JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA'nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.

Özet

Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR) birçok biyolojik süreçte kritik bir rol oynar. Hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim ve yaşlanmadan nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyona kadar her hücresel aktivite Ryanodin reseptörleri (RyR) ile ilişkilendirilmiştir. Kalsiyum sinyalizasyonunun önemine rağmen, erken gelişimdeki işlevinin kesin mekanizması belirsizdir. Kısa gebelik periyoduna sahip bir organizma olarak, Drosophila melanogaster'in embriyoları, CICR ile ilişkili proteinlerin ve bunların gelişim sırasındaki düzenleyicilerinin dağılımını ve lokalizasyonunu araştırmak için birincil çalışma konularıdır. Bununla birlikte, lipit bakımından zengin embriyoları ve kitin bakımından zengin koryonları nedeniyle, faydaları embriyoları cam yüzeylere monte etmenin zorluğu ile sınırlıdır. Bu çalışmada, Drosophila embriyosunun slaytlara bağlanmasını önemli ölçüde artıran pratik bir protokol ve başarılı histokimya, immünohistokimya ve yerinde hibridizasyon için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Krom şap jelatin slayt kaplama yöntemi ve embriyo ön gömme yöntemi, Drosophila embriyo proteini ve RNA ekspresyonunun incelenmesinde verimi önemli ölçüde artırır. Bu yaklaşımı göstermek için, Drosophila melanogaster'ın erken embriyonik gelişimi sırasında RyR'nin iyi bilinen bir düzenleyicisi olan DmFKBP12 / Calstabin'i inceledik. DmFKBP12'yi sinsityal blastoderm aşaması kadar erken bir zamanda tanımladık ve gelişim sırasında DmFKBP12'nin dinamik ekspresyon paternini bildirdik: başlangıçta sinsityal blastodermde eşit olarak dağılmış bir protein olarak, daha sonra hücresel blastoderm sırasında korteksin bodrum tabakasına önceden lokalize olarak, erken gastrülasyonda üç mücevherli tabaka fazı sırasında ilkel nöronal ve sindirim mimarisinde dağılmadan önce. Bu dağılım, RyR'nin bu katmanlardan kaynaklanan hayati organ sistemlerinde oynadığı kritik rolü açıklayabilir: subözofageal ve supraözofageal ganglion, ventral sinir sistemi ve kas-iskelet sistemi.

Giriş

Kalsiyuma bağlı kalsiyum salınım sinyalizasyonu (CICR), iskelet/düz kas ve kardiyak vasküler fonksiyon, hücre proliferasyonu ve apoptoz, gelişim, yaşlanma, nöronal sinaptik plastisite ve rejenerasyon gibi birçok biyolojik süreçte kritik rol oynar1,2,3,4,5,6 . Ryanodin reseptörleri (RyR'ler) ve inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP3R), düzenleyicileri protein kinaz A (PKA), Ca2 + / kalmodüline bağımlı protein kinaz II (CaMKII), FK506 bağlayıcı proteinler (FKBP'ler), kalsequestrin (CSQ), triadin ve junktin1,2,3,4,5,6 tarafından kontrol edilen kalsiyum sinyal yolundaki önemli oyunculardır. . Anormal insan ekspresyonu ve bu proteinlerdeki mutasyonlar, aritmi7 ve onkojenik proliferasyon gibi patolojik fizyolojiye yol açabilir8,9.

FKBP'ler, RyR'ler tarafından endoplazmik retikülerden (ER) kalsiyum salınımını düzenler. Bu süreç, kasılma mekanizması için gereklidir ve bu nedenle, embriyonik RyRs1,2 ile birlikte kalsiyum kaynaklı kalsiyum salınımı yoluyla miyosin-aktin kontraksiyonu tarafından üretilen tüm mekanik hareketlerden sorumludur. Fare modellerinde, RyR2 ve regülatörü FKBP12 / Calstabin'in eksikliği, embriyonik gelişim sırasında veya erken doğum sonrası dönemde10,11,12 her zaman öldürücüdür. FKBP12 / Calstabin nakavt fareleri, embriyonik gelişim sırasında düzensiz uyarılma-kasılma kuplajları (EC) ve serebral ödem ile kritik kalp defektleri sergiler. Bu, FKBP12 / Calstabin'in hem kardiyak hem de serebral gelişim için önemli olan RyR2 kanal ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir10.

RyR tarafından yürütülen kalsiyum kıvılcımları başlangıçta döllenmiş Medaka yumurtalarının zigot oluşum aşamasında keşfedilmiştir13,14. Bununla birlikte, erken embriyonik gelişimde kalsiyum sinyalizasyonunun işlevi hakkında çok az araştırma yapılmıştır. Drosophila melanogaster'da, DmFKBP12 S107 mutantlarından elde edilen sonuçlar, bu genin larva gelişimi ve oksidatif strese karşı işlevine atfedilen sağlıklı bir yaşam süresi için önemini destekleyen güçlü kanıtlar sunmaktadır15,16. Son zamanlarda, erken Drosophila melanogaster gelişimi sırasında FKBP12 / Calstabin proteini ve mesajcı RNA'nın dinamik lokalizasyonunu tanımladık17. Bu metodolojide açıklanan yaklaşımları kullanarak, sinsityal blastoderm (0-2 saat), hücresel blastoderm (2-3 saat), erken gastrula (3-12 saat) ve geç gastrula (12-24 saat) sırasında D. melanogaster'de FKBP12 / Calstabin ekspresyonunu izleyebildik. Bu yazıda, klasik parafin kesitleme için embriyo öncesi gömme, embriyonik kesitler için ön kaplama slayt tedavisi, histo-kimya boyama ve immünoboyama ve gen ekspresyonunun tanımlanması için mRNA in-situ hibridizasyonu dahil olmak üzere önceki çalışmadaki her yaklaşımın ayrıntılı protokolleri sunulmuştur.

Protokol

1. Üzüm suyu agar tabaklarının hazırlanması

  1. 150 mL damıtılmış suya 5 g agar ve 5 g sakkaroz ekleyin. Agar ve sakkaroz tamamen çözünene kadar bir mikrodalga kullanarak kaynatın. 50 mL% 100 üzüm suyu ve çözeltiyi birlikte karıştırın.
  2. Son konsantrasyonu% 0.5 propiyonik aside yapmak için 1 mL% 100 propiyonik asit ekleyin. Hazırlanan çözeltinin 25 mL'sini her plakaya dökün. Agar katılaştıktan sonra, ortamı 4 ° C'de saklayın.

2. Kaplama slaytları

  1. Slaytlara deterjanla ön işlemden geçirin. Slaytları 3 kez musluk suyuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra slaytları 45 °C fırında 2 saat kurutun.
  2. Slaytları 24 saat boyunca yaklaşık 450 mL potasyum dikromat sülfürik asit çözeltisine (20 g potasyum dikromat, 40 mL damıtılmış su ve 400 mL konsantre sülfürik asit) batırın. Slaytları 3 kez musluk suyuyla ve bir kez damıtılmış suyla yıkayın.
    1. Slaytları 45 °C fırında iki saat kurutun. 2 saatten fazla bir süredir% 95 etanol içine daldırın.
  3. 1 L damıtılmış suya 0.5 g krom potasyum sülfat ve 5 g jelatin ekleyin. Kullanmadan önce 60 °C'lik bir su banyosunda çözün. Krom şap jelatini 4 °C'de uzun süre saklanabilir.
  4. Slaytın üzerine 10 μL krom şap jelatini bırakın ve slaytın tüm yüzeyini çözelti ile tamamen ve eşit şekilde örtün. Slaytı jelatin tarafı yukarı bakacak şekilde 48 saat boyunca 42 °C'de bir fırına yerleştirin. Hazırlanan slaytlar daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de saklanabilir.
    NOT: Bu kritik bir adımdır. Tam kaplama gereklidir. Meyve sineği ve embriyosu için, bu slayt kaplama yaklaşımı polilizin kaplamadan daha verimli görünmektedir.

3. Drosophila embriyo gömme

  1. Drosophila embriyo koleksiyonu
    NOT: Drosophila embriyolarını 0-2 saat (sinsityal blastoderm), 2-3 saat (hücresel blastoderm), 3-12 saat (erken gastrula) ve 12-24 saat (geç gastrula) olmak üzere dört periyotta topladık18. Ana embriyo tiplerinin her dönemdeki oranı Tablo 1'de gösterilmiştir.
    1. Plastik bir toplama şişesine 400-500 sinek yerleştirin ve şişeyi maya özü içeren üzüm suyu agar plakasıyla örtün. Drosophila embriyoları oda sıcaklığında üzüm suyu agar üzerine serilir.
    2. Embriyoları yüzdürmek için her plakaya nazikçe 2 mL PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) ekleyerek dört dönem embriyo toplayın. Yaklaşık 200 embriyoyu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve embriyoları yerleştirmek için 2 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
  2. Ön gömme
    1. 200 Drosophila embriyosunu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Embriyoları yerleştirmek için tüpü 2 dakika boyunca buz üzerinde tutun ve ardından süpernatantı pipetle dikkatlice atın. Tüpe 1 mL% 50 ağartıcı ekleyin ve 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayın.
      NOT: Ağartıcı taze hazırlanmalıdır ve ağartıcı miktarı toplanan embriyo miktarına bağlı olarak değişebilir.
    2. Embriyoları filtre kağıdına dökerek yavaşça toplayın ve her seferinde 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
    3. Embriyoları filtre kağıdı ile yaklaşık 5 mL n-heptana aktarın.
    4. Karışımı taze bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 1 mL metanol ekleyin ve hafifçe sallayın. Sedimantasyondan sonra embriyoları toplayın.
    5. Süpernatantı çıkarın ve embriyoları 1 mL PBS'de 3-5 kez yıkayın.
    6. Embriyoları 30 dakika boyunca 400 μL Bouin çözeltisi (% 71 doymuş pikrik asit,% 24 formalin,% 5 asetik asit) ile sabitleyin. Sabit embriyoları her seferinde 5 dakika boyunca 1 mL PBS'de 3 kez yıkayın.
    7. Embriyoları toplamak için, numuneleri bir lastik tıpaya aktarın ve PBS'yi çıkarın.
    8. % 1.2 agaroz-PBS çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 60 ° C'de tutun. Bir agar bloğuna sabitlemek için embriyolara 200 μL% 1.2 agaroz-PBS çözeltisi ekleyin.
    9. Bloğu tıpadan çıkarın ve bloğu PBS'de saklayın.
      NOT: Ön gömme yaklaşımı sırasında, ısınma yanlısı başarılı olmak için kritik öneme sahiptir. Bu adımda kullanılacak santrifüj tüplerinin ve mikropipet uçlarının çalışmadan önce tamamen ön sıcak olmasını şiddetle tavsiye ederiz.
  3. Parafin gömme
    1. Önceden gömülü agar bloğunu her biri 15 dakika boyunca% 35 etanol,% 50 etanol,% 75 etanol ve% 85 etanol içine batırın. Daha sonra% 95 etanol ve% 100 etanol içine 2 kez daldırın.
      NOTLAR: Her birinin yaklaşık 5-10x blok hacmi ve ardından bloktaki embriyo sayısına bağlı olarak 15-30 dakika boyunca derecelendirilmiş bir fiksatif gereklidir.
    2. Embriyo bloğunu 15 dakika boyunca% 100 etanol ve ksilen (1: 1 oranında) çözeltisine batırın.
    3. Embriyo dokusunu şeffaf hale getirmek için bloğu 1 dakika boyunca ksilen'e aktarın.
    4. Bloğu 30 dakika boyunca ksilen ve parafin (1: 1 oranında) içine batırın.
    5. Bloğu her seferinde 2 saat boyunca parafin I, parafin II ve parafin III'e batırın.
    6. Gömme kutusunu önceden parafin ile doldurun ve ardından bloğu yavaşça ve yatay olarak gömme kutusunun altına aktarın. Parafin doğal olarak katılaştıktan sonra, katılaşmış parafin bloğu 4 ° C'de saklanabilir.
      NOTLAR: Önceden gömülü numune, aşağıdaki adımları izleyerek kriyokesitte kullanılabilir. Embriyolar yukarıda tarif edildiği gibi agaroz ile önceden gömüldükten sonra, örnekler basitçe OCT Bileşiğine gömülür. Daha sonra rutin kriyüsit protokolüne göre kriyoseksiyon yapılabilir. Daha sonra kesitlerde düzenli boyama yaklaşımları kullanılabilir.

4. Hematoksilin-eozin boyama

  1. Drosophila embriyo bölümlerini hazırlayın. Hazırlanan bölümleri 15 dakika boyunca 60 ° C'de bir fırına yerleştirin ve ardından bölümleri her biri 10 dakika boyunca 2 kez ksilen içine batırın. Bölümleri 2 dakika boyunca% 100 etanol ve ksilene (1: 1 oranında) içinde bir kez batırın.
  2. Bölümleri %100 etanol I, %100 etanol II, %95 etanol, %85 etanol, %75 etanol, %50 etanol ve damıtılmış suda 3 dakika nemlendirin.
  3. Bölümleri hematoksilin çözeltisi ile 2 dakika boyunca sabitleyin. Slaytları% 1 asit alkol çözeltisine (1 mL hidroklorik asit, 100 mL% 70 etanol) hızlı bir şekilde batırın ve slaytları damıtılmış suda yıkayın.
  4. Slaytları sırasıyla% 50 etanol,% 75 etanol,% 85 etanol ve% 95 etanol içine batırın.
  5. Bölümleri 1 dakika boyunca eozin çözeltisi ile sabitleyin.
  6. Slaytları her seferinde 1 dakika boyunca% 95 etanol I,% 95 etanol II,% 95 etanol III,% 100 etanol I,% 100 etanol II ve% 100 etanol III içinde kurutun.
  7. Her seferinde 5 dakika boyunca %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III slaytlarını temizleyin.
  8. Slaytları üreticinin talimatlarına göre nötr balsamla monte edin.

5. Periyodik asit-gümüş metenamin boyama

  1. Drosophila embriyosunun parafin bölümlerini damıtılmış suya deparafinize edin ve nemlendirin.
  2. Bölümleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 1 periyodik asit içinde oksitleyin.
  3. Slaytları damıtılmış suda her biri 1 dakika boyunca 3 kez durulayın.
  4. Slaytları yaklaşık 40 mL taze filtrelenmiş gümüş metenamin çalışma çözeltisinde (% 3 metenamin,% 5 gümüş nitrat,% 5 sodyum borat çözeltisi) 60 ° C'de 1 saat ve 20 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları damıtılmış suda 1 dakika durulayın.
  5. Slaytları 2 dakika boyunca% 0.2 altın klorür içinde tonlayın ve ardından slaytları 1 dakika damıtılmış suda durulayın.
  6. Slaytları 3 dakika boyunca% 3 sodyum tiyosülfat içine yerleştirin ve ardından slaytları 1 dakika boyunca damıtılmış suda durulayın.
  7. Hematoksilin içindeki slaytları 30 sn boyunca karşı boyayın. Slaytları akan musluk suyunda 3-5 dakika yıkayın.
  8. Slaytları her biri 5 dakika boyunca% 70 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol I,% 95 etanol II,% 95 etanol III,% 100 etanol I ve% 100 etanol II'de kurutun.
  9. Slaytları %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III olarak her biri 5 dakika boyunca temizleyin.
  10. Slaytları üreticinin talimatlarına göre nötr balsamlara monte edin.

6. İmmünohistokimya

  1. Standart protokolü izleyerek Drosophila embriyosunun parafin kesitlerini PBS'ye deparaffinize edin ve rehidratlayın19.
  2. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca metanol içinde% 0,3 H2O2 ile tedavi edin ve ışıktan kaçının.
  3. Uygun antijen alma tamponunu, sebze buharlı pişiricideki slaytlarla birlikte bir kapta yaklaşık 100 ° C olacak şekilde önceden ısıtın. Kabın ayrıca bir kapağı olmalıdır. Slaytları kaba koyun. Vapurun kapağını kapatın.
    1. Kabı bu noktadan itibaren 20 dakika boyunca vapurda tutun. Sürgülü kabın kapağının tamamen sıkılmaması gerektiğini unutmayın, böylece buharlama işlemi sırasında su buharı girebilir.
  4. Her biri 5 dakika boyunca 3 kez PBS-T'DE (ARA-20, pH 7.2 ile PBS) hafifçe durulamadan önce slaytların oda sıcaklığına geri dönmesine izin verin ve ardından slaytları PBS'de her biri 1 dakika boyunca 3 kez durulayın.
  5. Slaytları PBS'de oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin.
  6. Slaytları primer antikor (1:1000'de anti-FKBP12) ile gece boyunca 4 ° C'de veya 4 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. Slaytları PBS-T'de her biri 5 dakika boyunca 4 kez yıkayın.
  8. Slaytları, ikincil antikorlarla (anti-Tavşan, 1:5.000) konjuge HRP etiketli polimer ile oda sıcaklığında 90 dakika boyunca uygulayın. Fotoğraf ağartmasını önlemek için bunu karanlıkta yapın.
  9. Slaytları PBS-T'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  10. Reaksiyon ürünlerinin rengi mikroskop altında uygun olana kadar slaytları% 5 3,3'-diaminobenzidin-tetrahidroklorür (DAB) ile 2-10 dakika boyunca inkübe edin.
  11. Hematoksilin içindeki slaytları 30 s boyunca karşı lekeleyin ve slaytları damıtılmış suda her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
  12. Slaytları her biri 1 dakika boyunca% 50 etanol,% 70 etanol,% 90 etanol,% 95 etanol ve% 100 etanol içinde kurutun.
  13. Slaytları %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III olarak her biri 5 dakika boyunca temizleyin.
  14. Slaytları üreticinin talimatlarına göre nötr balsamlara monte edin.

7. In-situ hibridizasyon

NOT: Drosophila embriyo kesitleri %0.01 dietil pirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su ile hazırlanmıştır. Yerinde hibridizasyon için kullanılan tüm aksesuarlar DEPC gece tedavisini önceden uygular.

  1. Riboprob hazırlama
    1. 5' çıkıntı oluşturan bir kısıtlama enzimi kullanarak klonlanmış uçtan aşağı yönde bir kısıtlama enzimi bölgesinde keserek şablon DNA'yı doğrusallaştırın. Doğrusallaştırmadan sonra, şablon DNA'sını fenol / kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltmesi yoluyla saflaştırın. Standart protokolleri kullanın.
    2. RNaz içermeyen bir santrifüj tüpüne 1 μg saflaştırılmış şablon DNA ekleyin. Santrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin. Toplam hacim 13 μL'ye yeterli DEPC ile arıtılmış su ekleyin.
      1. Daha sonra aşağıdaki reaktifleri sırayla ekleyin: 2 μL 10x NTP etiketleme karışımı, 2 μL 10x transkripsiyon tamponu, 1 μL koruyucu RNaz inhibitörü, 2 μL RNA Polimeraz SP6 veya RNA Polimeraz T7.
    3. Pipetleme ve santrifüj ile reaksiyonu kısa sürede karıştırın. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
      NOT: Daha uzun inkübasyonlar, etiketli RNA'nın verimini artırmaz. Reaksiyon tüpüne uygulanan kısa bir spin (~ 800 rpm), bir sonraki adıma geçmeden önce kritik öneme sahiptir. Bu dönüş, inkübasyondan oluşabilecek tüm içeriklerin tüpün dibine gelmesine izin verecektir.
    4. Şablon DNA'yı çıkarmak için 2 μL RNaz içermeyen DNaz I ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Reaksiyonu durdurmak için 2 μL 200 mM EDTA (pH 8.0) ekleyin.
      NOT: DIG etiketli RNA probları bir yıl boyunca etanolde -15 ila -25 °C'de saklanabilir.
  2. Drosophila embriyo bölümünün ön hibridizasyonu
    1. Drosophila embriyosunun bölümlerini 48 saat boyunca 42 °C'lik bir fırına yerleştirin.
    2. Slaytları 10 dakika boyunca iki kez% 100 ksilen içinde deparaffinize edin.
    3. 5 dakika boyunca% 100 etanol,% 95 etanol,% 90 etanol,% 70 etanol ve% 50 etanol içine sırayla batırarak slaytları nemlendirin.
    4. Fiksatif çözelti / Bouin çözeltisini dokudan çıkarmak için PBS'deki slaytları 5 dakika 3 kez inkübe edin.
    5. Slaytları her biri 5 dakika boyunca 2 kez 100 mmol / L glisin / PBS çözeltisi ile yıkayın.
    6. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
    7. Membranları geçirgenleştirmek için kızakları PBS'de %0,3 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    9. Slaytları 15 μg / mL RNaz içermeyen proteinaz K'da 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    10. Sindirimi durdurmak için slaytları PBS'de% 4 paraformaldehit ile 3 dakika boyunca inkübe edin.
    11. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
    12. Kızakları 100 mM trietanolamin tamponunda (pH 8.0) %0,25 (v/v) asetik anhidrit ile her biri 5 dakika boyunca 2 kez inkübe edin.
    13. Slayt nem odasına DEPC suyu ekleyin. Slaytlara 20 μL ön hibridizasyon çözeltisi (100 μg / mL somon sperm DNA'sı içeren) ekleyin. Slaytları slayt nem odasına yerleştirin. Slaytları 4 saat boyunca 42 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Islak kutunun kapağının sızdırmazlığını sağlamak ve uçuculuğu ve hibridizasyon öncesi çözeltinin ve takip edilen hibridizasyon çözeltisinin dokusundan sapmayı önlemek için ıslak kutunun her zaman yatay olarak tutulması gerekir.
  3. Drosophila embriyo bölümünün hibridizasyonu
    1. Ön hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve slaytları her biri 5 dakika boyunca 3 kez 0,2x SSC (150 mM sodyum klorür, 15 mM sodyum sitrat, pH 7,0) ile yıkayın. Doku örneklerinin etrafındaki fazla 0,2x SSC'yi silin.
    2. Bir pipetle 30 μL prob hibridizasyon çözeltisi (ön hibridizasyon çözeltisinde seyreltilerek 2-6 ng digoksin etiketli RNA probu içeren) uygulayın. Sürgü nem odasındaki kızakları 42 °C'de yaklaşık 20 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Son notanın önerisi olarak kapak sızdırmazlığından emin olun. Aksi takdirde, ön hibridizasyon veya ön hibridizasyon sızıntısından kaynaklanan kuruma, slaytlarda sözde pozitif de dahil olmak üzere kirli arka plan oluşturacaktır.
  4. Hibridizasyon
    1. Hibridizasyon çözeltisini çıkarın ve slaytları 37 ° C'de her biri 15 dakika boyunca 4 kez 4x SSC çözeltisiyle yıkayın.
    2. Slaytları 2x SSC çözeltisinde 20 μg/mL RNase A ile 37 °C'de 30 dakika boyunca yıkayın.
    3. Slaytları 1x SSC çözeltisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca yıkayın.
    4. Slaytları 0,5x SSC çözeltisinde 37 °C'de 15 dakika boyunca yıkayın.
    5. Slaytları 0,1x SSC çözeltisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca yıkayın.
    6. Slaytları PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    7. Kızakları yıkama tamponunda (100 mM maleik asit, 150 mM NaCl, %0,3 (v/v) Ara 20, pH 7,5) 1 dakika boyunca yıkayın.
    8. Slaytları 100 mL'lik taze hazırlanmış bloke edici çözeltide (Tween 20 olmadan maleik asit tamponunda% 2 koyun serumu) 30 dakika boyunca inkübe edin.
    9. Slaytları 45 dakika boyunca 20 mL antikor çözeltisinde inkübe edin.
      1. Her kullanımdan önce antikoru orijinal şişede 10.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve gerekli miktarı yüzeyden dikkatlice pipetleyin. Anti-digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/mL) blokaj çözeltisinde seyreltin.
    10. Bağlanmamış antikor konjugatını çıkarmak için slaytları 100 mL yıkama tamponunda her biri 15 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
    11. Kızakları 2-5 dakika boyunca 20 mL algılama tamponunda (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) dengeleyin.
    12. Slaytları, slayt nem odasında 10 mL taze hazırlanmış renk substratı çözeltisi ile inkübe edin. Reaksiyon birkaç dakika içinde başlar ve 16 saat sonra tamamlanır. Renk gelişirken sallamayın veya karıştırmayın.
    13. Reaksiyonu durdurmak için slaytları 50 mL damıtılmış suyla 5 dakika yıkayın.
    14. Numuneyi gece boyunca karanlıkta kurulayın.
    15. Slaytları her biri 3 dakika boyunca% 70 etanol,% 80 etanol,% 90 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol I ve% 100 etanol II'de kurutun.
    16. Slaytları %100 ksilen I, %100 ksilen II ve %100 ksilen III olarak her biri 20 dakika boyunca temizleyin.
    17. Slaytları nötr balzamla monte edin.
    18. Görüntüleri belgeleyin ve ters mikroskopi ve üretici yazılımı ile analiz edin. ImageJ kullanarak pozitif sinyalin yoğunluğuna göre uzunlamasına eksen boyunca veya embriyoların diferansiyel bölgesi içinde dağılım analizi yapın.
      NOT: Adım 7.4.12'deki taze hazırlanmış renk substrat çözeltisi ile inkübasyon sırasında, reaksiyon rengi çıplak gözle bile görülebilir. Renk gelişiminin stereoskop altında nasıl incelenebileceğine dair bu gözlem. Reaksiyon rengi makul olduğunda ve reaksiyonu durdurmak için 7.4.13 adımı gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Şekiller, yüksek lipid ve kitin içeren koryon Drosophila embriyolarının (Tablo 1) inceleme ve deney için cam slayt yüzeyine bağlanma zorluğunun üstesinden gelmek için kullanılan protokolleri açıklamaktadır. Şekil 1'de gösterilen krom şap jelatin slayt kaplama yöntemini kullanarak, Drosophila embriyolarının slaytların yüzeyine bağlanmasını arttırırken, Şekil 2'de gösterilen embriyo ön gömme yönte...

Tartışmalar

RyRs ve IP3Rs aracılı kalsiyum sinyalizasyonu, hem omurgalı hem de omurgasız hayvanların birçok fizyolojik ve patolojik sürecinde temel bir yoldur1,2,3,4. İnsanlarda, RyR2 genindeki CPVT ile ilişkili R4496C mutasyonu gibi nokta mutasyonları, kardiyomiyositin sarkoplazmik retikulumundan kalsiyum sızıntısına yol açarak kardiyak disfonksiyona neden olur. Bu mutasyonlar, fiziksel akt...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (#31771377 / 31571273 / 31371256), Ulusal Eğitim Bakanlığı'ndan Yabancı Seçkin Bilim İnsanı Programı (#MS2014SXSF038), Ulusal Eğitim Bakanlığı Merkez Üniversiteleri Araştırma Fonu (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45) tarafından desteklenmiştir ve XZ, Shaanxi İl Eğitim Departmanının Anahtar Programı (#2019TS082 / 2019TS079), Üstün Doktora Tezi Fonu (#20JS138 / 2019TS079) tarafından desteklenmektedir. Shaanxi İl Bilim ve Teknoloji Bölümü Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı Gençlik Projesi (#2020JQ-885).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
-20°C RefrigeratorMeiling Biology &MedicalDW-YL270Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigeratorThermoForma 90 SeriesUsed for regent storage
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPreparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubatorShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hybridization
Bouin's solutionSinopharm Chemical Reagent at Beijing69945460Drosophila Embryo Embedding
CentrifugeEppendorf540BH07808In-situ Hybridization
Centrifuge tubeDenvilleC-2170Drosophila Embryo Collection
Chrome AlumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10001018Coating Slides
Constant temperature water bathJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCHematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection SystemDakoK5007In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPCSigma-AldrichD5758In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling KitRoche11093274910RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying ovenTianjin Taiste Instruments101-0ABFor coating slides and paraffin embedding
EosinSigma-Aldrich230251Hematoxylin-Eosin Staining
EthanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing100092680Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
GelatinSinopharm Chemical Reagent at Beijing10010328Coating Slides
Gold chlorideSigma-Aldrich379948Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
HematoxylinSigma-AldrichH3136Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification KitRoche11732668001For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity boxNingbo Jiangnan InstrumentsHWSFor fly maintenance
LE AgaroseHyAgarose14190108029Pre-embedding
MethanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing10014108Drosophila Embryo Collection
MicroscopeZEISSObserver.A1Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope SlidesMeVid Labware ManufacturingP105-2001Coating Slides
Neutral GumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10004160Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptaneSinopharm Chemical Reagent at Beijing40026768Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicerHuahai science instrumentHH-2508IIIIn-situ Hybridization
ParaffinSinopharm Chemical Reagent at Beijing69019461Paraffin Embedding
pH/mV MeterSartoriusPB-10For determing the pH value of a solution
Silver nitrateSinopharm Chemical Reagent at Beijing10018461Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meterThermoAFXI-0501-PIn-situ Hybridization
XyleneSinopharm Chemical Reagent at Beijing10023418Paraffin Embedding

Referanslar

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 183Drosophila embriyosuparafin kesitikaplama slaytg mmeyerinde hibridizasyonDmFKBP12 Calstabin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır