Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Özet

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Özet

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için elektronlu biyolojik örneklerin görüntülenmesi, ilgi çekici biyomolekülleri içeren ince bir vitreus buz tabakası gerektirir. Son yıllarda tek parçacıklı cryoEM'i yapısal biyolojinin ön saflarına taşıyan çok sayıda teknolojik ilerlemeye rağmen, numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için vitrifiye edildiği yöntemler genellikle hız sınırlayıcı adım olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda çok sayıda çaba, yeni örnek desteklerinin geliştirilmesi ve yenilikçi vitrifikasyon enstrümantasyonu da dahil olmak üzere numune vitrifikasyonu sırasında sıkça karşılaşılan engellerin üstesinden gelmek için araçlar sağlasa da, geleneksel manuel olarak işletilen piston, düşük satın alma maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle cryoEM topluluğunda temel bir unsur olmaya devam etmektedir. Burada, tek parçacıklı cryoEM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu için standart, giyotin tarzı elle çalıştırılan blot ve dalma cihazını kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, standart bir preparat uygun bir numune veremediğinde sık karşılaşılan sorunlar ve sorun giderme önerileri de açıklanmıştır.

Giriş

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM), dinamik biyolojik örneklerin yapılarını atoma yakın çözünürlüğe çözmek için kullanılabilecek güçlü bir yapısal tekniktir1,2,3,4. Nitekim, doğrudan elektron dedektörü teknolojilerindeki son gelişmeler4,5,6,7,8,9,10, elektron kaynaklarında iyileşmeler4,11....

Protokol

1. Manuel dalma ortamını hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: 5-30 dakika

1. Manuel pistonu, odayı %100 bağıl neme (RH) yakın tutmak için bir nemlendiricinin birlikte bulunabileceği 4 °C soğuk bir odada bulun (Şekil 1A).
   DİkKAT: Manuel pistonun güvenli konumu ve önerilen işlemler için lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın.
2. Izgara hazırlamadan önce, soğuk odanın RH'sinin% 95'≥ emin olmak için soğuk odadaki nemlendiriciyi açın.
   NOT: Düşük nemde ızgara hazırlığı, ince filmlerin susuz kalmasına, buharlaşmaya bağlı tampon bileşenlerinin değiştirilmesine ve şebekeden ....

Sonuçlar

Burada açıklanan blot ve dalma protokolünün başarılı bir şekilde yürütülmesi, elektron mikroskobu altında gözlemlenebilen altıgen buz, kirleticiler ve kullanılamaz buzun büyük gradyanlarından arınmış ince, düzgün bir vitreus buz tabakası ile sonuçlanacaktır (Şekil 3). Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyi ile tutarsız teması, şişkin kağıdın zamanından önce çıkarılması veya ızgara teması sırasında şişkin kağıdın hareket ettirilerek vitreus .......

Tartışmalar

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu, başarılı yapı tespiti için kritik öneme sahip bir adım olmaya devam etmektedir. Bu protokolde açıklanan manuel blot-and-plunge yöntemi, cryoEM görüntüleme için ince vitreus buz filmlerindeki biyolojik örneklerin hızlı bir şekilde dondurulması için uygun maliyetli, güvenilir ve sağlam bir yöntemi temsil eder. Araştırmacılar, el yazmasında belirtilen yöntemleri kullanarak ma.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 slot grid storage box	Ted Pella	160-40
14 gauge flat metal dispensing tip	Amazon	B07M7YWWLT
22x22 mm square glass coverslip	Sigma	C9802-1PAK
60 mm glass Petri dish to store grids	Fisher	08-747A
100 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747D
150 mm glass Petri dish to store Whatman paper	Fisher	08-747F
250 mL beaker	Fisher	02-555-25B
Blue styrofoam dewar	Spear Lab	FD-500
Brass ethane vessel	Lasco	17-4075
Clamping tweezers	Ted Pella	38825
Delicate task wipes	Fisher	06-666
Dual-stage regulator with control valve	Airgas	Y12N245D580-AG
Dewer grid base	UCSD
Ethane platform	UCSD
Ethane propane tank	Praxair	ET PR50ZU-G	ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank
Ethane tank	Praxair	UN1035	ethane (100%)
Flexible arm task light	Amscope	LED-11CR
Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)	Electron Microscopy Sciences	Q325AR1.3
Humidifier	Target	719438
Hygrometer	ThermoPro	B01H1R0K68
Lab coat	UCSD
Liquid Nitrogen dewar	Worthington	LD4
Liquid Nitrogen gloves	Fisher	19-059-925
Manual plunger stand (black stand + foot pedal)	UCSD
Mark 5 (plunging platform)	UCSD
Nitrile gloves	VWR	82026-424
P20 pipette	Eppendorf	13-690-029
PCR tubes	Eppendorf	E0030124286
Pipette tips	ibis scientific	63300005
Ring lamp	Amazon	B07HMR4H8G
Safety glasses	UCSD
Scissors	Amazon	Fiskars 01-004761J
Screw driver	Ironside	354711
Tape	Fisher	15-901-10R
Tweezer to transfer grid box	Amazon	LTS-3
Tygon tubing	Fisher	14-171-130
Whatman blotting paper	Fisher	1001-090