Hasta Kaynaklı Organoidler Kullanılarak Orta Verimli İlaç ve Radyoterapi Tarama Testi

Özet

Orta verimli tedavi duyarlılık taramaları için hastadan türetilmiş organoidleri kullanmak için ayrıntılı protokoller açıklıyoruz. Test edilen tedaviler arasında kemoterapi, radyoterapi ve kemo-radyoterapi bulunur. Adenozin trifosfat seviyeleri fonksiyonel bir okuma olarak kullanılır.

Özet

Hasta kaynaklı organoid (PDO) modeller, üç boyutlu ve doğal duruma yakın bir durumda büyüyen birincil epitel hücrelerinin uzun süreli genişlemesine ve korunmasına izin verir. Rezeke edilmiş veya biyopsi yapılmış tümör dokusundan türetildiğinde, organoidler in vivo tümör morfolojisini yakından özetler ve in vitro tedavi yanıtını incelemek için kullanılabilir.Tümör organoidlerinin biyobankaları, çok çeşitli klinik tümörleri ve hastaları yansıtır ve bu nedenle klinik öncesi ve klinik uygulamalar için büyük umut vaat eder. Bu yazıda baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom ve kolorektal adenokarsinom organoidleri kullanılarak orta verimli ilaç taraması için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, hem normal hem de hastalıklı herhangi bir doku kaynaklı organoid modelle kullanım için kolayca benimsenebilir. Organoidlerin kemoterapi ve radyoterapiye (tek tedavi yöntemi olarak veya kombinasyon halinde) in vitro maruziyeti için yöntemler tanımlanmıştır. İlaca maruz kaldıktan 5 gün sonra hücre sağkalımı, adenozin trifosfat (ATP) seviyeleri ölçülerek değerlendirilir. İlaç duyarlılığı, yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC₅₀), eğrinin altındaki alan (AUC) ve büyüme hızı (GR) ölçümleri ile ölçülür. Bu parametreler, bir organoid kültürün belirli bir tedaviye duyarlı veya dirençli olarak kabul edilip edilmediğine dair fikir verebilir.

Giriş

Yetişkin kök hücrelerden oluşturulan ve üç boyutlu (3D) hücre dışı matriks (ECM) ve spesifik bir büyüme faktörü kokteyli (HUB Organoidleri olarak da bilinir) içinde büyütülen organoid modeller, klinik öncesi onkolojik tarama platformları olarak ilgi görmektedir. Hasta kaynaklı organoid (PDO) kültürler hem normal hem de hastalıklı doku biyopsilerinden 1-2 hafta içinde oluşturulabilir ve en az 1-2 ay boyunca sınırsız zaman aralıklarına kadar genişletilebilir. Kriyoprezervasyon, iyi karakterize edilmiş kültürlerin uzun süreli kullanımına izin verir. Klonal olarak türetilen geleneksel iki boyutlu hücre hattı modellerinin aksine, PDO modelleri hem fenotipik hem de genetik olarak orijinal tümör dokusunu yakından özetler ve tümör heterojenliğini korur. PDO'larda çok çeşitli tedavileri test eden orta verimli ilaç ekranları, kişiselleştirilmiş tıp için benzersiz bir platform sağlar.

Önceki çalışmalar, farklı tümör tiplerinden oluşturulan modellerde tedavi taraması, özellikle ilaçlar ve radyoterapi için organoid modellerin kullanımını tanımlamış ve organoidlerin klinik karar vermeye rehberlik etmek için öngörücü potansiyelini göstermiştir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Bu yazıda, orta verim kapasitesinde PDO'lar kullanılarak yapılan onkolojik tedavi tarama yöntemleri açıklanmaktadır (Şekil 1A). Bu protokol, yarı otomasyonlu 384 oyuklu bir plaka formatında kurulur ve sekiz adede kadar organoid model, 16 bileşik ve sekiz adede kadar 384 oyuklu plaka için tedavi testine izin verir. Bileşik ilaç taramalarının yanı sıra, bu yazıda radyoterapi duyarlılığı ve duyarlılığını test etme yöntemleri de açıklanmaktadır. Ayrıca, ilaç ekranını tam otomasyona yükseltmek için yüksek verimli robotların kullanılması tartışılmaktadır. Daha da önemlisi, farklı dokulardan gelen organoidler farklı ortamlar ve farklı işlemler gerektirebilir.

Burada, ilgilenilen organoide bağlı olarak adaptasyona ihtiyaç duyabilecek genel bir ilaç tarama testi protokolü açıklanmaktadır. Optimizasyon için başlangıç noktaları ve önerilerin yanı sıra deney kurulumu ve organoid uygulama ile ilgili genel öneriler tartışmaya dahil edilmiştir. Örnekler, tipik olarak yoğun bir morfolojiye sahip olan baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) organoidleri ve kistik veya yoğun bir morfolojiye sahip olabilen kolorektal kanser (CRC) organoidleri kullanılarak verilmiştir. Primer organoid oluşturma ve genişletme kültürü yöntemlerinin bu protokolde ele alınmadığını lütfen unutmayın; Temel organoid teknikler için, okuyucu diğer protokollere başvurmalıdır (örn., ¹²). Bu görsel protokol, organoid modeller kullanılarak orta verimli ilaç taraması süreci hakkında bilgi sağlayacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokolü kullanmadan önce lütfen kurumun insan araştırmaları etik kurulunun yönergelerine uyulduğundan emin olunuz. Bu protokolde açıklanan hasta dokusu ve verilerinin toplanması, EUREC yönergelerine ve Avrupa, ulusal ve yerel yasalara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm organoidler rıza gösteren hastalardan türetilmiştir ve rıza herhangi bir zamanda geri çekilebilir.

1. Taramadan önce

1. Normal hücre büyümesi olasılığını dışlamak için yeni kurulan modellerin kimliğini doğrulayın (örneğin, histoloji ve/veya DNA dizilimi ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11} ile) ve ilaç taramasının tümör organoid kültürleri üzerinde yapıldığından emin olun (bkz.Şekil 2D).
2. Tartışma bölümünde verilen genel önerilerden yararlanarak deney plakası kurulumunu tasarlayın ( Ek Şekil S1'deki örneğe bakın).
3. Gerekli organoid sayısını hesaplayın ve 0. günde bölünmeye hazır yeterli organoid hazırlayın (referans olarak Tablo 1'i kullanın).
   NOT: Organoid tip ve modelinin GR'sine bağlı olarak, her tam 384 oyuklu eleme plakası için yaklaşık 1-2 tam 6 oyuklu plaka gereklidir. Bir kılavuz olarak, 6 oyuklu bir plakanın dolu bir kuyusu ±20.000 kistik organoid veya 50.000'e kadar yoğun / üzüm benzeri organoid içerir.
4. Hücre dağıtıcısının bir raportör boyası kullanılarak kalibre edilip edilmediğini kontrol edin ve gerekirse üreticinin protokolüne göre kalibre edin.

2. Reaktif hazırlama

1. Temel ortamı hazırlayın: gelişmiş DMEM/F12+++ (aDF+++). 500 mL'lik bir şişeye 1x L-glutamin ikamesi (h/v), 1 M4- (2-hidroksietil)-1-piperazin etansülfonik asit (HEPES) ve 100 U/mL penisilin / streptomisin 500 mL ekleyin. aDF+++'ı 4 °C'de 1 aya kadar tutun.
2. Kullanılan organoid tipi için uygun organoid genişleme (yani büyüme) ortamını hazırlayın ^9,10.
3. Deney düzeneğine bağlı olarak genleşme ortamından farklı olabilecek tarama ortamını hazırlayın. Organoidleri dağıttıktan sonra iyileşmeye yardımcı olmak için, tarama ortamına 5 μM Rho kinaz (ROCK) inhibitörü (Y-27632) ekleyin.
4. aDF + ++ 'da 100 mg / mL'lik bir Dispas II çözeltisi hazırlayın.
   NOT: 100x'lik bir dispas çözeltisi -20 °C'de 2 ay boyunca stabildir.

3. Gün 0: Organoidlerin hazırlanması

NOT: Aşağıda belirtilen hacimler, 1200 μL organoid/ECM'ye (oyuk başına 200 μL organoid/ECM) eşdeğer, iyi yetiştirilmiş 6 oyuklu bir organoid plakasından başlar.

1. Organoidleri olası enfeksiyon, yoğunluk ve genel görünüm açısından parlak alan mikroskobu kullanarak inceleyin; Geçmeden önce referans olması için tüm modellerin resimlerini çekin.
2. Organoidleri ve tohumu aşağıdaki adımlara göre geçirin. Organoid sıcaklık dalgalanmalarını azaltmak için bu adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin. Organoid süspansiyonları tutarken, organoid kaybını önlemek için düşük tutma noktalı uçlar veya önceden ıslatılmış pipetler ve plastikler kullanın.
   1. Daha büyük hacimlerde ECM/organoidler (>1200 μL ECM) kullanırken, organoidlerin ECM'den uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için aşağıdaki gibi dispas ile ECM sindirimini düşünün.
      NOT: Dispase, ECM'yi parçalar, ancak organoidleri etkilemez.
      1. İsteğe bağlı: Her oyuğa 1 mg / mL dispas ekleyin ve organoidleri her zamanki gibi geçmeden önce 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
         NOT: Dağıtıcı orta bileşenler tarafından etkisiz hale getirilmediğinden, ayırıcı hacmin en az 20 katı eklenerek (aDF+++ kullanarak) yıkayın.
   2. Organoidleri üç adet 15 mL'lik tüpte toplayın (tüp başına 400 μL'ye kadar ECM). aDF++++ ile 12 mL'ye kadar doldurun ve RT'de 85 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Düzgün bir şekilde peletlenirse, süpernatanı aspire edin. Organoidler net bir şekilde peletlenmemişse, 5 dakika daha yüksek bir hızda (organoid tipine ve boyutuna bağlı olarak 450 × g'a kadar) santrifüjleyin. Peleti tekrar askıya alın ve yıkamayı tekrarlayın.
