İnsan Retinoblastomunu In Vitro Yeniden İnşa Etmek

Özet

İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC) bialelik RB1 mutasyonlarını tanıtarak insan retinoblastomu (RB) üretmek için bir yöntem tanımladık. RB hücre hatları, bir tabakta izole RB kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenebilir.

Özet

İnsan RB'si pediatrik kanserdir ve tedavi uygulanmazsa öldürücüdür. RB, kemirgen modellerinde nispeten nadir görülen koni öncüllerinden kaynaklandığından, insanlar ve kemirgenler arasındaki türler arası farklılıklarla ilgili olarak, insanlardan türetilen bir hastalık modeli, insan RB'sinin mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve tedavinin hedeflerini aramak için daha faydalıdır. Burada protokol, sırasıyla bialelik RB1 nokta mutasyonu (RB1 Mut ^{/ Mut}) ve bir RB1 nakavt mutasyonu (RB1-^/-) ile iki gen düzenlenmiş hESC hattının oluşumunu açıklamaktadır. Retina gelişimi sürecinde RB oluşumu gözlenir. RB hücre hatları ayrıca RB organoidlerinden ayrılarak da kurulur. Toplamda, gen düzenlenmiş hESC hatlarını retinal organoidlere 2D ve 3D kombine farklılaşma protokolü kullanarak farklılaştırarak, insan RB'sini bir tabakta başarıyla yeniden yapılandırdık ve koni-öncü kökenini belirledik. Retinoblastoma oluşumunu, proliferasyonunu ve büyümesini gözlemlemek ve yeni terapötik ajanların daha da geliştirilmesi için yararlı bir hastalık modeli sağlayacaktır.

Giriş

İnsan retinoblastomu (RB), retinal koni öncüllerinden ^1,2,3 köken alan nadir görülen^, ölümcül bir tümördür ve çocukluk çağında en sık görülen göz içi malignite tipidir 4. RB1 geninin homozigot inaktivasyonu, RB^5'te başlatıcı genetik lezyondur. Bununla birlikte, RB1 mutasyonlarına sahip fareler retinal tümör^2'yi oluşturamaz. Fare tümörleri Rb1 mutasyonlarının ve diğer genetik modifikasyonların kombinasyonu ile üretilebilse de, hala insan RB^6'nın özelliklerinden yoksundurlar. Retinal organoid farklılaşmasının gelişmesi sayesinde, insan RB^1'in karakterlerini gösteren hESC türevi RB elde edilebilir.

Son on yılda, retinal organoid farklılaşması için 2D⁷, 3D⁸ ve 2D ve 3D^9'un bir kombinasyonu da dahil olmak üzere çok sayıda protokol oluşturulmuştur. Burada insan RB'sini üretmek için kullanılan yöntem, yapışkan kültürün ve yüzen kültürün konsolidasyonudur⁹. RB1 mutasyona uğramış hESC'yi retinal organoidlere ayırarak, RB oluşumu yaklaşık 45. günde tespit edilir ve daha sonra 60. günde hızla çoğalır. 90. günde, RB'lerin izolasyonu ve RB hücre hattının oluşturulması mümkündür; Ayrıca, RB 120. günde neredeyse tüm retinal organoidleri çevreler.

hESC kaynaklı RB, RB'nin kökenini, tümörigenezini ve tedavilerini araştırmak için yenilikçi bir modeldir. Bu protokolde, gen düzenleme hESC'nin üretimi, RB'nin farklılaşması ve RB için karakterizasyon ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Protokol

Bu çalışma, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden temin edilmektedir.

1. RB1 mutasyona uğramış hESC üretimi

1. RB1'in nakavtı (KO) için CRISPR / Cas9 hedefleme vektörü.
   1. Bir çift sgRNA tasarlayın. RB1'in ablasyonu için, bu genin ilk ekzonunu hedefleyin. İleri astar dizisi CACCGCGTGGCGGCCGTTTTTCGG ve ters astar dizisi AAACCCGAAAAACGGCCGCCCCCCACCGC'dir.
      NOT: Belirli RB1 mutasyonu için, onarılmış bir şablon da gereklidir. Bu protokolde örnek olarak RB1-KO hücre hattı kullanılmıştır.
   2. Üreticinin talimatlarını izleyerek 1 μg pX330-U6-Kimerik BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro'yu BbsI kısıtlama enzimleri ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de 30 dakika boyunca sindirin.
   3. Sindirilmiş plazmidleri, üreticilerin talimatlarına göre bir saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
      NOT: Enzimatik reaksiyonlar, saflaştırma kiti kullanılarak agaroz jeli olmadan doğrudan temizlenebilir (bkz.
   4. T4 polinükleotid kinaz (PNK) (Malzeme Tablosu) kullanılarak her bir oligo çiftini fosforilat ve tavlama, 1 μL oligo1 (100 μM), 1 μL oligo2 (100 μM), 1 μL 10x T4 Ligasyon Tamponu, 6.5 μL ddH₂O ve 0.5 μL T4 PNK'dan oluşan reaksiyonla.
      NOT: Adım 1.1.1'deki ileri ve geri primerler bir çift oligodur. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termosikler içindeki oligoları fosforile edin ve tavlayın: 30 dakika boyunca 37 ° C; 5 dakika boyunca 95 °C; dakikada 5 °C'de 25 °C'ye kadar rampa.
   5. Oda sıcaklığında (RT) 199 μL nükleaz içermeyen suya 1 μL oligo reaktifi ekleyerek fosforile edilmiş ve tavlanmış oligoları 200 kez seyreltin.
   6. Ligasyon reaksiyonunu ayarlayın ve aşağıdakileri karıştırarak RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin: Adım 1.1.3'ten 50 ng Bbs1 sindirilmiş plazmid, adım 1.1.5'ten 1 μL oligo dubleks, 5 μL 2x ligasyon tamponu, 1 μL ligaz ve nükleaz içermeyen su kullanarak 10 μL'ye kadar doldurun.
   7. Ligasyon karışımını dönüştürün ve bir sonraki adım için pozitif kolonileri sıralayın.
      NOT: Sıralama için U6 ileri veya geri astar kullanın.
      1. Yetkin hücreleri buz üzerinde çözün.
      2. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yetkin hücrelerin 50 μL'sini alın.
      3. Ligasyon karışımının 1 μL'sini 1.1.6 adımından yetkin hücrelere ekleyin.
      4. Tüpü üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırın.
         NOT: Girdap yapmayın.
      5. Karışımı 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
      6. Karışımı 42 °C'de 90 sn için ısıtın.
      7. Tüpe antibiyotiksiz 950 μL oda sıcaklığında Luria-Bertani (LB) suyu ekleyin.
      8. Tüpü 60 dakika boyunca 37 ° C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
      9. LB plakalarını (pepton, kazeinden pepton, sodyum klorür, agar-agar ve ampisilin) önceden 37 ° C'ye ısıtın.
      10. RT'deki plakalara 50-100 μL hücre ve ligasyon karışımı yayın.
      11. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      12. Plakadan 12 koloni alın ve bunları ampisilin ile LB ortamına aktarın. Ortamı 60 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
      13. PCR için şablon olarak bakteri çözeltisinin 1 μL'sini (adım 1.1.7.12'den) kullanın ve pozitif kolonileri seçin.
      14. Pozitif kolonileri U6 primerleri ile sıralayın, bir sonraki adımda tasarlanan sgRNA dizileri ile koloniyi kullanın.
   8. Plazmidi bir midi kiti kullanarak çıkarın (bkz.
      NOT: Mini kit kullanan plazmidin kalitesi ve miktarı, aşağıdaki nükleofeksiyon deneyi için yeterli değildir. Midi veya maxi kit, mini kitten daha uygundur.
2. HESC kültürü ve nükleofeksiyonu.
   NOT: Tüm reaktifleri RT'ye önceden ısıtın.
   1. 1 x 10 6 H9 hücrelerini, 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) ve 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren önceden kaplanmış⁶ delikli bir plakaya çözün.
      NOT: 6 delikli plakayı, kullanımdan önce 37 °C'de en az 30 dakika boyunca %1 Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi ile kaplayın.
   2. Ertesi gün, süpernatanı çıkarın, hücreleri 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile durulayın ve ardından 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ekleyin.
   3. Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa ulaşana kadar takip eden 3-5 gün içinde ortamı 2 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ile her gün değiştirin.
   4. hESC'nin durumunu ayarlamak için bir veya iki kez geçiş.
      NOT: hESC'nin durumunu tanımlamanın en kolay yolu morfolojidir.
   5. Farklılaşmamış H9 hücrelerini% 80 akıcılığa ulaşana kadar 6 delikli bir plakada kültürleyin.
   6. 10 μM Y-27632 ile karıştırılmış 2 mL taze ncEpic-hiPSC/hESC kültür ortamı ile nükleofeksiyondan 2 saat önce ortamı değiştirin ve% 1 Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi kullanarak 12 delikli bir plakanın bir kuyuğunu önleyin.
   7. Ortamı aspire edin ve 1 mL önceden ısıtılmış DPBS ile durulayın.
   8. DPBS'yi çıkarın ve 37 ° C'de 3,5 dakika boyunca 1 mL hücre ayrışma enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
   9. H9 hücrelerini tek hücreli bir süspansiyon haline getirmek için hücrelere 1 mL taze ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve pipet iki kez ekleyin.
   10. Hücre sayımı için karışımın 100 μL'sini çıkarın ve kalanını içinde 2 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
   11. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve yaklaşık 2 x 10⁶ hücreyi 100 μL reaksiyon hacmine geri sarkıtın. Üreticinin protokolüne göre, hücreler, plazmidler, nükleofektör ve reaksiyon koşulları için hacmi optimize edin. Bu protokolde kullanılan nükleofeksiyon sistemi için Malzeme Tablosuna bakınız.
       NOT: Genel olarak, nükleofeksiyon sırasında kabarcıklara izin verilmez.
   12. Transfeksiyondan sonra, hücreleri önceden kaplanmış 12 delikli plakaya aktarın, 1.5 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve 10 μM Y-27632 ile takviye edin ve daha sonra hücreleri 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde kültürleyin.
   13. Ortamı günlük olarak değiştirin. 48 saat sonra, bir hafta civarında hücre seçimi için 2 μg / mL puromisin ekleyin.
       NOT: İlk 3 gün boyunca çok sayıda hücre ölür. Kalan hücreler çoğalabilir ve puromisin seçiminden sonraki hafta içinde koloniler halinde üretebilir. Seçim haftasında, ortamın her zaman 2 μg / mL puromisin içerdiğinden emin olun.
   14. Kolonileri mikroskop altında manuel olarak seçin.
       NOT: Koloni morfolojisi hES kolonisi ile aynıdır. Kolonileri, ortamda 10 μL beyaz / normal pipet ucu ile parçalara ayırın (koloni başına 2-6 adet) ve bir koloniyi 12 delikli bir plakanın önceden kaplanmış bir kuyucuğuna aktarın.
   15. İlk olarak, RB1 mutasyonlarını ve hedef dışı durumları tanımlayın (Tablo 1) ve ardından RB1 nakavt H9 hücre hattını karakterize etmek için pluripotensi.
       NOT: PCR ve sanger dizilimini kullanarak RB1 mutasyonlarını ve hedef dışı durumları tespit edin. RT-PCR ve İmmünofloresan ile pluripotens belirteçlerini tanımlayın.

2. İnsan retinoblastomunun oluşumu

1. RB1-KO hESC'nin bakımı.
   1. Kültür gen-düzenlenmiş H9 hücreleri bir Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matris kaplı 6 delikli plaka ile 2 mL ncEpic-hiPSC / hESC kültür ortamı ve her gün ortamı değiştirin.
   2. EDTA tamponunu kullanarak 37 °C'de 3,5 dakika veya RT'de 5 dakika boyunca geçiş.
      NOT: EDTA tamponu, 1x DPBS, 5 mM EDTA ve 0.9 mg / mL NaCl karışımıdır.
2. Retinal hücre farklılaşması.
   NOT: Farklılaştırmadan önce Medium I'i hazırlayın. Orta I'i hazırlamak için, 24.5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Besin Karışımı F-12 (F12)-Glutamin (1x), 24.5 mL Nöronal bazal ortam, 250 μL 100x takviyesi A, 500 μL 50x takviyesi B, 0.1 mM ß-merkaptoetanol ve 250 μL 100x L-glutamin karışımı. Kullanmadan önce tüm karışımları RT'ye önceden ısıtın.
   1. RB1-KO hESC'yi 6 delikli plakanın bir kuyucuğunda %80 birleşime kadar büyütün.
   2. Ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x DPBS ile durulayın.
   3. Hücre kolonilerini 1 mL dispase tamponu kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu) 37 °C'de 5 dakika boyunca yükseltin.
      NOT: Hücre kolonilerini mikroskop altında kontrol edin. Genellikle, kolonilerin kenarının ortaya çıkması 5 dakika sürer.
   4. Dispase tamponunu aspire edin ve hücreleri 1 mL 1x DPBS ile bir kez nazikçe durulayın.
   5. Kuyuya 1 mL Orta I ekleyin.
   6. Kolonileri, ortada 10 μL beyaz/normal pipet ucu ile parçalara ayırın (koloni başına 6-9 adet).
      NOT: Genel olarak, hücrelerin yaklaşık% 60-70'i kuyudan ayrılır. Ortamdaki kalan hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
   7. Tüm hücreleri, 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 mL'lik bir tüpte santrifüj yaparak toplayın.
   8. Ortamdaki hücreleri dağıtmak için süpernatantın yaklaşık 50 μL'sini bırakın ve daha sonra hücreleri 250 μL Büyüme faktörü ile karıştırın ve nazik ajitasyonla azaltılmış bazal membran matrisini karıştırın.
      NOT: Kullanmadan önce Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisini 4 °C'de veya buz üzerinde tutun. Aliquoted edilir ve -20 ° C'de saklanırsa, kullanımdan önce gece boyunca veya en az 1 saat önce 4 ° C'ye yerleştirin.
   9. Asılı hücrelerle birlikte 15 mL'lik tüpü 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun.
      NOT: Hücrelerin ve Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisinin katılaşmış bir jel oluşturduğundan emin olun.
   10. 15 mL tüpe 1 mL Orta I ekleyin ve ardından kümeyi 1 mL'lik bir pipetle dağıtmak için katılaşmış jeli iki ila üç kez hafifçe pipetin.
   11. 9 mL Orta I ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın.
   12. Çanağı% 5 CO₂ ile 37 ° C'lik bir inkübatöre taşıyın ve günü 0. gün olarak ayarlayın.
   13. 1. günde mikroskop kullanarak hücreleri inceleyin.
       NOT: Çanakta binlerce içi boş kist görülebilir. Ortalama olarak, bir parça jelde 3 ila 4 kist gözlenir.
   14. 5. günde ortamı değiştirin. Süpernatantı 15 mL'lik bir tüpe toplayın, kistlerin dibe çökmesini bekleyin ve ardından ortamı çıkarın ve taze Orta I ile değiştirin.
       NOT: Ortam 4. günde sararırsa, ortamı 4. günde, aksi takdirde 5. günde değiştirin. Orijinal yemeğe 10 mL taze Orta I ekleyin. Yüzlerce kist zaten kültür yüzeyine bağlanmıştır; onları orada tutun.
   15. Tüpteki kistleri iki adet 10 cm'lik kaba dağıtın.
       NOT: Bir tabakta en az 300 kist olduğundan emin olun. Kistler birleşmiş değilse, kistleri diğer bulaşıklara ayırmayın; onları orijinal 10 cm'lik tabağa geri getirin.
   16. 7. günde, çoğu kist (% 95'in üzerinde) yemeğe bağlanır, yayılır ve yapışkan koloniler oluşturur.
       NOT: 3. gün gibi erken bir tarihte, yapışkan koloniler gözlemlenebilir.
   17. 10. günde, ortamı taze Orta I ile değiştirin.
   18. Aşağıdakileri karıştırarak bir sonraki adımdan önce Medium II'yi hazırlayın: 36 mL DMEM, 12 mL F12, takviye B'nin% 2'si (v / v), 0.1 mM MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA).
   19. Hücrelerin 13-17. güne kadar yayıldığından emin olun. Hücrelerin yayıldığı ancak komşu kolonilerle etkileşime girmediği 15. günde bir sonraki adımı uygulayın.
   20. Hücreleri 1 mL DPBS ile bir kez durulayın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1 mL dispase çözeltisi ekleyin.
       NOT: 5 dakika içinde hücrelerin kenarı yükselir.
   21. Dispase tamponunu çıkarın ve kültürleri 1 mL 1x DPBS ile nazikçe durulayın.
   22. Her 10 cm'lik çanağa ve kültüre 37 °C, %5 CO₂ inkübatörde 10 mL Orta II ekleyin.
   23. Yapışkan kültürler 24 saat sonra kendiliğinden ayrılır ve retinal organoidlere birleşir.
       NOT: Organoidleri oluşturmayan çok sayıda hücre takip eden 2 gün içinde ölecektir.
   24. Ayrılmadan üç gün sonra, hücreleri hücre kültürü kabından toplayın ve organoidlerin 15 mL'lik bir tüpe yerleşmesine izin verin.
   25. Süpernatantı tüpten çıkarın ve organoidleri takip eden dört gün boyunca 10 mL Orta II ile yeni bir yapışkan olmayan kaba (Petri kabı) aktarın.
   26. DMEM'yi karıştırarak Orta III'ü hazırlayın: F12'yi 3: 1 oranında (v / v), % 2 takviye B (v / v), 0.1 mM MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi (NEAA), % 8 Fetal Sığır Serumu (FBS) (v / v), 100 μM Taurin ve 2 mM Glutamin.
   27. Ayrılmadan bir hafta sonra, ortamı Orta III olarak değiştirin.
   28. Bu günden itibaren, organoidleri Orta III'te kültürleyin ve haftada iki kez ortamı yenileyin.
3. RB hücre hattının kurulması.
   NOT: Tüm reaktifler RT'de önceden ısıtılır.
   1. 90. günde, RB'ler (%80-%90) retinal organoidleri kapsar. Bu nedenle, RB hücre hattının oluşturulması için 90 günlük RB organoidlerini seçin.
   2. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 ortamını %10 FBS ile karıştırarak 1640 ortamını hazırlayın.
   3. RB'yi RPMI-1640 ortamında mikroskop altında mikrocerrahi bir bıçakla parçalara ayırın (RB başına 20-25 adet).
   4. RPMI-1640 ortamını çıkarın ve parçaları 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.25 Tripsin / EDTA ile tedavi edin.
   5. Reaksiyonu sonlandırmak için RPMI-1640 ortamını ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
   6. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 1640 ortamında yapışkan olmayan bir kapta yeniden askıya alın.
   7. RB hücre hattı yüzen bir kültürdür. Ortamı haftada iki kez değiştirin ve RB hücrelerini 2 hafta içinde geçirin.
      NOT: Primer RB hücrelerinin proliferasyon hızı oldukça yavaştır.

Sonuçlar

RB üretiminin prosedürü, yapışkan ve yüzen kültürü birleştiren Şekil 1'de açıklanmıştır. İnsan RB'sini RB1-KO hESC'den toplamak ve RB organoidlerini izole ederek RB hücre hattını elde etmek mümkündü.

Burada, protokol farklı aşamalardaki farklılaşmanın ayrıntılarını sağlar (Şekil 2). İlk 3 gün içinde kültür yüzeyine yapışan ve daha sonra genişleyen içi boş küreler oluşur (

Tartışmalar

İnsan retinoblastomu (RB), RB1'in inaktivasyonu ve Rb proteininin işlev bozukluğundan kaynaklanır. Bu protokolde, RB1-KO hESC, bir tabakta RB üretimi için çok önemli bir adımdır. RB1^-/- hESC ile bile, retinal organoid farklılaşma¹⁰ yöntemlerine bağlı olarak RB oluşumunun olmaması mümkündür. Bu protokolde, yapışkan kültürden yüzen kültüre geçiş, farklılaşma sürecinde esastır. Kistlerin yoğunluğu, pluripotent kök hücre tipler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML