhabir plazmidlerinin elektroporasyona dayanır^4; 2) Birden fazla tek renkli bütünleştirici muhabir plazmidlerinin utero elektroporasyonunu (UUİ) temel alan StarTrack stratejisi^8,9,10. Bu iki teknik serebral kortekste PrA'yı verimli bir şekilde etiketlemekle birlikte, bazı sınırlamalar da sunar. İlk sürümlerinde, her iki yöntem de astrositlerde ifadeyi yönlendirmek için glial fibril asidik protein (GFAP) promotörüne dayanır, bu da etiketlemeyi radyal gliaya ve GFAP'ı normal dinlenme PrA^11,12'dendaha güçlü ifade eden pial ve reaktif astrositlere yönlendirebilir. PALE ile ilgili olarak, diğer dezavantajlar, erken doğan PrA'nın (veya erken delaminasyon progenitörlerinden kaynaklananların) etiketlenmesini ve astroglia gelişiminin erken aşamalarının analizini önleyen elektroporasyonun geç aşaması ve PrA'nın doğum sonrası ilk hafta^13,14sırasında geçirdiği büyük çoğalma sırasında ardışık bölünmelerle seyreltilen epizomal vektörlerin kullanımıdır. PALE'in aksine, StarTrack, hem embriyonik hem de postnatal progenitörlerin PrA'ya katkısını izlemeye izin veren bütünleştirici muhabir plazmidlerinin embriyonik elektroporasyonuna dayanmaktadır. Ubiquitin C promotörüne (UbC-StarTrack)dayanan güncellenmiş bir StarTrack şeması, nöral progenitörlerin hem nöronal hem de glial inişinde (astrositler dahil) floresan muhabirlerin daha geniş bir ifadesini elde eder^15,16,17. Bununla birlikte, mevcut versiyonunda, bu yaklaşımın uygulanması karmaşıktır, çünkü kısmi ekssitasyon ve emisyon spektrumu çakışması ile altı floresan proteini (FP) ifade eden 12 farklı plazmidden oluşan eşitlikçi bir karışıma dayanır.

Burada sunulan, kortikal astrositleri ayırmaya yönelik güçlü ve geniş ölçüde aktif bir promotör tarafından yönlendirilen bütünleştirici muhabir yapıları kullanılarak utero elektroporasyon tabanlı çok renkli etiketleme yönteminde basittir¹⁴. Buna ek olarak, astrosit bölgesel hacmini ve arborizasyonunu segmentlere ayrıştırmak için hem lisanslı (örneğin, imaris) hem de açık erişim (Vaa3D^18,19,20)görüntü analizi yazılımı kullanılarak kolay bir görüntü analizi ardışık düzeni sağlanır. Daha önce açıklanan yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu strateji yalnızca ifadesi sitomegalovirüs arttırıcıdan oluşan sentetik bir CAG promotörü tarafından yönlendirilen sitoplazmik ve (isteğe bağlı olarak) nükleer hücre bölmesine yönlendirilen^1-2çok renkli bütünleştirici transgenes Multiaddressable Genom Bütünleştirici Renk İşaretçilerine (MAGIC Markers veya MM 21) dayanır, tavuk β-actin promotörü ve tavşan β-globin splice kabul sitesi²². Bu, embriyonikten doğum sonrası evrelere kadar kortikal astrositlerin etiketlenmesini ve izlenmesini sağlar, GFAP ekspresyasyonundan bağımsız^{olarak 14,23}. Bu transjenlerin her biri aşağıdaki dört farklı FP'yi taşır: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP ve tdTomato/mCherry, 1) Sıralı kanal alımı ile kolayca atlatılabilen minimal spektral çakışmayı gösterir; 2) Optimize edilmiş heyecan gücü ve toplama kazancı; ve 3) Dar FP emisyon pencerelerini toplamak için özel dikroik filtreler. MM stratejisi, hücresel bir popülasyonda FP'nin stokastik ifadesini yönlendirmek için kendiliğinden çıkarılabilir bir Cre rekombinaz (seCre) ile Cre /lox rekombinasyonunu kullanır. MM transgene'in tek bir kopyası FP'yi birbirini dışlayan bir şekilde ifade ederken, birden fazla transjen FP kombinasyonlarına yol açarak düzinelerce farklı ton oluşturur. Transgenes genomik entegrasyonu piggyBac (PB) veya Tol2 transpozisyon sistemi^24,25^,26tarafından tahrik edilir. Bu nedenle, rahim elektroporasyonunda, MM araç seti ve ürettiği çok renkli 'mozaik', birden fazla bitişik kortikal progenitörün aynı anda işaretlenmesini ve kortikal astrositler de dahil olmak üzere glial inişlerinin uzun süreler boyunca izlenmesini sağlar. PrA'nın konturunun farklı FP izin tanımlamasının ifade edilmesi ve daha sonra bölgesel hacimleri (IMARIS kullanılarak) ve karmaşık morfoloji (Vaa3D kullanılarak) hakkında önemli bilgiler çıkarılmasından kaynaklanan renk kontrastları. Burada ayrıntılı olarak sunulan çok renkli strateji, çeşitli gelişim aşamalarında vahşi tip farelerde kortikal astrosit yüzeyine ve morfolojisine hızlı ve kolay erişim sağlayan, transgenik muhabir çizgileri kullanmadan nörolojik hastalıkların fare modellerindeki astrosit anatomik özellikleri araştırmak için kolayca uyarlanabilen kullanışlı ve sağlam bir yöntemdir.

Protokol

Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri Charles Darwin hayvan deney etik kurulu (CEEACD/N°5) tarafından onaylanmıştır.

1. Utero elektroporasyonda MAGIC İşaretleyiciler için endotoksin içermeyen plazmidlerin hazırlanması

1. Bakteriyel dönüşüm
   1. Buz üzerinde, -70 °C'de depolanan DH5 alfa yetkin hücrelerini çözün.
   2. Uygun antibiyotiği (100 μg/mL ampisilin veya 50 μg/mL kanamycin) içeren agar plakalarını 37 °C'de ısıtın.
   3. 10 μL çözülmüş DH5 alfa yetkin hücrelerinde 1 μL 5–50 ng MAGIC Markers plazmid DNA ekleyin ve karıştırmadan 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın.
   4. Isı şoku dönüşümü için, aliquot'u 45 s için 42 ° C su banyosuna yerleştirin, ardından hemen buza yerleştirin ve 3-5 dakika bekleyin.
   5. Steril koşullar altında, 230 μL SOC ortamı ekleyin ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
   6. Aliquot içeriğini agar plakasının üzerine yayın ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yayın.
2. Plazmid kültürü
   1. Ertesi sabah, steril koşullar altında, agar plakasından bir koloni alın ve uygun antibiyotik ile 2 mL LB ortamı içeren 14 mL'lik bir tüpe koyun. 37 °C'de 300 rpm'de sallanan bir inkübatörde gün boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
   2. Günün sonunda, adım 1.2.1'den 2 mL başlangıç kültürünü kullanarak antibiyotikli 300 mL LB tohumu ve 300 rpm'de sallanan bir inkübatörde 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
3. Plazmid DNA hazırlığı
   1. Ertesi sabah, üreticinin protokolünü takip eden endotoksin içermeyen bir maxiprep kiti kullanarak MAGIC Markers plazmid DNA'sının (örneğin, PB-CAG-Cytbow ve Tol2-CAG-Nucbow'un yanı sıra PB ve Tol2 transposases ve Cre recombinase'yi ifade eden CAG tahrikli plazmidlerin) saflaştırılmasına devam edin.
   2. DNA'yı 200 μL steril suda elute edin ve -20 °C'de depolamadan önce bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonunu tahmin edin.

2. Utero elektroporasyonunda MAGIC İşaretçilerine Hazırlık (MM IUE)

1. Çözüm hazırlama
   1. Bir su banyosunda 37 °C'de % 0,9 tuzlu su çözeltisinin 30 mL'sini ısıtın ve ameliyat süresince sıcak tutun.
   2. PB-CAG-Cytbow ve Tol2-CAG-Nucbow içeren bir plazmid karışımı hazırlayın (son konsantrasyon, Her biri 0,8 μg/μL), PB ve Tol2 transposazları (son konsantrasyon, her biri 0,4 μg/μL), CAG-seCre (son konsantrasyon, 0,16 μg/μL) ve PBS'de Ca 2+ ve Mg^{2+ olmadan %0,01} Hızlı Yeşil boya.
      NOT: Astrosit anatomik rekonstrüksiyon amacıyla Tol2-CAG-Nucbow yapısı atlanabilir. Bununla birlikte, bu plazmid, yakından yan yana astrositlerin çiftlerini ayırt etmek ve astrositler arasındaki klonal ilişkileri araştırmak için MAGIC İşaretleyicileri kullanırken^{yararlıdır 14}.
   3. 2 mL salin çözeltisinde seyreltilmiş 100 μL ketamin (100 mg/mL) ve 100 μL ksilazin (20 mg/mL) içeren anestezik çözelti hazırlayın.
   4. Salin çözeltisinde 0.3 mg/mL buprenorfin stok çözeltisi 1:10 seyrelterek analjezik çözelti hazırlayın.
2. Ameliyat malzemesinin hazırlanması
   1. Cerrahi aletleri (bkz. Malzeme Tablosu)bir cam boncuk sterilizatör veya eşdeğerinde yüksek sıcaklıkta sterilize edin.
   2. 35 mm'lik bir çanağa bir damla elektrot jeli yerleştirin.
   3. Mikropipti mikroenjektör tutucusuna yerleştirin, mikropiptenin ucunu kırın ve DNA çözeltisini arzulayın.
   4. 1 μL'lik bir Hızlı Yeşil çözelti damlası yerleştirin (%0,01) 3 cm'lik bir kabın kapağında ve referans olarak kullanarak, ucunu ince asalarla kırarak mikropipette ucunun çapını ayarlayın. Basınç parametresini, eşdeğer boyuttaki damlaların mikroenjektör tarafından üretilecek şekilde ayarlayın, böylece enjeksiyon başına yaklaşık 1 μL DNA çözeltisi verilmesini sağlar.
3. Hamile dişi farenin hazırlanması
   1. RjOrl:SWISS hamile faresini tartın.
   2. Anestezik çözeltinin gram vücut ağırlığı (BW) başına 12,5 μL ile intraperitoneal enjeksiyon gerçekleştirin. 5 dakika bekleyin ve farenin parmak ucunu kıstırarak uyuduğunu doğrulayın.
   3. Hayvan sıkıştırmak için tepkisiz olduğunda, 1.6 μL / g BW analjezik çözelti ile deri altından enjekte edin.
   4. Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze bir damla oküler jel ekleyin ve hayvan göbeğini ısınma yastığına yerleştirin.
   5. Karnını hafifçe tıraş edin, iyotla ıslatılmış bir ped ile temizleyin ve tıraş edilen bölgeyi bir alkol pedi ile sterilize edin.
   6. Tıraş edilmiş, temizlenmiş ve sterilize edilmiş alanın etrafına steril kompresler yerleştirerek bir çalışma alanı düzenleyin.

3. Rahim elektroporasyonunda (İEÜ)

1. İntraventriküler enjeksiyon
   1. Karnın alt kısmından başlayarak, deriden ve daha sonra alttaki kastan başlayarak orta hat boyunca 2 cm dikey bir kesi kesin. Embriyonik torbaları nazikçe manipüle ederek rahim boynuzlarını açığa çıkarın ve serviksin yerini ve serviksin her iki tarafındaki embriyonik torbaların sayısını değerlendirin.
   2. E15.5 embriyosunun beynini, konumu serebral çatlaklar boyunca uzanan üç ana kan damarının birleştiği yerle eşleştiği için kolayca tanınan bregmayı görmek için elektroporasyona yönlendirin.
   3. Bregma (kafatasından görülebilir) ve göz arasında sanal bir çizgi düşünün; sanal hat ile boyuna fissür arasındaki mikropipleti tanıtın, ardından hedeflenen yarımkürenin lateral ventrikülünde 1 μL DNA çözeltisi sunmak için enjektörün ayak pedalını basın.
      NOT: Uygun yere enjekte edildiğinde, doldurulan lateral ventrikül mavi görünür ve dna çözeltisi ile doldurulduğunu gösterir.
2. Elektroporasyon
   1. Elektrotları uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu),daha önce elektrot jeline batırılmış, enjekte edilen embriyonun her iki tarafına enjekte edilen yarımküreyi kaplayan anot ile. Her biri 950 ms arayla ayrılmış 35 V'luk dört adet 50 ms darbe serisi sunmak için elektroporatörnün ayak pedalına basın.
   2. Embriyoyu ısıtılmış tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
      NOT: Tüm cerrahi operasyon sırasında embriyolar ısıtılmış tuzlu su çözeltisi kullanılarak nemli tutulmalı ve rahim kurumamalıdır.
   3. Her embriyo için 3.1.2–3.2.2 adımlarını tekrarlayın.
   4. Hedeflenen tüm embriyolar elektropore edildikten sonra, karındaki rahim boynuzlarını yavaşça torpidolarla orijinal konumlarına geri iterek değiştirin. Dikişler yapılırken rahmin kurumasını önlemek için karın boşluğunu ısıtılmış tuzlu su çözeltisi ile doldurun.
   5. Önce sürekli emilebilir bir dikişle karın kasını ve ardından 4-0 dikiş kullanarak birden fazla bireysel dikişli (~10) cildi kapatın.
   6. Hayvanı temiz bir kafese koyun, temiz bir kağıt havlunun üzerinde yan yatın ve uyanıp kendi kendine hareket etmeye başlayana kadar hayvanı her 5-10 dakikada bir diğer tarafa çevirin.
   7. Özellikle bir yuva yapılmışsa, ertesi gün hayvanın durumunu değerlendirin.
      NOT: Postürji tedavisine gerek yoktur. Bir yuvanın yokluğunda, herhangi bir ağrı belirtisi (örneğin, secde, tüylü kürk) ve / veya ağır kanama, hayvan gecikmeden ötenazi yapılmalıdır.

4. Doku toplama ve bölümleme

1. Doku toplama
   1. İstenilen hasat zamanında terminal anestezi için fenobarbital (100 mg/kg BW) intraperitoneal enjekte edin. Bu durumda, hasat süreleri P4, P7 ve P21 doğum sonrası (P) günlerindeydi.
   2. Soğuk prematüre paraformaldehit bazlı çözelti kullanarak intra kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
   3. Beyni parçalara ayrıştırın ve gece boyunca 4 °C'de postfixasyon için paraformaldehit bazlı çözeltiye yerleştirin.
2. Histoloji
   1. Ertesi sabah beyni 1x PBS ile 10 dakika boyunca 3x durulayın.
   2. Beyni 1x PBS'de çözünmüş% 3 agarose içine gömün.
   3. Titreşimli bıçak mikrotom kullanarak 80 μm kesitler kesin.
   4. Bölümleri 1x PBS ile önceden doldurulmuş 24 kuyu plakasında toplayın.
   5. Slayt ve kapak arasına montaj ortamına bölümler monte edin (bkz. Malzeme Tablosu). Optimum floresan protein koruması ve uzun süreli depolama için monte edilmiş slaytları -20 °C'de tutun.

5. Çok kanallı konfokal görüntüleme

1. Mikroskop ayarları
   1. Sırasıyla 440, 515 ve 559 nm lazer hatları kullanarak mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry'yi ayrı ayrı heyecanlandıracak şekilde konfokal mikroskop konfigürasyonunun ayarını ayarlayın.
   2. 20x 0,8 NA (veya daha yüksek NA) hedefi kullanın ve XY örneklemeyi ve Z-adım boyutunu Nyquist kriterlerine göre ayarlayın.
      NOT: Daha yüksek çözünürlük (örneğin, 60x 1.4 NA yağ hedefi) ve dekonvolüsyon algoritmaları ile elde edilen görüntüler, astrosit çardaklarının daha ince ayrıntılarının yeniden yapılandırılmasını sağlayacaktır. Bununla birlikte, deneyci en iyi astrosit işlemlerinin geleneksel optik görüntüleme ile çözülmeyebileceğini akılda tutmalıdır.
2. Görüntü edinme
   1. Elektroporlu bölgedeki en parlak astrositleri bulun.
   2. Yüzeye yakın bulunan etiketli hücreler dilimde daha derin olanlardan daha parlak görünebileceğinden, görüntülerin doygunluğunu önlemek için yüzey hücrelerindeki edinme ayarlarını yapın.
   3. Sıfır değeri mavi, maksimum piksel değerlerini kırmızı olarak görüntüleyen HiLo LUT'u kullanarak piksel doygunluğunu önlediğinden emin olurken, üç kanalın her biri için alım ayarlarını ayrı ayrı ayarlayın.
      NOT: Yeterince dengeli bir görüntü yalnızca birkaç mavi ve neredeyse hiç kırmızı piksel görüntülememelidir.
   4. Mikroskobun motorlu aşamasını kullanarak karolu 1.024 x 1.024 piksel Z yığınları elde edin, daha sonra elektroporlu alanın veya ilgi alanının mozaik rekonstrüksiyonlarını etkinleştirmek için bitişik yığınlar arasında% 10 örtüşme.

6. Astrosit bölgesel hacim segmentasyonu

NOT: Bu, ticari bir yazılım programı (örneğin, imaris) kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Veri kümesinin hazırlanması
   1. Etiketli astrositleri, tamamen görüntülenmiş doku bölümündeki hücreleri seçerek 3B rekonstrüksiyon (250 x 250 piksel) içinde kırpın.
      NOT: Kullanılan bilgisayar bunları işleyebiliyorsa, doğrudan daha büyük birimler üzerinde çalışmak da mümkündür.
   2. Her astrosit için yeni bir Yüzey oluşturmak üzere Geçmiş görünümünün Nesne araç çubuğundaki Mavi Yüzey düğmesini tıklatın.
   3. Daha iyi görselleştirme kontrastı elde etmek için, önce Düzenle | tıklayarak minimum ve maksimum renk kontrast değerlerini ayarlayın Görüntü Ayarlama seçeneğini gösterin ve her iki tutamacı da sürükleyin. Gerekirse, yeni bir renk seçmek için Görüntü Ayarı penceresinde doğrudan kanal adını tıklatarak kanal rengini değiştirin.
      NOT: Görsel sapmayı önlemek için tercihen her zaman aynı renkli ekranla çalışın.
   4. | Düzenle'ye tıklayın Mikrometrelerdeki voksel boyutunu manuel olarak belirtmek için Görüntü Özellikleri. Voksel boyutu doğru değilse, hacim hesaplamaları yanlış olacaktır.
   5. Yeni ayarları kaydedin.
2. Yüzey segmentasyonu
   1. Bir yüzey tanıtmak için Mavi Simge'yi kullanın. Sahne listesinde bir Yüzey simgesi ve kutusu görünecektir. Birim kutusu veri kümesini görmeye/gizlemeye izin verir.
   2. Yüzey çizgisini seçin ve Otomatik Oluşturmayı Atla | El ile Düzenle.
   3. Kontur | tıklayın Görünürlük ve Yok 'atıklayın. Ardından Seç görünümüne gidin ve Çiz düğmesine tıklayın.
   4. Çizim modunu seçmek için Mod'u tıklatın.
   5. Hızlı ve verimli Isoline yarı otomatik çizim aracını kullanın. Fare işaretçisini üzerine getirerek hücre anahattını tanımlayın. İzoline önizlemesi astrosit anahattıyla eşleşmiyorsa, fare işaretçisi konumunu ayarlayın. Önizlemeyi doğrulamak için seçimi sol tıklatın. Olası hataları düzeltmek için, Geçerli Z düzlemi konturlarını silmek için Pano penceresini kullanın veya Ctrl + Z tuşlarınabasın.
   6. Dilim | Kullanma Z-düzlemleri arasında gezinmek için konum, Z-düzlem numarasını değiştirerek bir sonraki düzleme hareket edin ve yeni bir kontur başlatın. Tercihen hücrenin ortasından başlayın ve sonra ekstremitelere geçin.
   7. Astrosit içeren tüm Z düzlemlerinde konturlar çizildiğinde, Yüzey Oluştur 'utıklatın. Yüzey oluşturmadan önce, tüm bileşenlerin bağlı olup olmadığını kontrol edin. Değilse, birim verilerini vermeden önce en büyükleri seçin veya ilgili olanları bağlayın.
   8. Veri Paneli'nde görüntülenen nicel verileri denetleyin ve istatistikleri elektronik tablo biçiminde dışa aktararak birim değerini ve birimini tasarruf edin.
   9. Yüzeye daha sonra erişmek için yeni bir adla kaydedin.

7. Astrosit arborizasyonunu izleme

NOT: Bu, açık erişim yazılım programı Vaa3D kullanılarak yapılır.

1. Veri kümesinin hazırlanması
   1. Görüntü yığınını yükleyin ve farklı renkler görüntüleyen yalıtılmış astrositleri veya yakındaki astrositleri arayın.
      NOT: Nesnel NA ve örnekleme artırılarak yeniden yapılandırmanın çözümü geliştirilebilir. Bununla birlikte, konfokal mikroskopinin çözünürlük sınırı nedeniyle, en iyi astrosit işlemleri doğru bir şekilde izlenemez. Elde edilen görüntülerin çözünürlüğünün ötesinde aşırıya kaçılmasını önlemeye özen göstermelisiniz.
   2. Fiji'yi kullanarak, her astrositin etrafına 250 x 250 piksel görüntü yığınlarını kırpin.
   3. Vaa3D izleme yalnızca bir renkte gerçekleştirilirken, bir kanal seçin ve diğer kanalları devre dışı bırakın.
   4. Görüntüyü RGB'ye dönüştürün ve .tiff biçimde kaydedin.
2. Arbor izleme
   1. RGB görüntüsünü Vaa3D'de açın. Resim | git Veri | Geometri daha sonra görüntü yeniden örneklemeve X/Y ve Z voxel boyut değerlerini ayarlayın.
      NOT: Astrosit çardakları yeniden yapılandırırken, görüntülerin sağladığı çözünürlükten daha ince ayrıntıları izlememeye dikkat edilmelidir.
   2. Görüntünün tamamı için Visualize | 3D görüntüleyiciyetıklayarak bir 3D pencere açın. Bir 3D görüntüye sağ tıklayın ve işaretleyici tanımlamak için 1 sağ tıklatmayıseçin. İmleçle astrositin ortasına gelin ve bir işaretleyici ayarlamak için sağ tıklatın.
      NOT: 3D görünüme tekrar erişmek için Escape'e tıklayın.
   3. Gelişmiş | 3D izleme | gidin Vaa3D-Neuron2-otomatik izleme.
   4. Yeni açılan pencerede, eklentinin uygulanacağı kanalı seçin.
   5. Bir arka plan eşiği seçin (genellikle 30 ile 90 arasında). Gerekirse bu değeri her astrosit için uyarla.
   6. Radius'un 2D'den işaretini kaldırın ve Otomatik aşağı örnekle ve otomatik yeniden örnekle işaretli tutun.
   7. cnn_type 3, length_thresh 1 ve SR_ratio 0,1 olarak ayarlayın.
   8. Tamam 'ı tıklatırktansonra, eklentinin otomatik olarak orijinal ada göre iki dosya oluşturduğundan emin olun. –ini.swc ve -coordinateX–coordinateY-coordinateZ-app2.swc soneki eklenecektir. Eklentiyi çalıştırmaya devam ederken üzerlerine yazmamak için bu ad dosyalarına el ile ayırt edici bir etiket ekleyin.
   9. Nesne Yöneticisi'neaçık , Neuron |'e gidin Çizgi yapısı, izlenen astrosit'i seçin, Görüntü Modu 'nutıklatın ve Her zaman satır modu 'nuseçin.
   10. Astrosit iskeletinin göründüğü 3B pencereye geri dönün.
       NOT: Segmentasyon ve sinyal eşleşmezse, 7.2.3–7.2.10 adımlarını yineleyin ve eş eşikleri eşleşene kadar ayarlayın. Eklenti yeniden başlatıldığında diğer parametreleri sıfırlandıklarında yeniden girdiğinizi unutmayın.
   11. İskelete sağ tıklayın ve ilk tercih nöron | satırı #1'i seçin... Yeni bir pencerede görünecek nicel ölçümlere erişmek APP2_Tracing Yüzey| Nesne Ek Açıklaması.
       NOT: Işık mikroskopisinin sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, listelenen öğelerin altında görüntülenen ölçümler Dal sayısı ve Çatallanma sayısı, astrosit çardak karmaşıklığının sadece kaba bir tahminini sağlar.

Sonuçlar

Embriyonik kortikal progenitörlerde MAGIC İşaretleyicilerin elektroporasyonu, astrositlerin serebral korteks gelişiminin erken ve geç aşamalarından itibaren etiketlenmesini sağlar (Şekil 1). Bu astrositler tüm kortikal katmanlarda çeşitli postnatal evrelerde (P4, P7, P21) bulundu ve tüm serebral kortekse geniş bir şekilde dağıldılar. 20x 0.8 NA (veya daha yüksek NA) hedefiyle elde edilen ve Z-stack rekonstrüksiyonları olarak monte edilen karo konfokal görüntülerle de?...

Tartışmalar

Kortikal progenitörlerdeki MAGIC Marker'ların utero elektroporasyonunda (İEÜ) (Şekil 1) doğum sonrası serebral korteks boyunca astrositlerin farklı postnatal aşamalarda etiketlenmesini sağladı (P4-P7-P21, Şekil 2). İlginçtir ki, E13.5'ten E15.5'e gerçekleştirilen elektroporasyon kortikal astrositler¹⁴ile ilgili benzer etiketleme desenleri verdiğinden, İEÜ'nün aşaması kritik değildir. Bununla birlikte, etiketli piram...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1 Bacteria transformation
Ampicillin	Euromedex	EU0400-C
DH5 alpha competent cells	Fisher Scientitic	11563117
Ice box	Dutscher	139959
Kanamycin	Sigma	60615
LB Agar	Sigma	L2897
SOC medium	Fisher Scientitic	11563117
Sterile petri dish- 10 cm	Thermo Fisher	150350
Water bath	VWR	462-0556H
1.2 Plasmid culture
14 ml culture tube	Dutscher	187262
Glass erlenmeyer- 2L	Fisher Scientitic	11383454
LB medium	Sigma	L3522
1.3 Plasmid DNA preparation
NucleoBond Xtra Maxi Plus EF	Macherey-Nagel	740426.10
2.1 Preparation of the solutions
26 G x 1/2 needle	Terumo	8AN2613R1
30 G x 1/2 needle	Terumo	8AN3013R1
Fast Green	Sigma Aldrich	F7272
NaCl	VWR	27810.295
Single-use polypropylene syringe, 1 mL	Dutscher	50002
2.2 Preparation of the surgery material
Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm	FST	11617-12
Arched tip Forceps- 10 cm	FST	11071-10
Glass bead sterilizer Steri 250	Sigma	Z378569
Glass micropipette 1 mm diameter	FHC	10-10-L
Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm	FST	11651-10
Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm	FST	11650-10
Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm	FST	14060-09
Laboratory tape	Fisher Scientitic	11730454
Microinjector	INJECT+MATIC	No catalog number
Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm	FST	12002-12
Optical fiber	VWR	631-1806
Plastic-coated white paper	Distrimed	700103
Signagel electrode gel	Free-Med	15-60
Sterile Petri dish- 35 mm	Dutscher	056714
Sterilizer, glass dry bead, Steri 250	Sigma	Z378569
2.3 Preparation of the pregnant female mouse
Alcohol pad	Alcomed	1731000
Buprecare	Axience	0.3 mg/ml
Compress	tRAFFIN	70189
Ketamine	Merial	Imalgene 1000
Ocular gel	tvm lab	Ocry-gel
RjOrl:SWISS mice	Janvier Labs
Vetadine, 10% solution	Vetoquinol	4337400113B
Warming pad	Harvard Apparatus	72-0493
Xylazine	Bayer	Rompun 2%
3.2 Electroporation
Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse	Novosyn	C0068220
Electroporateur Sonidel	Sonidel	NEPA 21
Sterile transfer pipets (individually wrapped)	Dutscher	043202S
Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes	Sonidel	CUY650P3
4.1 Tissue harvesting and sectioning
24-well plate	Falcon	353047
Agarose	Lonza	50004
Antigenfix	Microm Microtech	U/P0014
Coverslip	Dutscher	100266
Dolethal	Vetoquinol	DOL202
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	11540486
Nail polish	EMS	72180
Slide	Dutscher	100001
Vectashield	Vectorlabs	H-1000
Vibratome	Leica	VT1000S
5. Multichannel confocal imaging
20X oil NA 0.85	Olympus
Confocal Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss	LSM880
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus	FV1000
Plan Apochromat 20x/0.8 M27	Carl Zeiss
6. Astrocyte territorial volume segmentation
IMARIS 8.3 and later versions	Bitplane
7. Astrocyte arborization tracing
3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D)	HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science