      NOT: Peletin üzerindeki cam benzeri bir tabaka, ECM'nin varlığını gösterir. Parlak alan mikroskobu kullanarak ECM'de herhangi bir organoid sıkışmadığını kontrol edin (az sayıda sıkışmış organoid kabul edilebilir) ve kalan ECM'yi bir p1000 pipeti ile dikkatlice çıkarın. ECM'de (çok) çok sayıda organoid varsa, dispas ayrıştırma adımını tekrarlayın veya peleti yıkayın ve daha yüksek bir hızda sıkın (maksimum 450 × g).
   3. Her 15 mL'lik tüp için, organoid peletini 1 mL aDF+++ içinde yeniden süspanse edin ve organoidleri doğru boyuta ulaşana kadar dikkatlice ayırın. Tipe/morfolojiye bağlı olarak düzenli bölme için kullanılan ayrıştırma yöntemini kullanın (Tablo 1).
      1. Kistik ve üzüm benzeri organoidler söz konusu olduğunda, üstte p2 uçlu bir p1000 ile yukarı ve aşağı pipetleyerek veya ucu bir alevde daraltılmış önceden ıslatılmış cam tıkalı bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek bunları mekanik olarak parçalayın, küçük parçalara (<2 μm) kesin.
         NOT: Organoidlerin ekranın boyut aralığından daha küçük veya bu aralık içinde olmasını hedefleyerek her 5 kez yukarı ve aşağı pipetledikten sonra parlak alan mikroskobu kullanarak organoid bozulmasını onaylayın (Tablo 1).
      2. Yoğun organoidler için, hücre peletini yeniden süspanse etmek için aDF+++ içinde 1 mL %50 v/v TrypLE çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de en az 2 dakika inkübe edin. Bunu takiben, tüpü kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın ve parlak alan mikroskobu altında kontrol edin. Yukarıdakiyle aynı yaklaşımı kullanarak, organoidleri bir pipetle mekanik olarak parçalayın ve işlem boyunca sürekli olarak mikroskop altında kontrol edin. HNSCC organoidleri için, TrypLE'nin% 100 çözeltisinde 5 dakika inkübe edin.
         NOT: Kültürün türüne bağlı olarak, küçük hücre grupları (örneğin, CRC organoidleri, >20 μm) veya tek hücreler (örneğin, HNSCC organoidleri) ile sonuçlanmayı hedefleyin. Proteolitik inkübasyonun 15 dakikayı geçmediğinden emin olun, çünkü bu organoid canlılığını etkileyebilir.
   4. Organoidleri 10 mL aDF+++ ile yıkayın. Organoidleri 85 × g'da 5 dakika döndürün; Uygun şekilde peletlenmişse süpernatanı aspire edin. Alternatif olarak, organoidlerin peletlenmesi zorsa, 5 dakika boyunca 450 × g'a kadar santrifüjleyin.
   5. %50 genleşme ortamı/%50 ECM'de yüksek yoğunluklu tohum organoidleri (bölüm 4'te ECM'den kolayca çıkarılmasını sağlar). Normal bir bölmeye kıyasla yaklaşık iki kat yoğunluk hedefleyin, bu genellikle 1:1'lik bir bölünme ile sonuçlanır ( Şekil 1'deki örneklere bakın). Önceden ısıtılmış 6 oyuklu bir plakanın 10 μL damlacıklarında (oyuk başına toplam 200 μL) tohum organoidleri.
      NOT: ECM'nin hızlı bir şekilde katılaşmasını sağlamak, ECM'nin yayılmasını önlemek ve böylece uygun yarım küre kubbe oluşumunu sağlamak için önceden ısıtılmış plakaları gece boyunca 37 °C'de bir inkübatörde veya en az 1 saat boyunca 60 °C'lik bir fırında tutun.
   6. Plakayı ters çevirin ve izin vermek için 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun.
   ayarlanacak ECM. 30-60 dakika sonra, genleşme ortamını (oda sıcaklığı) yavaşça kuyucuklara ekleyin.

4. Gün 2 (aralık: 1 - 3. günler): Organoid dağıtımı

NOT: Organoid GR'ye bağlı olarak, bu 1. veya 3. günde de ortaya çıkabilir. İlaç taraması boyunca, organoidler süspansiyon halinde tutulur. Bu amaçla, organoid büyümesinin sürdürüldüğü, ancak ECM'de katılaşmanın meydana gelmediği düşük bir ECM konsantrasyonunda (% 5-10) dağıtılırlar. Bu, otomatik dağıtıma, optimal organoid-bileşik etkileşimine ve tekrarlanabilir hücre lizine izin verir, ancak aynı zamanda ortamı değiştirme fırsatını da sınırlar.

1. İlaç taraması için gerekli olan organoid süspansiyon konsantrasyonunu ve miktarını hesaplayın.
   1. Kullanılan hücre dağıtıcısına bağlı olarak, hesaplama sırasında ölü hacmi göz önünde bulundurun.
      NOT: Oyuk başına 40 μL organoid süspansiyon dağıtırken, bir 384 plakanın toplam hacmi 15.4 mL'dir. Ortalama olarak, her bir Multidrop hücre dağıtım tüpü ~1 mL'lik bir ölü hacme sahiptir, bu da tüm nozulları kullanırken 8 mL ölü hacim ile sonuçlanır. Bu, 384 oyuklu bir plakanın tamamı için her bir organoid model için toplam 23.4 mL ile sonuçlanır. Bu nedenle, 25 mL organoid süspansiyonun hazırlanması, dağıtım için yeterli organoidlerin yanı sıra isteğe bağlı takip (tek nükleotid polimorfizmi, SNP) analizi için yeterli organoidleri sağlar (bkz. 4.4.7).
2. Organoid toplama için hazırlık
   1. Yıkama tamponunu hazırlamak için, ROCK inhibitörü (Y-27632) aDF+++'a 10 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. (taranacak her organoid kültür için ±100 mL gereklidir).
   2. Geçişten sonra organoid iyileşmesini değerlendirmek ve olası enfeksiyonları dışlamak için parlak alan mikroskobu kullanarak tüm kuyucuklardaki organoidleri inceleyin. Mikroskobik bir görüntü alarak ve organoidleri dijital bir ölçek çubuğu kullanarak ölçerek organoidlerin doğru boyutta olup olmadığını kontrol edin (Tablo 1).
      NOT: Organoidler doğru boyutta değilse (çok büyük veya çok küçük), filtreleme işleminde kaybolurlar ve ilaç taramasını üstlenmek için yeterli malzeme olmayabilir. Bu durumda, ilaç taramasının ertelenmesi tavsiye edilir.
   3. Her oyuğa 1 mg / mL dispas ekleyin ve ECM'yi sindirmek için 37 ° C'lik bir inkübatörde 30-60 dakika (maksimum 120 dakikaya kadar) inkübe edin. ECM damlalarının yüzer olup olmadığını görmek için mikroskop altında ECM ayrışmasının ilerlemesini kontrol edin. Değilse, kuyu içeriğini ECM damlacıklarının üzerine pipetleyin, bu da sindirim tamamlandığında kolaylıkla çıkmalıdır.
3. Organoidleri, aşağıdaki adımlara göre 384 oyuklu bir plakaya dağıtmak için hazırlayın. Organoid sıcaklık dalgalanmalarını azaltmak için bu adımları oda sıcaklığında (santrifüjleme dahil) gerçekleştirin.
   1. Bir p1000 pipeti kullanarak organoid süspansiyonu kültür plakasından toplayın.
   2. Gerekli filtre adımlarına bağlı olarak (organoid tipine bağlı olarak, bkz. Tablo 1), ilgili adımı izleyin.
      NOT: Organoidlerin filtreye yapışmasını önlemek için yıkama tamponlu filtrelerin önceden ıslatılması çok önemlidir.
      1. Tüm küçük parçaları ve tek hücreleri dahil ederken, örneğin HNSCC tümör organoidleri için, 70 μm'< organoidler için filtre uygularken tek filtreleme gerçekleştirin. Hasat edilen organoidleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 12 mL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Organoidleri önceden ıslatılmış 70 μm'lik bir filtreden 50 mL'lik bir tüpe süzün, filtreyi 3 x 4 mL aDF+++ ile yıkayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hacim çok yüksekse, 5 dakika boyunca 85 × g'da döndürün ve peleti 12 mL aDF+++ içinde 15 mL'lik bir tüpe aktarın; 4.3.3'e ilerleyin.
      2. Kalıntıları ve büyük organoidleri çıkarmak için çift filtreleme yapın, örneğin CRC tümör organoidleri için, >100 μm ve <20 μm organoidleri filtreleyin. Hasat edilen organoidleri hemen önceden ıslatılmış 100/70/40 μm filtre (Tablo 1) üzerinden 50 mL'lik bir tüpe süzün ve filtreyi 2 x 10 mL yıkama tamponu ile yıkayın. 6 oyuklu bir organoid plakasından üç kuyucuk başına önceden ıslatılmış 20 μm'lik bir filtre kullanın. <100 μm organoidleri 20 μm filtrelerin üzerine süzün ve filtreyi 2 x 10 mL yıkama tamponu ile yıkayın. Organoidleri filtreden temiz bir 50 mL tüpün üzerine ters çevirerek ve 3 x 4 mL aDF+++ ile yıkayarak geri kazanın. Organoid süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın; hacim >15 mL ise (daha fazla filtre yıkama gerekebilir), 85 × g'da 5 dakika döndürün ve peleti 12 mL aDF+++ içinde 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
         NOT: Filtrede sıkışan organoidler daha sonra kullanılmak üzere geri kazanılabilir (passaging); Bir sonraki adımda 100 μm'< organoidler kullanılır. Filtreden geçen hücreler ve kalıntılar atılır, filtreye takılan organoidler (>20 μm, <100 μm) tarama için kullanılır.
   3. 450 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Peletleri 1 mL tarama ortamında dikkatlice yeniden süspanse edin, başka bir 1-9 mL besiyeri ile doldurun (pelet boyutuna bağlı olarak; ~ 75-150 organoid / 10 μL'ye sahip olmayı hedefleyin) ve önceden ıslatılmış bir serolojik pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
      NOT: Tarama ortamına 5 μM ROCK inhibitörü eklenmesi önerilir.
   4. Önceden ıslatılmış bir serolojik pipet 5x ile yukarı ve aşağı pipetleyerek organoid süspansiyonu iyice karıştırın ve bir Petri kabına bir çizgi pipetleyerek ve mikroskop altında sayarak süspansiyonun 10 μL'sindeki organoidlerin sayısını sayın. Daha küçük organoidler (<70 μm) için, hemositometre ızgaralı 10 odacıklı bir slayta 10 μL organoid süspansiyon ekleyin ve organoidlerin sayısını sayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek organoid/mL sayısını hesaplayın.
   5. Buz gibi soğuk eleme ortamına %5 (h/h) ECM ekleyerek gerekli miktarda dağıtım ortamını hazırlayın (örneğin, 25 mL dağıtım ortamı için 23,75 mL buz gibi soğuk eleme ortamına 1,25 mL ECM ekleyin). ECM'nin katılaşmasını önlemek için ECM'yi yalnızca buz gibi soğuk ortama ekleyin. Birden fazla organoid modeli tararken, tüm modellerde ECM yüzdesinin tutarlılığını sağlamak için dağıtım ortamını toplu olarak hazırlayın.
   6. Gerekli sayıda organoidi ekleyin (notlar için yönergeler ve tartışmalar için Tablo 1'e bakınız) 15 mL'lik yeni bir tüpe ve 3 dakika boyunca 450 × g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan dikkatlice aspire edin ve peleti bir p200 pipeti ile 100 μL eleme ortamında iyice yeniden süspanse edin. Peletin homojen olduğundan ve herhangi bir organoid topak olmadan tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun. Daha sonra, süspansiyonu gerekli miktarda buz gibi soğuk dağıtım ortamı ile doldurun ve organoid süspansiyonu bundan böyle buz üzerinde tutun.
4. Organoidleri bir hücre dağıtıcı (örneğin, Multidrop) kullanarak 384 oyuklu plakalara dağıtın.
   1. Hücre dağıtıcısını, kuyu başına 40 μL hücre süspansiyonu dağıtacak şekilde ayarlayın.
      1. Ana menü | Plaka Tipini Seçin | Tamam | 384 standardı | TAMAM
      2. Kaset tipi standart tüp kaseti (sağ taraf) | yukarı ve aşağı okları (40 μL) kullanarak ses seviyesini seçin.
      3. Plaka düzenine bağlı olarak Tam plaka veya Sütunlar'ı seçin.
   2. Hortumu %70 etanol (EtOH) ile yıkayın, ardından steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın; yıkama başına >15 mL kullanın. Her yıkamanın başlangıcını ve bitişini görselleştirmek için her sıvı arasına biraz hava girmesine izin verin. Tüm dağıtım başlıklarının 'düz' olarak dağıtılıp dağıtılmadığını kontrol edin ve durum böyle olmadığında tekrar yıkayın.
   3. Ayarlar menüsünde, ön dağıtımı seçin ve organoid süspansiyonu primerden sonra ve dağıtımdan önce önceden dağıtmak için 60 μL'ye ayarlayın.
   4. Süspansiyonu buz üzerinde tutarken dağıtıcıyı organoid süspansiyon ile doldurun. Bir p1000 pipeti ile sürekli pipetleme yaparak yeniden askıya alın. Solüsyonda hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için dikkatli olun. Astarlandıktan ve plaka yerine oturduktan sonra, Başlat'a basarak organoidleri dağıtın.
      NOT: Bu adım iki kişiyle daha kolay yapılır: bir kişi yeniden askıya alınır ve diğeri dağıtıcıyı çalıştırır.
   5. Gerekirse, ekrana dahil olan her organoid model için, ekstra bir eleme plakasına en az 5 kuyucuk daha dağıtın.
      NOT: Bu, günün ilerleyen saatlerinde T=0 okumasına izin verecektir (bkz. bölüm 7 ve tartışma). Bu dağıtım, tercih edilirse manuel olarak da yapılabilir.
   6. Kuyuların kirlenmesini önlemek için plakanın kapağını hemen değiştirin. Mikroskop altında tüm kuyucukların doğru şekilde doldurulduğunu ve organoidlerin plaka boyunca eşit olarak dağılıp dağılmadığını onaylayın.
   7. Gerekirse, kaplama bittiğinde, organoid süspansiyonu borudan kurtarın ( Boş'a tıklayın) ve kalan organoidleri aşağı doğru döndürün. 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve daha sonra SNP analizi için hızlı dondurun.
      NOT: Dağıtım sırasında boruya hava girmişse ve bazı kuyucuklar doğru şekilde doldurulmamışsa, kuyucuk başına 40 μL ekleyerek kuyuları manuel olarak doldurun.
   8. Birden fazla organoid model dağıtılırsa, hortumu PBS, EtOH ve PBS ile durulayın ve her model için 4.4.4-4.4.8 adımlarını tekrarlayın.
   9. Plakaları, ilaç dağıtımına hazır olana kadar 37 ° C'lik bir inkübatörde% 5 CO₂ atmosferine aktarın. Farklı plakalar arasındaki hava değişimindeki farklılıkları ortadan kaldırmak için, plakaları inkübatörde istiflemekten kaçının.
   10. Hortumu PBS ve ardından EtOH ile mümkün olan en kısa sürede temizleyin. Sistemden hava geçirerek boruyu tamamen kurutduğunuzdan emin olun.

5. Gün 2 (aralık: 1 - 3. gün): Bir ilaç dağıtıcısı kullanarak İlaç Dağıtımı (örneğin , D300e)

NOT:. Araştırma sorusuna bağlı olarak, tohumlamadan bir gün sonra ilaç baskısı da yapılabilir.

1. İlaç dağıtıcısını ayarlayın
   1. Dağıtıcı yazılımını başlatın ve Plaka 1'i vurgulayarak ve plaka düzenleyiciyi getirmek için kalem aracını seçerek ekran için kullanılan istenen plaka biçimini seçin.
   2. Plaka tipini seçin ve her bir oyuğun ek hacmini ayarlayın (zaten plakada bulunan sıvı hacmi (organoid süspansiyon)). 384 kuyucuklu format için 40 μL/kuyucuk kullanın.
   3. Soldaki çubukta, ekranda kullanılacak her bir ilaç solüsyonunu eklemek için + sembolünü kullanın.
   4. Kalem aracını seçerek her sıvıyı düzenleyin. İlaç adını, ilaç sınıfını (örneğin, DMSO bazlı veya sulu (örneğin, su, PBS)) ve ilacın stok konsantrasyonunu düzenleyin.
      NOT: Her ilacın stok konsantrasyonunu 10 mM'yi aşmayın. İdeal olarak, maksimum çözücü konsantrasyonu DMSO için %0,8 ve PBS/%0,3 deterjan için %3 (örneğin, Tween) olmalıdır (aşağıdaki normalleştirmeye ve tartışmaya bakın).
   5. Programa tüm ilaçlar eklendikten sonra, plaka düzeninde bir kuyuyu vurgulayarak ve boyunca sürükleyerek ilaçların ekleneceği kuyuları seçin. Seçilen kuyucuklara sağ tıklayın ve konsantrasyonu ekleyin.
      1. Her ilacın istenen konsantrasyonunu (μM) tanımlamak için değeri ayarlayın.
      2. Titrasyon için, her bir ilacın istenen en yüksek ve en düşük konsantrasyonunu (μM), dağılımı (logaritmik veya doğrusal), seviye başına replikasyonları (örn. 3) ve titrasyon modelini tanımlayın.
      3. Hedeflenen titrasyon için, her bir ilacın en yüksek ve en düşük konsantrasyonunu, dağılımı (logaritmik veya doğrusal), hedef konsantrasyonu (μM), hedef bölgeyi (seviyeler), hedef aralığı (log), seviye başına tekrarları (örn. 3) ve titrasyon modelini tanımlayın.
   6. Tüm ilaç kuyucuklarını uygun çözücülerine normalleştirin (örneğin, DMSO veya sulu + Tween-20). Sulu çözeltiler içinde çözünen ilaçlar için, D300e kullanılarak dağıtım için ilaç çözeltisinin uygun yüzey gerilimini sağlamak için Tween-20 (ilaç stoğunda nihai konsantrasyon %0.3) ekleyin (bkz. 5.2.6). İlaç içermeyenler de dahil olmak üzere tüm kuyucukları seçin (negatif kontroller), sağ tıklayın, Normalleştirme'yi ve ardından Normalleştir'i seçin. Uygun çözücüyü seçin ve seçilen ilacın en yüksek konsantrasyonuna normalleştirmek için En yüksek sınıf hacmine normalleştir'i seçin.
      NOT: Normalleştirmeyi onaylamak için artık her kuyucuğun sol alt köşesinde siyah üçgenler görünüyor. Kullanılan her ilaç çözücüsü için en az 6 (ideal olarak >9) negatif kontrol kuyusuna sahip olmayı hedefleyin.
   7. Kültürlere bağlı olarak staurosporin gibi bilinen sitotoksik reaktifleri pozitif kontroller (1-5 μM) olarak kullanmak için en az 3 kuyucuk (ideal olarak >6) seçin. Pozitif kontrolün sitotoksik konsantrasyonu bilinmiyorsa, pozitif kontrol kuyucuklarındaki tüm organoidleri öldürmek için yüksek bir konsantrasyon seçin.
      NOT: Alternatif olarak, ilaç taraması sırasında organoid ölümünü sağlamak için Navitoclax (20 μM) kullanılabilir.
   8. Plaka düzeni tamamlandıktan sonra, sol üst köşedeki Çalıştır'ı (makine açıksa) seçin. Devam etmek için protokolü kaydedin.
      NOT: Program şimdi dağıtım için her ilacın gerekli hacmini hesaplamıştır. Buna pipetleme hatası da dahil olduğundan, bu, tüm protokol için gereken tam ilaç miktarıdır. İsteğe bağlı: Simüle Et'in seçilmesi, protokolün nasıl çalışacağını gözlemlemek için tüm protokolün benzetimini (ilaç eklemeden) yapar. Hem Çalıştırma hem de Simülasyon modlarında, her bir kuyucuğa eklenen ilaçların zamanını, sırasını ve hacimlerini belgeleyecek bir rapor oluşturulur. Bu, protokolün doğru olduğundan emin olmak ve deneye devam etmeden önce gerekli olacak kasetlerin tam hacmini ve sayısını belirlemek için yararlı olabilir.
2. İlaçları hazırlayın ve yazdırın
   1. D300e kullanılarak dağıtım için ilaç çözeltisinin uygun yüzey gerilimini sağlamak için sulu (örn. su veya PBS) ilaç stoklarına %0,3 (h/h) Tween-20 ekleyin. Tween-20 konsantrasyonunun %3 PBS/%0.3 Tween-20'yi (h/v) aşmadığından emin olun ve Tween-20'nin nihai konsantrasyonunu %0.01'in altında tutun.
      NOT: Tween-20'yi ilaç yazıcı kasetine eklemeden hemen önce ilaç stoklarına ekleyin, çünkü stoktaki yüksek Tween-20 konsantrasyonu potansiyel olarak (protein bazlı) ilaçları (örn. antikor bazlı ilaçlar) etkisiz hale getirir. Bu adım, DMSO'da çözünen ilaçlar için gerekli değildir; bununla birlikte, her bir kuyucuktaki DMSO'nun nihai yüzdesinin% 0,8-1'i geçmediğinden emin olun.
   2. Hem D8+ düşük hacimli hem de D4+ yüksek hacimli kasetleri hazır bulundurun. Yüksek hacimlerde normalizasyon sıvısı kullanırken programda yüksek hacimli kasetler kullanın seçeneğini işaretleyin.
   3. İlaçları dağıtmaya başlamak için protokolü çalıştırın.
      NOT: Program protokolü adım adım çalıştıracak ve her bir bileşiğin ne zaman ve ne kadar eklenmesi gerektiğini gösterecektir. Yüksek konsantrasyonlarda ilaçları işlemek için filtre uçlarını kullanın. Kimyasal atıkları ve kullanılmış ipuçlarını biyogüvenlik yönergelerine uyarak atmaya dikkat edin.
   4. Protokol bittiğinde, yapışkan hava ve sıvı geçirgen contalar kullanın (örneğin, poliüretan tıbbi sınıf plaka contaları; Malzeme Tablosu) plakaları örtmek ve plakaları 37 °C, %5 CO_2'ye geri döndürmek için.
      NOT: Bu contaların kullanılması "kenar etkisi" buharlaşmasını önler (tartışmaya bakın). Contaları kullanmıyorsanız, plakanın dış kenarlarının ilaç ekranında kullanılmadığından emin olun. Plakaları üst üste istiflemeyin ve plakaların inkübatörün arkasına doğru tutulduğundan emin olun veya sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için (sık sık) açılmayan bir inkübatör kullanın.
   5. Radyoterapi basılı ilaçlarla kombine ediliyorsa, bölüm 6'ya geçin. Değilse, plakaları 5 gün boyunca inkübatörde bırakın.
      NOT: Organoid tipine ve ilaç tipine bağlı olarak, bazı deneyler 5 günden daha uzun sürebilir. >7 gün süren deneyler için, negatif kontrol kuyucuklarında geniş hücre ölümünü önlemek için ortamı ve bileşikleri deneysel prosedürün yarısında (örneğin, ortamın %50'sini yeni tarama ortamıyla değiştirerek) dikkatlice değiştirin.

6. Gün 2 (aralık: 2 - 4. gün): Foton ışını radyasyonu kullanılarak organoidlerin tedavisi

NOT: Aşağıdaki adımlar organoidlerin ışınlanmasını açıklamaktadır. İlaç bileşiklerinin radyo-duyarlılaştırıcı etkilerini değerlendirmek için, organoidler kemoterapiye maruz kaldıktan 24 saat sonra ışınlama yapılır. Aynı protokol, tek başına ışınlamanın etkilerini değerlendirmek için kullanılır, burada organoidler tohumlamadan 24 saat sonra tohumlanır ve ışınlanır. Bu, hipoteze ve organoid kültürlere bağlı olarak bir miktar optimizasyon gerektirebilir. Aşağıdaki adımlar, özel olarak oluşturulmuş 6 MV foton ışınları kullanarak organoidleri ışınlamak için kullanılan işlemi açıklamaktadır (Malzeme Tablosu). Bu makine klinik uygulamalar için optimize edilmiştir ve bu nedenle gerçek klinik uygulamayı yansıtır. Farklı makineler farklı bir kurulum gerektirebilir ve ayrıca verimli doz seçilenden farklı olabileceğinden dozlamanın optimizasyonunu gerektirebilir.

1. Plakaları 37 °C inkübatörden çıkarın ve kapakları contaların üstündeki her plakaya geri koyun; Contaları çıkarmayın. Kontrol plakasının aynı koşullara maruz kaldığından emin olmak için bu işlem sırasında 0 Gy plakasını yanınıza alın.
2. Organoidleri ışınlayıcıya taşıyın. Plastik bir kutuyu ılık musluk suyuyla doldurarak ışınlama cihazını kurun ve plakanın yüzmesini önlemek için plaka tutucuya sabitleyin.
3. Plakayı, plakanın üst yüzeyi ile aynı hizada olacak şekilde suya batırın. Plakanın yüzmesine izin vermeyen bir aparat kullanarak plakayı yerine sabitleyin (videoda gösterildiği gibi). Odadan çıkın ve plakaları artan dozlarda ışınlayın (ör., 1, 2, 4, 6, 8 ve 10 Gy). Bir plaka yığını eşit bir radyasyon dağılımına izin vermediğinden, bir seferde yalnızca bir plakayı ışınlayın.
   NOT: Bir doz-yanıt eğrisi elde etmek için uygun ışınlama dozlarının seçildiğinden emin olun.
4. Dokularla ışınladıktan sonra plakaları iyice kurulayın ve sert kapağı değiştirin. Plakaları kültür odasına geri taşıyın. Sert kapağı çıkarın ve her plakanın dışını hafifçe püskürtülmüş EtOH dokularıyla silin. Nefes alabilen contaları çıkarmayın.
5. Kapının açılmasından kaynaklanan sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için plakaları inkübatörün arkasına yerleştirin; Plakaları üst üste koymayın.

7. Gün 2. İsteğe bağlı: CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi (CTG) ölçüm plakası T=0 (GR analizi için gereklidir)

1. GR metriklerini hesaplamayı hedefliyorsanız (bkz. 11.3.5 ve tartışma), 9.1-10.4 adımlarını izleyerek T=0 plakasındaki CTG değerlerini ölçün.

8. İlaç taramasından bir gün önce okuma: hazırlık

1. Gereken toplam CTG hacmini hesaplayın. 384 oyuklu bir plaka için, oyuk başına 40 μL CTG kullanın (üreticinin tavsiyesine göre CTG 1: 1 ekleyin). Çoklu damla dağıtımı için ölü hacmi (tüp başına 1 mL) hesaba katın. CTG'yi gece boyunca 4 °C'de ışıktan koruyarak çözdürün.
2. Dağıtıcının kalibrasyon gerektirip gerektirmediğini test edin.

9. Gün 7 (aralık: 7 - 14. gün): İlaç taraması okuması: CTG Testi

1. CTG'nin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Okumadan önce 384 oyuklu plakanın tüm kuyularını görsel olarak inceleyin, herhangi bir enfeksiyon olup olmadığını kaydedin.
2. İlgili kuyuları parlak alan mikroskobu altında görüntüleyin. Pozitif kontrolleri (staurosporin), negatif kontrolleri (normalizasyon kuyuları) ve her ilacın en yüksek konsantrasyonunu dahil edin.
3. Multidrop makinesini bölüm 4.4'te açıklanan adımlara göre yıkayın ve astarlayın. Plaka kurulumuna göre her kuyucuğa 40 μL CTG dağıtın. Multidrop dağıtıcının (Çalkalayın) plaka çalkalayıcısını kullanarak 5 dakika çalkalayın ve 25 dakika boyunca ışıktan koruyarak oda sıcaklığında inkübe edin.
   NOT: CTG reaksiyonu enzimatik bir reaksiyondur ve bu nedenle sıcaklık ve inkübasyon süresinden etkilenir. Sinyalin 30-60 dakika boyunca sabit olduğu varsayılıyor; bununla birlikte, özellikle GR metriklerini hesaplarken tüm plakalar için aynı inkübasyon süresinin kullanılması doğruluğu artırır.

10. CTG biyolüminesans ölçümleri

1. 384 kuyu kapasiteli biyolüminesans plaka okuyucuyu ve bilgisayarı açın. Burada bir Spark plaka okuyucu kullanılmıştır.
2. Spark yöntem düzenleyicisi yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın). Plaka formatını seçin: COS384fb-Corning 384 düz siyah | kapaksız | nem kaseti yok; Ölçülmesi gereken kuyuları seçin.
3. Sol alttaki menüde Algılama | Lüminesans ve plakanın altına sürükleyin. Tür: zayıflama, ikinci menü: yok. Entegrasyon süresini [ms]: 500 olarak ayarlayın.
4. Plakayı yerleştirin, seçin ve Başlat'a tıklayarak yöntemi çalıştırın. Dışa aktarılan elektronik tabloyu kaydedin.

11. Veri analizi

1. Ekran kalitesini değerlendirmek için Z faktörünü (Z') hesaplayın.
   1. Hem negatif (Ctrl^neg, örneğin, DMSO) hem de pozitif (Ctrl^pos, örneğin, Staurosporine) kontrollerin ortalama (Av ) ve standart sapmalarını (SD'ler) hesaplayın.
   2. Z faktörünü hesaplayın = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl ^pos]).
      NOT: Z', pozitif ve negatif kontroller arasındaki değişimi ve oransal boşluğu ifade eder ve bu nedenle tahlilin¹³ dinamik aralığı için bir ölçüdür. Z' değeri 0.3'ten düşük olan ilaç tarama sonuçlarını hariç tutun; Z' > 0,5 olan verilerin kullanılması önerilir. Ortalama Z' genellikle 0,5 ile 0,7 arasında değişir (kullanılan organoid modellere bağlı olarak). Z'nin bilgilendirici olması için, pozitif kontrol kuyucuklarındaki tüm organoidlerin ölmüş olması gerekirdi.
2. Ctrl^neg'i %100'e ve Ctrl^pos'u %0 canlılığa ayarlayarak her kuyucuk için nispi organoid canlılığını hesaplayın.
   1. Organoid canlılığını hesaplamak için bu formülü kullanın.
      Organoid canlılık =% 100 × (deneysel kuyu değeri - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Işınlanmış organoidler için yüzde değerini hesaplayın.
         Organoid canlılık yüzdesi =% 100 × (x GY'nin deneysel kuyu değeri) / (0 GY'nin Av Ctrl^neg kuyu değeri)
   2. Canlılık verilerini bir xy tablosuna kopyalayarak, konsantrasyon başına uygun sayıda çoğaltma değerini seçerek verileri bir veri analizi yazılım programında görselleştirin.
   3. Logaritmik ilaç konsantrasyonları için, ilaç konsantrasyonlarını dönüştürün ve bu değerleri tablonun ilk sütununa kopyalayın.
   4. Grafiği biçimlendirmek için grafik türünü (XY) seçin, ortalamanın standart hatasını (SEM) seçin ve başlangıç noktasını sol alt kısma ayarlayın.
3. Göreli IC₅₀, eğrinin altındaki alan (AUC) ve GR ölçümlerini belirleyin.
   1. Doğrusal olmayan regresyon için, Analiz sekmesinde doğrusal olmayan regresyon ile bir eğri sığdır'ı seçin. Bir öldürme eğrisi oluşturmak için günlük (inhibitör) ve normalleştirilmiş yanıt - değişken eğim seçeneğini seçin.
   2. Her ilaç için ilgili IC_50'yi görüntülemek için Sonuçlar sekmesine tıklayın.
      NOT: Bu, eğrinin alt ve üst kısmı arasında bir yanıt veren ilacın konsantrasyonudur. Alt ve üst, y ekseninin birimlerindeki platolardır.
   3. Eğrinin altındaki alan (AUC) için, Analiz sekmesinin altında Eğri Altındaki Alan'ı seçin, önceden tanımlanmış ayarları kullanın ve Tamam'ı seçin.
   4. Her ilacın AUC'sini (toplam alan) görüntülemek için Sonuçlar sekmesine tıklayın.
      NOT: AUC, bir ilaç etkisinin kümülatif ölçümü olarak kullanılan, ölçülebilir bir etkinin entegre bir ölçümüdür. Antikorlar gibi bazı moleküllerde doz-yanıt eğrisi sigmoidal şekilli değildir ve IC₅₀ değerlerinin yorumlanması zordur. Böyle bir durumda, AUC değerleri, organoid çizgiler arasındaki farkları karşılaştırmak için bir metrik olarak daha fazla bilgi sağlayabilir.
   5. Alternatif olarak, CTG ölçümleri 2. günde alınırsa (isteğe bağlı adımlar 4.4.5 ve bölüm 7), GR ölçümlerini hesaplayın. Daha tekrarlanabilir ve hassas ölçümler sağlamak için bir ilaç taraması boyunca organoid modeller arasındaki çoğalma oranındaki farklılıkları dikkate alarak çevrimiçi bir GR hesaplayıcı¹⁴ kullanarak GR ölçümlerini analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu deneyin amacı, HNSCC organoidlerinin tek ajanlar olarak kemoterapi ve radyoterapiye duyarlılığını incelemektir. Ayrıca, deneyi bir hafta arayla birden çok kez yürüterek sonuçların tekrarlanabilirliğini test ettik ve bu da birkaç biyolojik kopya ile sonuçlandı (deney 1-3) (Şekil 2). Protokolü takiben, 0. günde, HNSCC PDO'lar 6 oyuklu 6 oyuklu bir plakadan hasat edildi ve enzimatik ve mekanik olarak tek hücrelere (veya 70 μm'< küçük ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu makale ve videoda, PDO'lar kullanılarak orta verimli ilaç taramasının nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Bu protokol, optimizasyonla, burada tarif edilenlerden farklı doku tiplerinden türetilen organoidleri taramak için uyarlanabilir. Ekrandan önce ideal geçiş zaman diliminin belirlenmesi önemlidir, çünkü bu, bireysel organoid kültürler için değişecektir ve doku tipine bağlı olacaktır. Kuyu başına ekilen organoidlerin yoğunluğu ve boyutu, daha ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel