JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Özet

Sunulan prosedürler, söz konusu sivrisinek popülasyonunda enfeksiyon oranını, yayılan enfeksiyonu ve virüsün potansiyel bulaşma oranını belirlemek için laboratuvar koşullarında Aedes aegypti sivrisineklerini Zika virüsü ile enfekte etmek için genelleştirilmiş bir metodolojiyi açıklamamaktadır. Bu prosedürler, küresel olarak vektör yeterliliği değerlendirmelerinde çeşitli değişikliklerle yaygın olarak kullanılmaktadır. Belirli bir sivrisinin (türler, popülasyon, birey) belirli bir ajanın iletiminde oynayabileceği potansiyel rolü belirlemede önemlidirler.

Giriş

Vektör yeterliliği, sivrisinek, kene veya flebotomin kum sineği gibi belirli bir eklembacaklının tür, popülasyon ve hatta bir birey düzeyinde, eklembacaklıda çoğaltma veya geliştirme ile biyolojik olarak bir ajan edinme ve iletme yeteneği olarak tanımlanır1,2. Sivrisinekler ve eklembacaklı kaynaklı virüsler (yani arbovirüsler) ile ilgili olarak, ajan dişi bir sivrisinek tarafından viremik bir konakçıdan imbibed edilir. Yutulduktan sonra, virüs küçük bir midgut epitel hücre popülasyonu3, sindirim enzimleri tarafından proteolitik bozulma, mikrobiyotanın varlığı (midgut enfeksiyon bariyeri veya MIB) ve salgılanan peritrofik matris gibi çeşitli fizyolojik engellerin üstesinden gelmelidir. Midgut epitelinin enfeksiyonu, virüsün replikasyonu ve midgut'tan sivrisineklerin açık dolaşım sistemine veya midgut kaçış bariyerinin (MEB) üstesinden gelen yaygın bir enfeksiyonun başlangıcını temsil eden hemolimf'e nihai kaçış ile takip edilmelidir. Bu noktada virüs ikincil dokuların (örneğin, sinirler, kaslar ve yağ organları) enfeksiyonlarını oluşturabilir ve çoğalmaya devam edebilir, ancak bu tür ikincil replikasyon, virüsün tükürük bezlerinin acınar hücrelerini enfekte etmesi için kesinlikle gerekli olmayabilir (tükürük bezi enfeksiyon bariyerinin üstesinden gelmek). Tükürük bezi acinar hücrelerinden apikal boşluklarına dökülür ve daha sonra tükürük kanalına hareket etmek, virüsün ısırma sırasında sonraki konaklara aşısını sağlar ve iletim döngüsünü 1 ,2,4,5,6,7tamamlar.

Bir sivrisinek vektörü içinde bu iyi karakterize edilmiş ve genel olarak korunmuş yayılma mekanizması göz önüne alındığında, protokollerdeki farklılıklar mevcut olmasına rağmen, laboratuvar vektör yetkinlik değerlendirmeleri genellikle metodolojik olarak benzerdir1,2. Genellikle, oral virüse maruz kaldıktan sonra, sivrisinekler, midgut, bacaklar, yumurtalıklar veya tükürük bezleri gibi bireysel dokuların viral enfeksiyon, yaygın enfeksiyon, yaygın enfeksiyon / potansiyel transovariyal bulaşma ve yaygın enfeksiyon / potansiyel bulaşma yeterliliği için sırasıyla8olarak test edilebilmesi için parçalara ayrılırken. Bununla birlikte, tükürük bezlerinde sadece bir virüsün varlığı, bazı vektör / virüs kombinasyonlarında tükürük bezi kaçış / çıkış bariyerinin (SGEB) kanıtı göz önünealındığında,bulaşma kabiliyetinin kesin kanıtı değildir1,2,4 ,5,7,9. Bulaşma yetkinliğini kanıtlamak için standart yöntem, hassas bir hayvana sivrisinek iletimi olmaya devam etmektedir10,11,12. Bununla birlikte, birçok arbovirüs için bunun immün sistemi baskılanmış murine modellerinin kullanılmasını gerektirdiği göz önüne alındığında13,14,15,16, bu yöntem genellikle maliyet-yasaklayıcıdır. Yaygın olarak kullanılan bir alternatif, sırasıyla viral genomun veya enfeksiyöz parçacıkların varlığını göstermek için ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) veya bulaşıcı bir test ile analiz edilebilen sivrisinek tükürüğünün toplanmasıdır. Bu tür in vitro tükürük toplama yöntemlerinin12'yi abartabileceğini veya in vivo besleme sırasında biriken virüs miktarını17'yi hafife alabileceğini belirtmek gerekir, bu da bu verilerin dikkatli bir şekilde yorumlanması gerektiğini gösterir. Bununla birlikte, in vitro yöntemi tükürükteki sadece virüs varlığı açısından analiz edildiğinde, bulaşma potansiyelini gösteren oldukça değerlidir.

Arboviral hastalık salgınlarında sivrisinek vektörlerinin rolünü belirlemek için iki ana yaklaşım vardır. İlk yöntem, sivrisineklerin aktif bulaşma 18 , 19 , 20 ,21,22,23,24bağlamında toplandığı saha gözetimini içerir. Bununla birlikte, enfeksiyon oranlarının tipik olarak oldukça düşük olduğu göz önüne alındığında (örneğin, Amerika Birleşik Devletleri'nde aktif Zika virüsü (ZIKV) dolaşımı alanlarında sivrisineklerin tahmini%0.061enfeksiyon oranı 21 ), potansiyel vektör türlerinin suçlanması, metodoloji25,26 ve rastgele şans (örneğin, enfekte olmayan 1.600 kişiden bir enfekte bireyi örneklemek) tarafından ağır bir şekilde önyargılı olabilir21 . Bunu dikkate alarak, belirli bir çalışma, bulaşmada yer alan sivrisinekleri doğru bir şekilde örneklemek için hem ham sayılarda hem de tür çeşitliliğinde yeterli sivrisinek elde etmeyebilir. Buna karşılık, vektör yeterlilik analizleri laboratuvar ortamında gerçekleştirilen ve oral doz gibi parametrelerin sıkı bir şekilde kontroline olanak sağlar. Sivrisinek enfeksiyonunun gerçek karmaşıklığını ve bulaşma yeteneğini bir alan ortamında tam olarak temsil edemese de, bu laboratuvar değerlendirmeleri arboviroloji alanında güçlü araçlar olmaya devam etmektedir.

Çeşitli sivrisinek türlerinde, popülasyonlarında ve yöntemlerinde ZIKV ile yapılan çeşitli vektör yetkinlik analizlerine dayanarak27,28,29,30,31,32, ve vektör yeterlilik değerlendirmelerinin yakın tarihli bir incelemesi1, burada tipik bir vektör yeterlilik iş akışı ile ilişkili protokollerin birkaçını açıklıyoruz. Bu deneylerde, Amerika'dan üç Ae. aegypti popülasyonu (Salvador şehri, Brezilya; Dominik Cumhuriyeti; ve aşağı Rio Grande Vadisi, TX, ABD) yapay kan lekeleri yoluyla 4, 5 veya 6 kütük 10 odak oluşturan ünitelerde (FFU)/mL dozlarında tek bir ZIKV (Mex1-7, GenBank Katılım: KX247632.1) türüne maruz kaldı. Daha sonra, diseksiyon ve hücre kültürüne dayalı bulaşıcı bir tahlil yoluyla çeşitli dış inkübasyon zamanlarından (2, 4, 7, 10 ve 14 gün) sonra enfeksiyon, yaygın enfeksiyon ve bulaşma yeterliliği kanıtları için analiz edildiler. Mevcut iş akışı/protokoller ZIKV için optimize edilmiş olsa da, birçok öğe eklembacaklı muhafaza ve biyogüvenlik düzeyleri 2 ve 3'teki (ACL/BSL2 veya ACL/BSL3) diğer sivrisinek kaynaklı arbovirüslere doğrudan çevrilebilir.

Protokol

Bu protokollerde gerçekleştirilen tüm işlemler, Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi ve Galveston Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere tam uyumlu olarak gerçekleştirildi.

1. Vero hücrelerinde ZIKV'nin amplify

  1. Dulbecco'nun Eagle'ın minimum esansiyel ortamını (DMEM) %10 v/v ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin (100 U/mL ve 100 μg/mL) ile birlikte modifikasyonunda Vero hücrelerini (CCL-81 veya VeroE6) büyütün, sırasıyla) 150 cm 2 doku kültürü şişesinde %5 CO2 ila %80−90 arasında izdihat içeren nemlendirilmiş37 °C inkübatörde.
  2. Bir biyogüvenlik kabininde (BSC), ortamı çıkarın ve% 10 çamaşır suyuna veya çift kuaterner amonyumun(Malzeme Masası)çalışma seyreltilmesine atın. Monolayer'ı hücre başına 0,1−1 enfeksiyöz viral parçacığı hedefleyen 1 mL viral stokla hemen aşıleyin. Şişeyi hemen ajite edin, böylece inoculum monolayer ile bütünüyle temas eder.
  3. %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak ortamı 5 mL hacme kadar yükseltin. Daha sonra şişeyi 60 dakika boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatöre hareket ettirin.
  4. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve bir BSC'ye getirin. %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak toplam 15 mL hacme ek ortam ekleyin. Şişeyi % 5 CO2ile nemlendirilmiş 37 °C inkübatöre taşıyın.
  5. Sitopatik etkilerin (CPE) kanıtı için faz kontrastı mikroskopisi altında şişeyi günlük olarak inceleyin. Hücrelerin sadece yaklaşık % 40−50'si monolayerde kaldığında viral hasada (adım 1.7) devam edin, genellikle kullanılan ZIKV suşuna bağlı olarak 3−5 gün postinfection.
  6. Süpernatantı aspire edin ve 50 mL konik şişeye yerleştirin. Hücresel kalıntıların üst kısmını santrifüjleme ile netleştirin (20 dakika boyunca 3.500 x g).
    NOT: Birden fazla şişe aynı şekilde enfekte olmuşsa, birden fazla şişeden gelen süpernatantlar 50 mL konik tüplerde birleştirilebilir.
  7. Peleti bozmamaya dikkat ederek, süpernatantı 50 mL konik tüpten yeni bir tüpe çıkarın. Süpernatantı ısı inaktive FBS ile %30 (v/v) son konsantrasyona tamamlar. Bu karışımı ayrı vidalı kapak tüplerine aliquotlayın ve kullanıma kadar -80 °C'de dondurun.

2. Yapay kana susamlarının hazırlanması

  1. Sivrisineklerin enfeksiyöz kan değerlerine maruz kalacakları gün, bir eklembacaklı muhafaza tesisinde, besleme ünitelerinin (MalzemeMasası ) sivrisinekler maruz kalmaya hazır hale geldiğinde öncedenısıtılacağışekilde güç kaynağını ( Malzeme Masası ) açın.
  2. Aşağıda açıklanan yöntemlerden birini kullanarak yapay kan metrinleri hazırlayın.
    1. Yöntem 1: Ticari olarak 1:1 v/v satın alınan taze hasat edilmiş (bir hafta içinde) sitratlanmış veya heparinize insan kanlarını viral stokla birleştirin (bölüm 1'de açıklandığı gibi hazırlanmıştır).
      NOT: Bu yöntem, kanda bulunan virüs/virüs ailesine karşı herhangi bir antikor bulunmamasına bağlı.
    2. Antikor yokluğu doğrulanamazsa veya kan kaynağının önceden flavivirüs maruziyeti olduğu biliniyorsa, eritrositleri yıkayın ve manuel olarak paketleyin.
      1. Bir BSC'de, 50 mL konik bir tüpe 30 mL tam insan kanı ekleyin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 50 mL'ye kadar üst üste yerleştirin.
      2. 20 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüj.
      3. Süpernatantı, %10 çamaşır suyu içeren bir tepsi tavasına hafifçe dökerek veya eritrosit peletini atmamaya özenerek çift kuaterner amonyumun seyreltilmesiyle aspire edin.
      4. 10 mL PBS ekleyin ve konik tüpün altına BSC'nin altına hafifçe dokunun, böylece eritrosit pelet yeniden inşa edilmiştir. PBS ile süspansiyonun hacmini 50 mL'ye kadar getirin. Nazik bir ters çevirme ile karıştırın.
      5. 2.2.2.1−2.2.2.4 adımlarını toplam 4−6x tekrarlayın. Süpernatant'ın açık veya sadece hafif pembe olduğunu ve artık opak olmadığını onaylayın. Serolojik pipet kullanarak tüm süpernatant çıkarın. Eritrosit peletini 1−2 mL PBS'de yeniden dirildi.
      6. Kan mumunu birleştirin: 350 μL paketlenmiş eritrosit, %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanılarak 100 μL%10 sakkaroz, 200 μL ısı inaktive FBS, 900 μM rekombinant ATP ve 2 mL uygun şekilde seyreltilmiş virüs stoğu.
  3. Enfekte olmayan bir farenin derisiyle standart bir 3 mL rezervuar ünitesini(Malzeme Masası)kapla (diğer seçenekler parafin filmi, kollajenli membranlar veya sosis muhafazası içerir).
  4. Kapalı rezervuarı beyaz kağıt havlulara yerleştirin. Rezervuara bir seferde 1 mL ~2 mL enfeksiyöz kan unu ekleyin. Besleyicinin altındaki havluyu sızıntı belirtisi olup olmadığını kontrol edin. Sızıntılar varsa, kan unu besleyicilerden kurtarın ve kapakları atın. Besleyicileri fişlerle kapatın. Sızıntı olmadığını bir kez daha onaylayın.

3. Kan tahlili/plak testinin backtitration

  1. Hazırlanan kan mumunun kalan hacmini kullanarak, %2 v/v ısı inaktive FBS ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanarak 10x seri seyreltme serisi (yani seyreltilmiş 10x ila 1.000.000x arasında değişen 6 seyreltme) gerçekleştirin.
  2. 24 veya 12 kuyu plakasının kuyularına seyreltmelerin Aliquot 100 μL'si en seyreltilmişten en konsantreye kadar.
  3. 37 °C, %5 CO2 inkübatörde 1 saat kuluçkaya yatırın.
  4. 1 saat kuluçka süresinin sonunda, plakaları BSC'ye geri getirin ve buna bağlı olarak 24 kuyu veya 12 kuyu plakasına 1 mL veya 2 mL metilselüloz kaplama ekleyin.
  5. Kaplamalı plakaları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre geri yerleştirin ve 3−7 gün boyunca kuluçkaya yatır (virüs suşuna bağlı).
  6. Kuluçkadan sonra plakaları inkübatörden çıkarın ve BSC'ye getirin. Metilselüloz kaplamayı% 10 çamaşır suyu veya çift kuaterner amonyum dezenfektan içeren bir tepsi tavasına atın.
  7. Her kuyuyu PBS ile 2x yıkayın, yıkamayı% 10 çamaşır suyu veya çift kuaterner amonyum içeren bir tepsi tavasına atın.
  8. ~1 mL metanol ekleyin:aseton (1:1 v:v) ve hücrelerin oda sıcaklığında (RT) BSC'de en az 30 dakika boyunca plakaya sabitlenebilmesine izin verin. Organik atıklar konusunda kurumsal politikaya göre metanol:aseton atın.
  9. Zikv'i aşağıda açıklanan iki yöntemden birini kullanarak görselleştirin.
    1. Metanol:asetonun çıkarılmasını takiben, 5 dakika boyunca kristal mor çözeltisi (%30 metanolde% 0.25 w / v) ile hemen leke. Musluk suyunda 2x durulayın ve kurumaya bırakın, ardından plakların veya monolayerin tahrip olduğuna dair kanıt için doğrudan gözle görselleştirin.
    2. Alternatif olarak, odak oluşturma tahlillerini gerçekleştirin.
      1. Organik fiksatif kalmayana kadar plakaların kurumasını bekleyin.
        NOT: Bu, BSC'nin dışında ~2−3 saat sürmelidir, ancak bir BSC veya kimyasal duman kaputunda hava kurutarak hızlandırılabilir.
      2. Her kuyuya 3x'i 15 dakika boyunca her biri bir yörünge plakası rocker'ında nonsterile PBS (Mg2+ ve Ca2+ free) ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 1 mL engelleme çözeltisi (PBS + % 3 FBS) ekleyin ve RT'de 15 dakika boyunca kayan.
      3. Blokaj çözeltisinde 1:2.000 seyreltmede kuyu başına 100 μL α-ZIKV veya α-flavivirüs primer antikoru (örneğin, flavivirüs grubu hibridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) ekleyin. RT'de en az 4 saat (tercihen gece boyunca, 18 saati geçmemek üzere) sallanarak kuluçkaya yatırın.
      4. Birincil antikoru çıkarın ve yörünge plakası rocker üzerinde PBS (Mg2+ ve Ca2+ serbest) ile her biri 15 dakika boyunca 3x yıkayın.
      5. Blokaj tamponunda 1:2.000 seyreltilmiş ikincil antikorun kuyusu başına 100 μL (keçi α fare HRP etiketli) ekleyin. RT'de 1 saat sallanarak kuluçkaya yaslanın.
      6. Yörüngesel plaka rocker üzerinde PBS (Mg2+ ve Ca2+ free) ile her biri 15 dakika boyunca 3x yıkayın.
      7. Kuyu başına Aliquot 100 μL substrat geliştirme reaktifi (Malzeme Tablosu). 15 dakika boyunca RT'de kaya plakaları.
      8. Substratı çıkararak ve plakaları musluk suyuyla 2 kat durulayarak odak/plakların gelişmesi üzerine reaksiyonu durdurun. Musluk suyunu dökün ve ölçülmeden önce plakaların havayla kurumasını bekleyin.
      9. Verilen örnekte bulunan FFU sayısını belirlemek için viral odakları sayın.

4. Kan metrilerinin yönetimi

  1. Eklozyondan 2−4 gün sonra Ae. aegypti sivrisineklerini kullanın. Dişi sivrisinekleri taranmış kapaklı 0,5 L karton kartonlar halinde sıralayın ve şekerden mahrum edin (genellikle bulaşıcı kan unu öncesinde 36−48 saat). Suya doymuş pamuk topları ile reklam libitum suyu sağlayın.
  2. Sivrisineklerin bulaşıcı kan emiciye maruz kalacağı sabah su doymuş pamuk toplarını çıkarın.
  3. Yapay kan metrinleri içeren rezervuarları, temiz bir plastik torpido gözü içindeki besleme ünitesi uçlarına takın.
  4. Torpido gözünde, rezervuara bağlı besleme ünitesinin altına 50−100 aç Ae. aegypti sivrisinek içeren, ekranlı kapaklı 0,5 L karton bir karton yerleştirin.
    NOT: Uygun şekilde aç sivrisinekler genellikle 20 dakika içinde beslenir. Besleme, daha yavaş popülasyonlarda örnek boyutunu artırmak için gerektiği gibi uzatılabilir, ancak bu 60 dakikadan fazla uzanmamalıdır, çünkü (ZIKV) viral titre besleyici içinde ~ 60 dakika sonra azalabilir.
  5. Besleme tamamlandıktan sonra, rezervuarı çıkarın ve taze yapılmış% 10 çamaşır suyuna daldının.
  6. Sivrisinekleri -20 °C'de 30 s veya buzdolabında 5 dakika kuluçka ile uyuşturmak.
  7. Torpido gözünde, sivrisinekleri buz üzerinde bir Petri kabına dökün. Engorged dişileri kategorize edilmemiş sivrisineklerden sayın ve sıralayın. Kategorize edilmemiş sivrisinekleri% 70 etanol ile dolu 50 mL tüp konik bir tüpe daldırarak atın. Sivrisinekler hala uyuşturulurken, onları 0.5 L karton kartona geri dökün ve ekran ve kapakla hızla örtün. Fazla ekran örgüsünü kartondan kesin ve ağı bantla sabitleyin.
  8. Her kartonun ekranına steril filtrelenmiş% 10 sulu sakkaroz ile doymuş bir pamuk topu ekleyin. Nemi korumak için tüm sivrisinek kartonlarını nemli bir süngerle büyük bir plastik ikincil kaba yerleştirin.
  9. Sivrisinek kartonları içeren ikincil kabı, %80 ± %10 bağıl nem ve 16:8 ışık:karanlık döngü ile 27 ± 1 °C sıcaklıkta (veya ilgi çekici bölgedeki koşulları simüle etmek için uygun olan) bir inkübatöre yerleştirin. Deneyler tamamlanana kadar sivrisinekleri% 10 sakkaroza ad libitum erişimi ile koruyun.

5. Örnek alma ve işleme

  1. Besleme sonrası belirtilen günlerde, bir torpido gözünde mekanik bir aspiratör kullanarak uygun kartonlardan önceden belirlenmiş sayıda sivrisinek aspire edin. Gerekli sayıda sivrisinek elde edildikten sonra toplama tüpünü pamuklu bir yuvarlakla kapla.
  2. Sivrisinekleri -20 °C'de 30 saniye veya 4 °C'de 5 dakika kuluçka ile uyuşturmak.
  3. Torpido gözünde, sivrisinekleri buz üzerinde bir Petri kabına dökün. İki çift toparlama kullanarak, her sivrisineğin altı bacağının altısını da çıkarın ve DMEM'den oluşan sterilize edilmiş paslanmaz çelik bilyalı rulman (7/32") ve 500 μL sivrisinek toplama ortamı (MCM) içeren prelabeled 2 mL yuvarlak alt mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, %2 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve 2,5 μg/mL amfoterisin.
  4. Sivrisinekleri dizginlemek için bir damla mineral yağın üzerine hafifçe yerleştirin, yağ ile sivrisinek başı ve hortumu arasında herhangi bir temasa izin vermemeye dikkat edin.
  5. Sivrisinek hortumunu 10 μL ısı inaktif FBS ile dolu 10 μL pipet ucuna yerleştirin.
    NOT: Alternatif olarak, pipet sakkaroz, kan veya mineral yağ ile doldurulabilir. Yağ, hafif mikroskopi ile tükürük kabarcıklarının doğrudan görselleştirilmesini sağlar.
  6. Sivrisinek 30 dakika tükürük izin verin. FBS + tükürük içeren mikropipette ucunu 100 μL MCM içeren bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarın, ardından karkası sterilize edilmiş çelik bilyalı yatak ve 500 μL MCM içeren ayrı bir 2 mL yuvarlak alt mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Vücutlar, bacaklar ve tükürük için kullanılan tüplerin etiketli olduğundan emin olun, böylece üç numunenin de aynı sivrisinekten kaynaklandığı açıktır.
  7. Sivrisinekler tükürürken, kalan sivrisinekler üzerinde 5.3−5.5 adımlarını gerçekleştirin.
  8. Gövdeleri ve bacakları içeren tüpleri BSC içinde bulunan boncuk frezeleme dokusu homojenizasyon cihazına taşıyın. Viral parçacıkları süpernatanta serbest bırakmak için tüm vücut ve bacak örneklerini 5 dakika boyunca 26 Hz'de üçe katla. Hücresel kalıntıları peletmek için 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile tüm örnekleri netleştirin.
    NOT: Bu noktada, numuneler -80 °C'de dondurulabilir veya hemen test edilebilir.

6. ZIKV'nin enfeksiyöz test ile tespiti

  1. Bir BSC'de, enfeksiyöz test başlangıcından önce 24 saat önce Vero hücreleri (kuyu başına10 5 hücre) ile 24 kuyu doku kültürü plakası hazırlayın. Her bir kuyuyu tek bir sivrisinek / örnek kimliği ile etiketleyin.
  2. Numuneler -80 °C'de dondurulduysa, çözülmesine izin verin.
  3. Numunelerle aşılamadan önce ortamı Vero hücre plakalarından birer birer çıkarın.
  4. Vücutlar veya bacaklar içeren örnekler için, her kuyuya dikkatlice 100 μL netleştirilmiş süpernatant aliquot, peletten sivrisinek hücresi kalıntılarını rahatsız etmemeye dikkat edin.
    NOT: Tükürük örnekleri, gerekirse daha sonraki titrasyon için numuneleri korumak için hücrelere aşılamadan önce MCM ile 1:1 (v/v) seyreltilebilir.
  5. Plakaları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre alın ve 1 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Plakaları BSC'ye geri döndürün ve her kuyuya ~1 mL metilselüloz kaplama ekleyin. Kaplama plakalarını 37 °C, %5 CO2 inkübatöre geri yerleştirin ve 3−7 gün boyunca kuluçkaya yatırın (virüs/gerinime bağlı).
  7. 3.6−3.9 adımlarında açıklandığı gibi sabitleme ve görselleştirme gerçekleştirin.
  8. Bir odak oluşturma testi ile puanlama ile ilgili olarak, hafif bir mikroskop altında muayene ile pozitif kuyuları ölçün. Bir kuyudaki hücrelerin intrasitoplazmik lekelemesinin tespiti virüsün varlığını gösterir. Örnekler yalnızca odak pozitif veya -negatif olarak puanlanır.

Sonuçlar

Amerika'dan Ae. aegypti'nin üç nüfusu (Salvador, Brezilya; Dominik Cumhuriyeti; ve Rio Grande Vadisi, TX, ABD), yıkanmış bir insan eritrosit bazlı yapay kana sunakta sunulan bir dizi kan memesi (4, 5 ve 6 kütük 10 FFU/mL) üzerinde Amerika'dan (ZIKV Mex1-7, Chiapas State, Mexico, 2015) zikv salgınına maruz kaldı. 2, 4, 7, 10 ve 14 postenfection günlerinde, sivrisineklerin alt kümeleri enfeksiyon, yayılma ve potansiyel bulaşma oranlarını belirlemek için işlendi.

Tartışmalar

Burada açıklanan yöntemler vektör yetkinlik analizleri yapmak için genelleştirilmiş bir iş akışı sağlar. Genel bir çerçeve olarak, bu metodolojilerin çoğu literatür boyunca korunmaktadır. Ancak, değişiklikler için önemli bir alan vardır (Azar ve Weaver1'deincelenmiştir). Virüs (örneğin, viral soy, meydan okuma virüsünün depolanması, viral geçiş geçmişi), entomoloji (örneğin, sivrisinek popülasyonlarının laboratuvar kolonizasyonu, doğuştan gelen bağışık...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Dünya Gelişmekte Olan Virüsler ve Arbovirüsler Referans Merkezi (WRCEVA) personelini kabul ediyoruz: Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton ve Divya Mirchandani, bizim ve diğer grupların vektör yeterlilik deneyleri için kullanılan viral suşların birçoğunun küratörlüğünde ve sağlanmasında yorulmak bilmeyen çalışmalarından dolayı. Sunulan çalışma McLaughlin Burs Fonu (SRA) tarafından finanse edildi ve NIH AI120942 ve AI121452 hibeleri verdi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3mL Standard ReservoirR37P30Hemotek LtdInsectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls4RJH9GraingerGrinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/CaseA16-P4FisherScientificFixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell cultureA6419-1GMilliporeSigmaReagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15MAB10216MilliporeSigmaPrimary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle5450-0011KPL/SeracareSecondary Antibody for focus forming assay
BleachNC0427256FisherScientificDecontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 5010-126-34FisherScientificCell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning07-200-740FisherScientificCell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning07-200-91FisherScientificCell culture consumable
Crystal VioletC0775-100GMilliporeSigmaStain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case05-402-7FisherScientificPlastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes14-959-70CFisherScientificPlastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes14-959-49AFisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case13-675-20FisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case13-675-15BFisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case13-675-30FisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case13-675-22FisherScientificPlastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes08-772BFisherScientificPlastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mLS11150Atlanta BiologicalsCell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides12-550-A3FisherScientificImmobilization of Mosquitos
FU1 FeederFU1-0Hemotek LtdInsectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles140-040-182FisherScientificCell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle15-290-026Fisher ScientificCell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case15-140-163FisherScientificCell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles25-200-114FisherScientificCell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles11-965-118FisherScientificCell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit7203706LampireBloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator2809BBioquipInsectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/CaseA412-4FisherScientificFixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/BottleM0512-250GMilliporeSigmaCell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant DetergentC849T34Thomas ScientificDecontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biologyM5904-5X5MLMilliporeSigmaImmobilization of Mosquitos
O-ringsOR37-25Hemotek LtdInsectary Equipment
Plastic PlugsPP5-250Hemotek LtdInsectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V)PS6120Hemotek LtdInsectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points4525BioquipInsectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case50-809-242FisherScientificPlastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology84097-250GMilliporeSigmaReagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case21-402-487FisherScientificPlastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case21-402-486FisherScientificPlastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case21-402-484FisherScientificPlastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case21-402-482FisherScientificPlastic consumable
TissueLyser II85300QIAGENHomogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL5510-0030SeracareDeveloping solution for focus forming assay
VeroCCL-81American Type Culture CollectionMammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]CRL-1586American Type Culture CollectionMammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

Referanslar

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867 (2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102 (2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346 (2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462 (2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661 (2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072 (2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434 (2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 159sivrisinekvekt r yeterlili iAedesAedes aegyptiarbovir sZika

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır