JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada utero elektroporasyon kullanarak embriyonik gelincik beyin genetik manipülasyon gerçekleştirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem in vivo neokorteks nöral progenitor hücrelerinin hedeflemesine olanak sağlar.

Özet

Embriyonik gelişim sırasında in vivo gen ekspresyonunun manipülasyonu, memeli gelişimi sırasında tek tek genlerin rolünü analiz ederken tercih edilen yöntemdir. Rahim elektroporasyonu nda in vivo embriyonik memeli beyninde gen ekspresyonunun manipülasyonu için önemli bir tekniktir. Gelincik lerin embriyonik neokorteksinin rahim elektroporasyonunda küçük bir etobur için bir protokol burada sunulmuştur. Gelincik giderek neokorteks gelişimi için bir model olarak kullanılıyor, çünkü neokorteks, insan ve insan olmayan primatlarda da bulunan bir dizi anatomik, histolojik, hücresel ve moleküler özellikler sergiliyor, ancak fare veya sıçan gibi kemirgen modellerinde bulunmamaktadır. Uteros elektroporasyon da embriyonik gün yapıldı (E) 33, gelincik bir midnörogenez evresi. Rahim elektroporasyon beynin lateral ventrikülleri astar nöral progenitor hücreleri hedefler. Nörogenez sırasında, Bu progenitor hücreleri diğer tüm nöral hücre tiplerine yol açar. Bu çalışma, sırasıyla rahim elektroporasyonundan 4, 9 ve 24 gün sonrasına karşılık gelen E37, doğum sonrası gün (P) 1 ve P16'da temsili sonuçlar ve analizler göstermektedir. Daha önceki aşamalarda, hedeflenen hücrelerin soyundan çeşitli nöral progenitor alt tipleri esas oluşur, daha sonraki aşamalarında en etiketli hücreler postmitotik nöronlar ise. Böylece, rahim elektroporasyon nöral hücrelerin çeşitli hücresel ve moleküler özellikleri üzerinde genetik manipülasyon etkisi çalışma sağlar. Çeşitli hücre popülasyonları üzerindeki etkisi sayesinde, rahim elektroporasyon da gelincik neokorteks histolojik ve anatomik özellikleri manipülasyon için kullanılabilir. Daha da önemlisi, tüm bu etkiler akut ve kullanıcı tarafından belirlenen bir spatiotemporal özgüllük ile gerçekleştirilir.

Giriş

Neokorteks memeli serebrum dış levha ve yüksek bilişsel fonksiyonların koltuk1,2,3,4,5. Embriyonik gelişim sırasında memeli neokorteks in vivo akut genetik manipülasyon elde etmek için, iki farklı yöntem araştırılmıştır: viral enfeksiyon6 ve rahim elektroporasyon7. Her iki yöntem de neokortikal hücrelerin etkin hedeflemesine izin verir, ancak bazı sınırlamalardan muzdariptir. Viral enfeksiyona göre rahim elektroporasyonunun en büyük avantajı, elektrik alanının yönünü düzenleyerek elde edilen neokorteks içinde mekansal özgüllük elde edebilme yeteneğidir.

Elektroporasyon ilk in vitro8hücrelerine DNA girişini kolaylaştırmak için gösterildiğinden beri, in vivo çeşitli omurgalılar içine DNA teslim etmek için uygulanmıştır. Gelişimsel nörobilimde, fare neokorteks rahim elektroporasyonunda ilk olarak 2001 yılında bildirilmiştir9,10. Bu yöntem embriyonik beynin lateral ventrikül DNA karışımı bir enjeksiyon ve mekansal hassasiyet7sağlar cızırtıcı elektrotlar kullanarak elektrik alanının sonraki uygulama oluşur 7,11. Utero elektroporasyon beri fare neokorteks endojen veya ektonik eklenen genlerin ekspresyonu işlemek için nükleik asitler sunmak için uygulanmıştır. Son zamanlarda CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme metodolojisi uygulanarak fare neokorteksinde rahim elektroporasyonu ile (1) postmitotik nöronlarda12,,13 ve nöral progenitor hücrelerde 14 ve (2) genom15 ve epigenom16 düzenlemesi(1)gen bozulması gerçekleştirilmiştir.

Çok kısa bir süre sonra fare ilk rapor, rahim elektroporasyon embriyonik sıçan neokorteks uygulandı17,18. Olmayan kemirgenler gelincik rahim elektroporasyonunda ilk kadar bir meydan okuma kaldı, küçük bir etobur, rapor edildi 201219,20. O zamandan beri, gelincik rahim elektroporasyonu nda nöral progenitors ve nöronlar20etiketleyerek neokorteks geliştirme mekanizmaları çalışmak için uygulanmıştır20 ,21,22,23, CRISPR/ Cas9 teknolojisinin kullanımı da dahil olmak üzere endojen genlerin ekspresyonu manipüle24, ve ektopik genler teslim ederek21,22,25, insana özgü genler dahil olmak üzere26.22 Ayrıca, gelincik rahim elektroporasyonu patolojik koşullarda insan neokorteks gelişiminin özellikleri ele kullanılmıştır27,28.

Neokorteks gelişimi bağlamında, gelincikleri farelere göre model organizma olarak kullanmanın avantajları, gelinciklerin bir dizi insanbenzeri özelliği daha iyi özetlemesi gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Anatomik düzeyde, gelincik kortikal katlama karakteristik bir desen sergilemek, aynı zamanda insan ve diğer primatlar mevcut, ama tamamen fareler veya sıçanlarda yok4,29,30,31. Histolojik düzeyde gelincik iki farklı subventriküler germinal bölgeleri var, iç ve dış subventriküler bölgeler olarak anılacaktır (ISVZ ve OSVZ, sırasıyla)32,33, iç lif tabakası ile ayrılmış23. Bu özellikler aynı zamanda primatlarla da paylaşılır, insanlar da dahil olmak üzere, ancak fareler34ile değil. Gelincikve insanlarda ISVZ ve OSVZ bol nöral progenitor hücreleri ile doldurulur, sıçanların subventriküler zonu ise (SVZ) sadece seyrek nöral progenitors21,,32,35,36içerir . Hücresel düzeyde, gelincikler bazal veya dış radyal glia olarak adlandırılan nöral progenitors bir alt tip yüksek oranda sergilemek (bRG veya oRG, sırasıyla), hangi memeli neokorteks evrimsel genişleme için araç olarak kabul edilir34,37,38. bRG bu nedenle son derece fetal insan ve embriyonik gelincik neokorteks bol, ama embriyonik fare neokorteksçoknadirdir35 ,36. Ayrıca, gelincik bRG morfolojik heterojenite insan bRG benzer gösterir, çok fare bRG21üstün . Son olarak, moleküler düzeyde, gelişmekte olan gelincik neokorteks gen ekspresyonu desenleri son derece fetal insan neokorteks benzer gösterir, hangi kortikal katlama gelişimini kontrol etmek için tahmin edilmektedir, diğer şeyler arasında39.

Gelincik bRG hücre biyolojik ve moleküler özellikleri onları son derece çoğaltıcı hale, insan bRG benzer. Bu nöronların artan bir üretim ve genişletilmiş ve son derece karmaşık neokorteks gelişimi ile sonuçlanır34. Bu özellikler, gelincikleri farelerde modellenemez neokorteks gelişiminin insanbenzeri özelliklerini incelemek için mükemmel model organizmalar yapmak26,40. Gelincikmodel organizma olarak tam olarak yararlanmak için sunulan yöntem geliştirilmiştir. Bu her yerde organizatörü kontrolü altında bir plazmid ifade GFP ile E33 gelincik embriyolarının rahim elektroporasyonu oluşur (pGFP) her yerde organizatörü, CAG. Elektroporated embriyolar daha sonra embriyonik veya postnatal olarak analiz edilebilir. Kurban edilen hayvan sayısını azaltmak için, dişi gelincikler (jills) histerektomi ile sterilize edilir ve evcil hayvan olarak evlat edinilme için bağışlanır. Hedeflenen embriyolar embriyonik evrelerde hasat edilirse ikinci bir ameliyat yapılır ve embriyolar sezaryenle çıkarılır, jilller ise histerektomi edilir. Hedeflenen embriyolar doğum sonrası evrelerde analiz edilirse, yavrular bezlendikten veya kurban edildikten sonra jilller histerektomi edilir. Bu nedenle, jills histerektomi için bir protokol de sunulmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Landesdirektion Sachsen (lisanslar TVV 2/2015 ve TVV 21/2017) tarafından onaylandıktan sonra Alman Hayvan Refahı Mevzuatı ile uyum içinde gerçekleştirilmiştir.

1. Rahim elektroporasyonuna hazırlık

  1. DNA karışımını hazırlayın. Bu protokolde 1 μg/μL pGFP son konsantrasyonu kullanılır. PBS'de DNA'yı çözün ve görselleştirmeyi kolaylaştırmak için %0,1 Hızlı Yeşil ile tamamlayın. Hazırlandıktan sonra, birkaç kez yukarı ve aşağı boru lama veya parmak dokunarak DNA karışımı karıştırın. Kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
    NOT: Koelektroporasyonlar için DNA karışımı, PBS'de seyreltilmiş 0.5 g/μL pGFP ile birlikte ilgi genini kodlayan 1 μg/μL plazmid konsantrasyonunu içerecek şekilde hazırlanır.
  2. Gerekli tüm araç ve gereçlerle ameliyat masasını hazırlayın.
  3. Mikropipet çekmecesini kullanarak cam kılcal damarları çekin. Daha önce açıklandığı gibi41forceps kullanarak kapiller distal kısmını keserek kapiller ucun çapını ayarlayın.

2. Gelinciklerin ameliyata hazırlanması

  1. Kusma riskini azaltmak için ameliyattan önce en az 3 saat oruç E33 de embriyoile hamile jills tutun.
  2. Ameliyattan önce otoklavlama ile tüm araçları sterilize. Olası kontaminasyon kaynaklarını ortadan kaldırmak için ameliyatı aseptik koşullarda özel olarak atanmış bir odada gerçekleştirin.
  3. % 4 isoflurane ile narkoz kutusuna hamile jill yerleştirin.
  4. Anestezi yapıldığında gelinciği bir ısı yastığı ile operasyon masasına yerleştirin ve narkoz maskesini buruna sabit bir %2-3 isofluran akışı ile takın. Anestezinin uygun düzeyde olmasını sağlamak için, aşağıdaki reflekslerin eksikliğini kontrol edin:
    1. Perioküler cilde dokunarak palpebral refleks
    2. Her iki arka ekstremitenin2 ve3'ü arasında veya3 ve4'üncü ayak parmaklarını sıkıştırarak fleksör refleks
    3. Palpebral refleks yoksa ve fleksör refleks açıkça azalır, her arka ekstremite bir ayak çimdikleme tarafından ağrı refleks kontrol edin.
      NOT: Gerekirse kalp hızını ve ritmi izlemek için elinizde bir stetoskop olduğundan emin olun.
  5. Gelinciği analjezik (0.1 mL metamizol, 50 mg/kg vücut ağırlığı), antibiyotik (0.1 mL/kg vücut ağırlığı 20 mg/kg amoksisilin + klavulanik asit) ve glikoz (10 mL%5 glikoz çözeltisi) ile enjekte edin.
  6. Cerrahi işlem sırasında göz dehidratasyonönlemek için gözlere göz merhem çözeltisi bir damla yerleştirin.
  7. Bir tıraş kullanarak gelincik göbek tıraş.
  8. Cildi su ve sabunla temizleyin, göbeği %70 etanol fırçalayın, 2x iyotla dezenfekte edin ve kurumasına izin verin.

3. Gelinciklerin rahim elektroporasyonunda

  1. Cerrahi alanın steril olduğundan emin olun: steril dokuların üzerine steril cerrahi aletler yerleştirin ve palto ve eldivenleri değiştirin.
  2. Hayvanın üzerine steril bir cerrahi örtü yerleştirin.
  3. Bir neşter kullanarak, cerrahi bir ~ 5 cm uzunluğunda kesim ile linea alba de göbek açın.
  4. Makas kullanarak kas tabakasını kesin.
  5. Kesi bölgesinin etrafına gazlı bez leri yerleştirin ve PBS ile ıslayın. Gazlı bez ler ameliyat sırasında eklenecek ek PBS absorbe edecektir.
    NOT: Ameliyat boyunca ısı ve PBS desteğini koruyun.
  6. Gelincik uterusunu ortaya çıkar ve gazlı bezlerin üzerine yerleştirin.
  7. Uzun yükleme ucu olan bir pipet kullanarak enjeksiyon çözeltisi ile cam bir kılcal yükleyin. Yükleme hacminin embriyo sayısına ve farklı deneysel koşulların sayısına bağlı olarak yaklaşık 5-20 μL arasında olduğundan emin olun. Embriyo başına ortalama enjekte edilen hacim 3-5 μL'dir. Yüklü cam kılcal damarı bir tutucuya takın ve tutucunun diğer tarafını bir tüpe ve ağızlıklara bağlayın.
  8. İlk embriyoyu inceleyin ve kafayı bulun.
  9. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için fiber optik ışık kaynağını embriyonun başının yanına yerleştirin.
    NOT: Gelincik rahim duvarları çok karanlıktır ve ışık doğrudan üzerlerine parlatmadığı sürece içlerini görmek zordur.
  10. Serebral hemisferlerden birinin ventriküliçine tek bir intraventriküler enjeksiyon gerçekleştirin ve bir iç kontrol olarak hizmet etmek için diğer yarımküre bozulmamış tutun. Ventrikül kendisi göz tarafından kolayca farklı değildir, bu yüzden konumu pigmentli iris konumuna göre tahmin edilir, hangi görünür. İntraventriküler enjeksiyon cam kılcal bağlı tutucu alarak ve cam kılcal ucu ile deri, kafatası ve serebral doku nüfuz tarafından yapılır.
    NOT: Murine plasentadan daha koyu plasentaya zarar vermemeye dikkat edin.
    1. Cam kılcal damarın ucu ventrikülde yken, cam kılcal damar tutucuya bağlı ağızlık kullanarak ağız borusu ile enjeksiyon çözeltisinin yaklaşık 3-5 l'sini enjekte edin. Enjekte edilen çözelti %0.1 Fast Green içerdiğinden, enjekte edilen ventrikül şimdi koyu yeşile dönecek ve böbrek şeklinde bir yapı olarak görülecektir.
  11. Bu izleyici elektrotları embriyonun başının üzerine yerleştirin, böylece pozitif kutbu hedeflenecek alanın üzerine ve negatif kutup enjekte edilen alanın altına yerleştirilir.
  12. Elektroporatörde aşağıdaki elektroporasyon koşullarını ayarlayın: Darbe uzunluğu = 50 ms; Darbe gerilimi = 100 V; Nabız aralığı = 1 s; Bakliyat sayısı = 5. Daha sonra elektroporatörün üzerindeki "Pulse" düğmesine basın.
  13. Hızlı bir şekilde elektroporated embriyo sıcak 1x PBS birkaç damla bırakın.
  14. Tüm embriyolar için prosedürü tekrarlayın. Sıcak PBS ile rahim sürekli ıslak tutun.
    NOT: Vajinaya bakan ilk embriyolara kolayca ulaşılamazsa, elektroporate olmamak en iyisidir.
  15. Tüm embriyolar elektroporated olduğunda, periton boşluğuna rahim geri yerleştirin.
  16. 4-0 sütür kullanarak periton ile kas tabakası dikiş.
  17. Aynı kalınlığı kullanarak cildi dikiş ve alüminyum sprey ile yara sprey.
  18. Bir kafese hayvan yerleştirin ve bir ısı kaynağı ile sıcak tutmak. Uyanana kadar hayvanı dikkatlice izleyin.

4. Hedeflenen hayvanların ameliyat sonrası bakımı ve barınması

  1. Ameliyattan sonraki 3 gün boyunca hayvanların aşağıdaki postoperatif bakımdan geçirilmesini sağlayın: Günde 20 mg/kg amoksisilin (antibiyotik) 1x; 25 mg/kg metamizol (analjezik) 3x günlük.
  2. Gelinciklerin ayrı ayrı barındırdığından emin olun.
  3. Gelincikler günde en az 1x bir veteriner tarafından incelendiğinden emin olun.
  4. Gelinciklerin teslimat sırasında mümkün olduğunca az rahatsız olduğundan emin olun.
  5. Yavrular kesildikten veya kurban edildikten sonra, jillleri histerektomiye hazırlayın.

5. Gelincik histerektomi

NOT: Sterilize edilmiş hayvanların evcil hayvan olarak evlat edinilmelerine başverilmesi için kurban edilen hayvan sayısını azaltmak için histerektomi yapılır. Histerektomi için ameliyat öncesi işlem 2.

  1. 3.1 ve 3.2 adımlarında açıklandığı gibi gelincik göbeğini tıraş edin ve sterilize edin.
  2. Cerrahi linea alba de göbek açın. Kas tabakasını kes. Kas tabakasını kaldırın ve kas tabakasını tamamen açarken bir parmakla bağırsağı koruyun.
  3. Kesi bölgesinin etrafına gazlı bez leri yerleştirin ve steril PBS ile ıslayın. Gelincik rahim ve yumurtalıklar maruz ve gazlı bez bezleri üzerine yerleştirin.
  4. Mezovar arteria ovarica ve vena ovarica kranial ligating tarafından bir tarafta histerektomi başlayın. Ligasyonun her iki tarafına bir kelepçe koyun ve kelepçelere başka bir ligasyon kranial gerçekleştirin. Onları kurtarmak için ligasyon ucunda üçüncü kelepçe takın. Diğer tarafta tekrarlayın.
  5. Kelepçeler arasında kesin ve her iki tarafta mezenter gelen cornua rahim ayırmak.
  6. Ostium uteri için her iki rahim tarafında kaudal arteria uterina ligate. Sonra vajinali ve ligature düzeltmek. Onları kurtarmak için ligasyonların ucunda kelepçe takın. Ligatura iki kelepçe koyun. Kelepçeler arasında kesilmiş ve vajinadan rahim ayırmak. Rahim ve yumurtalıkları çıkarın ve onları atın. Rahim poposundan kalan mukozayı kazıyın.
  7. Kalan tüm kıskaçları ayırın ve bağ uçlarını kısaltın. Kelepçeler çıkarıldıktan sonra kanamayı kontrol edin.
  8. 3.16 ve 3.17 adımlarında açıklandığı gibi kas tabakasını ve deriyi dikin. 3.18 ve 4.1-4.3 adımlarında olduğu gibi postoperatif protokolü izleyin. Düzenli veteriner ziyaretleri ile en az 2 hafta hayvan tesisinde hayvanları tutun. Hayvanlar tamamen kurtarıldıktan sonra evlat edinilebilirler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

E33'teki gelinciklerin rahim elektroporasyonunda, embriyonik neokorteksin ventriküler yüzeyini kaplayan nöral progenitör hücrelerinin hedefalınmasıylasonuçlanmıştır ( Şekil 1 ). Bu hücreler apikal atalar denir ve son derece çoğalan, geliştirme sırasında diğer tüm hücre tipleri neden. Asimetrik bölünme üzerine, apikal atalar başka bir apikal ata ve daha farklı bir hücre, genellikle bir bazal ata (BP), ventrikül yüzeyinden delaminated üretti. BP'ler ikincil germin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Rahim elektroporasyonunda gelincik diğer yöntemlere göre avantajları ve dezavantajları olan önemli bir tekniktir. Bu yöntemin kritik adımları ve sınırlamalarının yanı sıra olası değişiklikler ve gelecekteki uygulamaları da göz önünde bulundurabiliriz.

Victor Borrell ve elektroporasyon veya viral enjeksiyon yoluyla postnatal gelincik neokorteks genetik manipülasyon meslektaşlarının öncü çalışma beri35,42

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Max Planck Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetiği Enstitüsü'nün hizmet ve tesislerine, özellikle de gelinciklerin mükemmel yetiştiriciliği için Biyomedikal hizmetleri (BMS) tüm ekibi ve J. Peychl ve Işık Mikroskobu Tesisi ekibine verilen olağanüstü destek için müteşekkiriz. BmS'ten Katrin Reppe ve Anna Pfeffer'a istisnai veteriner desteği ve Huttner grubundan Lei Xing'e gelincik ameliyatlarına yardımcı oldukları için minnettarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1ml syringeBD309628Electroporation
4-0 Vicryl sutureEthiconV392ZGSurgery
Aluminium spraycp-pharma98017Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)WDT6301Surgery
Cappilary holderWPIMPH6S12Electroporation
Dexpanthenol Ointment solutionBayer6029009.00.00Surgery
Drape sheet 45x75cmHartmann2513052Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mmBTX45-0489Electroporation
ElectroporatorBTXECM830Electroporation
Fast GreenSigmaF7258-25GElectroporation
Ferret Mustela putorius furoMarshallNAExperimental organism
Fiber optic light sourceOlympusKL1500LCDElectroporation
ForcepsAllgaier instrumente08-033-130Surgery
Forceps 3C-SARubis Tech3C-SASurgery
Forceps 55Dumostar11295-51Surgery
Forceps 5-SARubis Tech5-SASurgery
Gauze swabs largeHartmann401723Surgery
Gauze swabs smallHartmann401721Surgery
GFAP antibodyDakoZ0334Antibody
GFP antibodyAves labsGFP1020Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length)Sutter InstrumentBF120-69-10Electroporation
GlucoseBela-pharmK4011-02Surgery
Heat padHans DinslageSanitas SHK18Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml)Meda997437Surgery
IsofluranCP21311Surgery
Loading tips 20µlEppendorf#5242 956.003Electroporation
MetamizolWDT99012Surgery
Metzenbaum dissecting scissorsAesculapBC600RSurgery
Micropipette pullerSutter InstrumentModel P-97Electroporation
pCAGGS-GFPNANAFrom Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibodyMilliporeCBL407Antibody
pH3 antibodyAbcamab10543Antibody
ScalpelAesculap294200104Surgery
ShaverBraunEP100Surgery
Sox2 antibodyR+D SystemsAF2018Antibody
Surgical clamp 13cmWDT27080Surgery
Surgical double spoon (Williger)WDT27232Surgery
Surgical drapeWDT28800Surgery
Surgical scissors smallFST14090-09Surgery
Suturing needle holderAesculapBM149RSurgery
Tbr2 antibodyAbcamab23345Antibody
Transfer pipette 3mlFischer scientific13439108Surgery
Water bathJulaboTW2Surgery

Referanslar

  1. Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
  2. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
  3. Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
  4. Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  5. Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
  6. Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
  8. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584(2014).
  13. Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611(2016).
  14. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  15. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  16. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  17. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  18. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).
  19. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24(2012).
  20. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  21. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
  22. Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812(2016).
  23. Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
  24. Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
  25. Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285(2017).
  26. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241(2018).
  27. Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370(2015).
  28. Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
  29. Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
  30. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
  31. Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
  32. Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
  33. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
  34. Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
  35. Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  36. Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
  37. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  38. Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
  39. De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
  40. Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
  41. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).
  42. Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
  43. Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
  44. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  45. Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276(2018).
  46. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 159rahim elektroporasyonundagelincikneokorteks geli imin ral progenitor h crelerigenetik manip lasyonin vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır