Kanser Farmakolojisi Araştırmaları için PDX ve PDX Türevli Organoidlerin Eşleştirilmiş In vivo/In vitro Hasta Kaynaklı Model Çiftlerinin Oluşturulması

Özet

İn vitro tarama için hasta kaynaklı ksinograftlar (PDX) kullanılarak organoidler oluşturmak için bir yöntem açıklanmıştır, bu da eşleşen in vivo/in vitro model çiftleri ile sonuçlanır. PDX tümörleri mekanik veya enzmatik olarak küçük parçalara ayrıldı/işlendi, ardından Clevers'in orijinal PDX'e karşı pas geçen, kriyoprezerserve edilen ve karakterize edilen tümör organoidlerini yetiştirme yöntemi izlendi.

Özet

Hasta kaynaklı tümör ksinograftları (PDX'ler), büyük ölçüde geleneksel kanser ilacı değerlendirmesi için kanser kök hücreleri (CSC) tarafından yönlendirildiğine inanılan en tahmine dayalı preklinik modeller olarak kabul edilir. Büyük bir PDX kütüphanesi hasta popülasyonlarının çeşitliliğini yansıtır ve böylece nüfusa dayalı preklinik çalışmalara olanak tanır ("Faz II benzeri fare klinik çalışmaları"); ancak, PDX düşük aktarım hızı, yüksek maliyetler ve uzun süre pratik sınırlamalara sahiptir. Aynı zamanda hasta kaynaklı CSC güdümlü modeller olan tümör organoidleri, büyük organoid veya bileşik kütüphaneleriyle başa çıkmak için belirli PDX sınırlamalarının üstesinden gelen PDX'in in vitro eşdeğeri olarak kabul edilebilir. Bu çalışma, PDX türevi organoidler (PDXO) oluşturmak için bir yöntem açıklar, böylece in vitro ve in vivo farmakoloji araştırmaları için eşleştirilmiş modeller elde edilir. Deri altı nakledilen PDX-CR2110 tümörleri tümör taşıyan farelerden, tümörler onaylanmış bir otopsi prosedürü başına 200-800 mm³'e ulaştığında, ardından bitişik tümör dışı dokuların çıkarılması ve küçük tümör parçalarına ayrışması toplanmıştır. Küçük tümör parçaları yıkandı ve enkazı gidermek için 100 μm hücre süzgecinden geçirildi. Hücre kümeleri bodrum membran özü (BME) çözeltisinde toplanıp askıya alındı ve CO 2 inkübatörde büyümek için çevreleyen sıvı ortama sahip katı bir damlacık olarak₆ kuyulu bir plakaya kaplandı. Organoid büyümesi ışık mikroskopisi altında haftada iki kez izlendi ve fotoğrafla kaydedildi, ardından haftada 2 veya 3 kez sıvı orta değişim izlendi. Yetiştirilen organoidler, tripin ilavesi ve 10 μM Y-27632 ilavesi ile birlikte mekanik kesme kullanarak BME gömülü organoidleri bozarak 1:2 oranında daha fazla geçiş yaptı (7 gün sonra). Organoidler, bme'den santrifüjleme ile serbest bırakıldıktan sonra uzun süreli depolama için kriyo tüplerde kriyopreziteserv edildi ve ayrıca daha fazla karakterizasyon için örneklendi (örneğin, DNA, RNA ve FFPE bloğu).

Giriş

Kanserler çeşitli genetik ve immünolojik bozuklukların bir koleksiyonudur. Etkili tedavilerin başarılı gelişimi, klinik sonuçları etkili bir şekilde öngören deneysel modellere oldukça bağlıdır. İyi karakterize hasta kaynaklı ksinograftların (PDX) büyük kütüphaneleri, uzun zamandır, hasta tümör özelliklerini, heterojenliği ve hasta ilaç yanıtını¹yeniden yakalama yetenekleri nedeniyle kemoterapi ve / veya hedefli tedavileri test etmek için tercih edilen çevirisel in vivo sistemi olarak görmektedir, böylece Faz II benzeri fare klinik çalışmalarının klinik başarıyı iyileştirmesini sağlar^2,3. PDX'ler genellikle hücre hattı türetilmiş ksinograftların aksine genetik stabiliteye sahip kanser kök hücre hastalıkları olarak kabul edilir². Son birkaç on yılda, dünya çapında büyük PDX koleksiyonları oluşturuldu ve bugün kanser ilacı geliştirmenin atı haline geldi. Yaygın olarak kullanılmasına ve büyük çeviri değerine sahip olmasına rağmen, bu hayvan modelleri özünde maliyetli, zaman alıcı ve düşük verime sahiptir, bu nedenle büyük ölçekli tarama için yetersizdir. PDX ayrıca bağışıklıktan zarar gören bir doğa nedeniyle immün-onkoloji (GÇ) testi için istenmeyen⁴. Bu nedenle, mevcut büyük PDX kütüphanesinden tam olarak yararlanmak pratik değildir.

Hans Clevers'in laboratuvarı⁵tarafından öncülük edilen son keşifler, epitel kökenli çoğu insan organında yetişkin kök hücrelerden üretilen organoidlerin in vitro kültürlerinin kurulmasına yol açmıştır⁵. Bu protokoller, çeşitli endikasyonların insan karsinomlarında varsayılan CSC'lerden organoidlerin büyümesine izin vermek için daha da rafine edilmiştir^6,7. Bu hasta kaynaklı organoidler (PDO' lar) genomik olarak stabil^8,9'dur ve klinik tedavi sonuçları 10 , 11^,12'yioldukça tahmin ettiği gösterilmiştir. Ek olarak, PDO'ların in vitro doğası yüksek verimli tarama (HTS)¹³, böylece potansiyel olarak in vivo modellere göre bir avantaj sunar ve hasta popülasyonunun bir vekili olarak büyük organoid kütüphanelerinden yararlanır. PDO'lar, yukarıda açıklanan PDX'lerin birçok sınırlamasının üstesinden gelerek önemli bir keşif ve çeviri platformu olmaya hazırdır.

Hem PDO hem de PDX, terapötikleri kişiselleştirilmiş tedavi veya klinik çalışma formatı bağlamında değerlendirme yeteneğine sahip hasta kaynaklı ve CSC odaklı modellerdir. Bu nedenle,^{14, 15, 16, 17}>3000 PDX'lerin tescilli koleksiyonu gibi mevcut büyük PDX kütüphaneleri, tümör organoidlerinin (PDX türevli organoidler veya PDXO) kütüphanelerinin hızlı üretimi için uygundur ve bu da eşleştirilmiş PDX ve PDXO modellerinin eşleştirilmiş bir kütüphanesiyle sonuçlanır. Bu rapor, kolorektal kanser PDXO-CR2110'u ebeveyn PDX-CR2110 model¹⁶ile ilgili olarak oluşturma ve karakterize etme prosedürünü açıklar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Çalışmaların yürütülmesinden önce, hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili tüm protokoller ve değişiklikler veya prosedürler Crown Bioscience Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Hayvanların bakımı ve kullanımı, AAALAC (Laboratuvar Hayvan Bakımını Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği) Uluslararası kılavuzlarına uygun olarak, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi, Ulusal Araştırma Konseyi (2011) tarafından bildirildiği şekilde gerçekleştirilmesidir. Tüm hayvan deneysel prosedürleri SPF (spesifik patojen içermeyen) tesislerinde steril koşullar altındaydı ve farklı devlet kurumlarından (örneğin, Ulusal Sağlık Enstitüleri) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na sıkı sıkıya uygun olarak yürütüldü. Protokoller, tesis kurumunda (örneğin kurumsal IACUC Komitesi) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Tümör nakline hazırlık

1. Hayvan konutları
   1. Bireysel havalandırmalı kafeslerde, 20-26 °C'de, %30-70 nemde ve 12 saat ışık/12 saat karanlık bir aydınlatma döngüsünde, mısır koçani yataklarının haftalık olarak değiştiği ve ışınlama sterilize edilmiş kuru granül yiyeceklerin yanı sıra steril içme suyu ad libitum'da Ev Balb /c çıplak fareler (n=5).
2. Donör tümör parçası hazırlama
   1. Vücut ağırlığı (BW, tartım dengesi ile) ve tümör hacmi (TV, kaliper ölçümü ile) için tümör taşıyan donör fareleri yakından izleyin.
   2. TV 800-1000 mm³'e ulaştığında, tümör taşıyan hayvanları biyolojik tehlike başlığında ötenazi edin.
      1. Fareleri odaya CO₂ gazı veren bir kapaklı bir ötenazi odasına yerleştirin. Gazı, hayvana minimum sıkıntı ile hızlı bilinçsizlik üreten bir akış hızında odaya boşaltın. CO₂ için optimum akış hızı 2-2,5 Lpm civarındadır.
      2. Hayvanların bilincinin yerine gelmediğini gözlemleyerek ötenaziyi sağlayın.
      3. Belirgin klinik ölümden sonra, bir hayvanın iyileşme olasılığını en aza indirmek için gaz akışını >1 dakika koruyun.
   3. İodofor sürüntüleri kullanarak tümörün etrafındaki cildi sterilize edin. Bitişik tümör dışı dokuları çıkararak ve ötanaziden önce önceden soğutulmuş (4 °C) 20 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirerek tümörleri toplayın.
   4. Kan bileşenlerini çıkarmak için tümörleri PBS ile başka bir Petri kabında yıkayın, ardından ikiye bölün ve ekstra deri, kan damarları, kireçlenme ve / veya nekrozu çıkarın.
   5. Transplantasyon için ayrı bir hayvan odasına taşınmadan önce, sadece sağlam tümör parçalarını 20 mL PBS'li steril 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.

2. Deri altı tümör büyümesi

1. Tümör parçasının immün sistemi baskılanmış farelere deri altı aşısı
   1. PDX tümörlerini neşterle 2 mm parçalara ayırın ve her biri deri altı (SC) implantasyonu için trokarlara yerleştirin.
   2. Alıcı hayvanları% 5 izofluran ile uyuşturun (% 1'de bir burun konisi tarafından korunur). Hayvanlar rahatlar, sağ reflekslerini kaybederler ve sonunda acıya cevap vermeyene kadar hareketsiz hale gelir. Uyuşturulmış fareleri sağ yanal konumda bir deney tahtasına sabitlayın ve iodofor sürüntü örnekleriyle, özellikle tümör aşı bölgesini çevreleyen alanlarla sterilize edin.
   3. Sol kanat derisinde kalçaya sadece kranial, neşterle 0,5 cm'lik bir kesi yapın ve künt forseps kullanarak cildin altında ön ayak gücüne doğru 2-3 cm'lik bir tünel oluşturun.
   4. Aseptik olarak, aşılama bölgesi başına bir tümör parçası küpünü ortamdan aktarın ve deri altı tünelinin derinliklere yerleştirin. Yara klipsleriyle yaranın kapanmasından önce parçanın konumunu görsel olarak onaylayın.
   5. Sternal recumbence korumak için bilinçli hale gelene kadar tümör implante farelerini (5) izleyin ve ancak anesteziden tamamen iyileştikten sonra kafeslerine geri verin.
2. Tümör taşıyan farelerin sağlık takibi
   1. Günlük su ve gıda tüketimini kontrol edin ve haftalık vücut ağırlığını kaydedin.
   2. Rutin izleme sırasında fareleri kontrol edin. Hareketlilik, nefes alma, tımar ve genel görünüm, gıda ve su tüketimi, BW kazanç / kaybı, assitler vb.
   3. Tv'yi kaliper kullanarak haftada iki kez ölçün ve her biri mm³ ile ifade edin: TV = 0,5 a × b², burada a ve b sırasıyla tümörün uzunluğu ve genişliğidir.
   4. Aşağıdaki işaretlerden herhangi biri göründüğünde numune toplamak için hayvanları kurban edin: BW kaybı >20%; hareket kabiliyetinin bozulması (yiyememe veya içme); önemli assitler veya genişlemiş karın nedeniyle normal hareket edemez; solunum çabası; ölüm.

3. Nekropsi ve tümör hasadı

1. Tümör hacmi 200-800 mm³'e ulaştığında, onaylanan protokoller başına fareleri ötenazi edin (bkz. adım 1.2.2).
2. Bitişik tümör olmayan dokuları çıkararak tümör dokularını toplayın, ardından dokuyu ayrışmadan önce AD+++ (buz üzerinde) ile 50 mL plastik bir tüpe yerleştirin.

4. PDX türevi organoid kültürüne hazırlık

NOT: Aşağıdaki adımların tümü doku kültürü standardı yönergelerine göre bir biyogüvenlik kabini içinde gerçek gerçekleştirildi. 96, 24 ve 6 kuyulu önceden ısıtılmış stokları kullanmadan önce 37 °C'lik bir inkübatörde saklayın.

1. Reaktif preparatları
   1. Bodrum membran özü (BME) çözeltisi hazırlayın (büyüme faktörü azaltılmış, Fenol Kırmızısız). 10 mL BME'yi gece boyunca 4 °C buzdolabında saklayın. Çözdükten sonra, dağılmayı sağlamak için BME şişesini döndürün.
   2. Temel ortam/yıkama arabelleği AD+++ hazırlayın. 5 mL pipetle pipetleme yaparak Gelişmiş DMEM/F12 ortamına 5 mL 200 mM L-glutamin, 1 M HEPES ve Kalem/Strep ekleyin.
   3. Sato ve ark.¹⁸ N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nikotinamid (10 mM), SD20219 ile taban ortamı takviyesi yoluyla0 (10 nM), R-spondin (500 ng/mL), L-glutamin (2 mM), HEPES (10 μM), penisilin-streptomisin (1x) ve Y-27623 (10 μM)¹⁹.
   4. AD+++Sindirim ortamını hazırlayın: 500 μL kollajenaz tip II (20 mg/mL) ve 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM) ile 1x organoid kültür ortamının 10 mL'si.
2. Tümör Ayrışması²⁰
   1. 50 mL plastik tüpteki tümörü 10 cm Petri kabına aktarın. Bir cetvelin yanında makroskopik bir fotoğraf çekin ve koşullarının bir açıklamasını kaydedin (örneğin, boyut, yağ dokuları, damarlanma, nekroz vb.).
   2. Aspirasyonla fazla AD+++'yı çıkarın ve tümör dokusunu makasla küçük parçalara bölün ve ardından kuru buzda çıtçıt dondurma için 2 mL mikrotüp içine 1-2 parça transfer. Genomik profil oluşturma için -80 °C'de saklayın. AD+++ kullanarak 50 mL plastik bir tüpe aktarmadan önce kalan parçaları makasla daha ince parçalara ayırın.
   3. Kıyılmış dokuyu 2-3 kez 35 mL AD+++ ile yıkayın, ardından 10 mL sindirim ortamı (bkz. adım 4.1.4) ve 37 °C'de 1 saat boyunca 4 x g'da bir orbital çalkalayıcıya yerleştirme.
   4. Sindirilen dokuyu 5 mL steril plastik pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin, ardından 20 mL AD+++ ve filtrasyon 100 μm hücre süzgeç ilavesi.
   5. Geçişi AD+++ ile iki kez yıkayın (5 dakika boyunca 450 x g'da döndürün), ardından BME'de resüspensyon (süspansiyon için pelete 4x hacim BME ekleyin) ve buzda tutun¹⁹.
3. Organoid kültürünün hazırlanması
   1. BME hücre süspansiyonu, kuyu başına toplam 200 μL'ye birden fazla damlada 6 kuyu plakasına ekleyin.
   2. Plakayı 37 °C inkübatöre aktarın. 30 dakika sonra jel damlaları katılaşmaya devam etti.
   3. Her kuyuya 2 mL organoid ortam ekleyin, bir inkübatöre aktarmadan önce mikroskobik fotoğrafçılık tarafından kaydedilen temsili damlalarla (37 °C ve% 5 CO_2).
   4. Organoid kültürlerini her 3-4 günde bir orta değişimle koruyun ve her 7 günde bir veya büyüme ve yoğunluklarına bağlı olarak 1:2 oranında geçiş.

5. Histopatoloji ve yeni nesil dizileme (NGS) analizi

1. Histopatoloji
   1. Bir P1000 pipet kullanarak mevcut ortamla kuyudan organoidleri toplayın, ardından santrifüjleme (5 dakika boyunca 450 x g'da döndürün), PBS ile yıkayın ve 1 saat boyunca% 10 formalin'de sabitleme.
   2. Sabit organoidleri% 100 jelatin içine 50 mL konik tüpün altına yerleştirin, ardından rutin doku işleme ve gömme.
   3. 4 mm parafin bölümlerinde standart protokolleri kullanarak hematoksilin-eosin (H&E) boyama işlemi gerçekleştirin.
2. RNAseq ve tüm ekzom dizilimi
   1. Bir P1000 pipet kullanarak mevcut kültür ortamı ile kuyudan organoidleri toplayın, ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca maksimum hızda (12.000 x g)bir mikrosantrifüj kullanarak santrifüjleme.
   2. Görünür bir BME olmadığından emin olmak için orta süpernatantı çıkararak peleti toplayın, ardından bir mikrotüpte (kuru buz) çıtçıt dondurma ve ardından -80 ° C dondurucuya aktarın.
   3. Üreticilerden standart prosedür kullanarak RNA veya DNA çıkarın ve hem RNA hem de tüm ekzom dizilimi (WES) için NGS analizi yapın.

6. IC₅₀ tahlil²⁰

1. IC₅₀ tahlil için 384 kuyu plakasında organoid tohumlama
   1. BME'deki organoidleri her kuyudan (SINdirme BME) 2 mL organoid ortam içeren her kuyuya (6 kuyu plakası) 20 μL 100x dispaz çözeltisi ekleyerek ve ardından 37 °C'de 10 dakikalık inkübasyon ekleyerek (BME'yi sindirerek) ayrıştırın.
   2. Pipet, organoidleri toplamak için 70 μm filtre ile tüm kuyulardan organoidleri 50 mL plastik bir tüpe sindirdi.
   3. Organoid konsantrasyonunun belirlenmesi için mikroskopi altındaki organoidleri sayın. Buz üzerinde% 5 (v / v) nihai konsantrasyona ulaşmak için BME eklemeden önce, kültür ortamını kullanarak organoidleri askıya alın.
   4. İlgili organoid kültürü ortamında kuyu başına 200 CR2110 PDO tohumlama yoğunluğuna sahip plaka haritasına göre, sıvı dağıtıcı ile her 384 kuyu plakasına 50 μL organoid süspansiyon ekleyin.
2. Cisplatin ve irinotecan tedavisi
   1. Cisplatin (en yüksek konsantrasyon 100 μM) ve "irinotecan" (en yüksek konsantrasyon 10 μM ile) kullanın. SN-38 ekleyin (irinotecan metaboliti, genellikle in vivo çalışmalar için kullanılan irinotecan aksine) her kuyuya 9 doz için ilaç seyreltme şemasına göre, dijital dispener tarafından seri seyreltme.
   2. Dijital dağıtıcı yazılım aracını kullanarak plaka haritası oluşturun. %100 canlılık ve %0 canlılık gösteren 5 μM starurosporine postive kontrolüne sahip negatif kontrol aracı ekleyin.
   3. İlaçla tedavi edilen 384 kuyu plakasını tekrar 37 °C inkübatöre yerleştirin.
3. İlaç tedavisi sonrası organoid hücre canlılığının belirlenmesi
   1. 5 günlük ilaç tedavisinin sonunda, üreticinin önerdiği prosedüre göre lüminesan hücre canlılığı reaktiflerini kullanarak organoid hücre canlılığını belirleyin. Sıvı dispener ile her kuyuya parlak reaktif ekleyin ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde 5 dakika karıştırın, ardından karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon.
   2. Işıklı sinyali bir lüminesans çok kuyulu plaka okuyucusunda kaydedin.
   3. Plaka okuyucusundan gelen ham okumaları kullanarak her kuyunun normalleştirilmiş canlılıklarını hesaplayın ve doğrusal olmayan eğri sığdırarak bir doz yanıt eğrisi ve_{IC 50} değerleri oluşturun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Hafif mikroskopi altındaki organoidlere özgü ve H&E boyama başına ebeveyn PDX ile tutarlı olan PDBO'ların morfolojisi
Işık mikroskopisi altında PDXO-CR2110, daha önce hasta kaynaklı organoidler (PDO) için açıklandığı gibi tipik kistik morfolojiyi (Şekil 1A),pdxo ve PDO arasındaki benzerliği aynı kültür koşullarında destekleyen kanıtları göstermektedir.

H&E boyama ile yapılan histopatolojik inceleme, PDXO-CR2110 dok...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu raporda pdx-/PDXO-CR2110 için ön veriler, her iki model de hastanın orijinal CSC'sinden elde edilen hastalık formlarını temsil ettiği için, genomik, histopatoloji ve farmakoloji açısından PDX ve türevi PDXO arasındaki biyolojik eşdeğerliği desteklemektedir. Her iki model de hasta kaynaklı hastalık modelleridir, potansiyel olarak hastaların klinik yanıtını tahmin eden^{10 , 11,12,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634028	Base medium
DMEM	Hyclone	SH30243.01	Washing medium
Collagenese type II	Invitrogen	17101015	Digest tumor
Matrigel	Corning	356231	Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac	Sigma	A9165	Organoid culture medium
A83-01	Tocris	2939	Organoid culture medium
B27	Life Technologies	17504044	Organoid culture medium
EGF	Peprotech	AF-100-15	Organoid culture medium
Noggin	Peprotech	120-10C	Organoid culture medium
Nicotinamide	Sigma	N0636	Organoid culture medium
SB202190	Sigma	S7076	Organoid culture medium
Gastrin	Sigma	G9145	Organoid culture medium
Rspondin	Peprotech	120-38-1000	Organoid culture medium
L-glutamine	Life Technologies	35050038	Organoid culture medium
Hepes	Life Technologies	15630056	Organoid culture medium
penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140122	Organoid culture medium
Y-27632	Abmole	M1817	Organoid culture medium
Dispase	Life Technologies	17105041	Screening assay
CellTiter-Glo 3D	Promega	G9683	Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser	Thermo Fisher	Multidrop combi	Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener	Tecan	D300e	Compound addition
Envision Plate reader	Perkin Elmer	2104	Luminescence reading
Balb/c nude mice	Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit	Qiagen	74104	tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506	DNA purification kit
Histogel	Thermo Fisher	HG-4000-012	Organoid embedding