Terapötiklerin Kardiyak Allogrefte Verilmesi için Domuz Heterotopik Kalp Transplantasyonu Protokolü

Özet

Domuz heterotopik kalp nakli modelinde terapötiklerin tüm kardiyak allogreftlere verilmesi için normotermik ex vivo sanguinöz perfüzyon sisteminin kullanılması için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Kardiyak transplantasyon, son dönem kalp yetmezliği için altın standart tedavidir. Bununla birlikte, mevcut donör kalplerin sayısı ve primer greft disfonksiyonu ve greft reddi gibi komplikasyonlar ile sınırlı kalmaktadır. Kardiyak transplantasyonda ex vivo perfüzyon cihazının son klinik kullanımı, fonksiyonu iyileştirmek ve zararlı alıcı yanıtlarından kaçınmak için terapötik müdahalelerle kardiyak allogreftlerin tedavisi için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Tüm allogreftin terapötik olarak verilmesi için translasyonel, büyük hayvan modeli oluşturmak, kardiyak transplantasyonda yeni terapötik yaklaşımların test edilmesi için gereklidir. İntraabdominal pozisyondaki domuzlu, heterotopik kalp transplantasyonu modeli, yeni girişimlerin etkilerini ve greft reddinin immünopatolojisini değerlendirmek için mükemmel bir model olarak hizmet vermektedir. Bu model ayrıca, alıcının dolaşımını korumak için greftin gerekli olmadığı göz önüne alındığında, domuz için uzun süreli hayatta kalma sunar. Bu protokolün amacı, transplantasyondan önce tüm kardiyak allogreftlere bir terapötiğin ex vivo olarak verilmesini sağlamak için tekrarlanabilir ve sağlam bir yaklaşım sağlamak ve ex vivo perfüze edilmiş kalbin sağkalım heterotopik transplantasyonunu gerçekleştirmek için teknik detaylar sağlamaktır.

Giriş

Kalp yetmezliği, Amerika Birleşik Devletleri'nde tahmini 6 milyon yetişkini etkileyen ve 2030 yılına kadar 8 milyon yetişkine yükseleceği tahmin edilen bir durumdur¹. Kardiyak transplantasyon, son dönem kalp yetmezliği için altın standart tedavidir. Bununla birlikte, sınırlamaları ve komplikasyonları olmadan değildir. Mevcut donör kalp sayısı, primer greft disfonksiyonu, kalbin reddedilmesi ve uzun süreli immünsüpresyonun yan etkileri ile sınırlı kalmaktadır². Bu sınırlamalar, allogreft yetmezliği yaşayabilecek ve normal yaşam beklentisine ulaşmak için daha sonra yeniden transplantasyon gerektiren genç alıcılarda özellikle önemlidir.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için ideal bir müdahale, tüm kardiyak allogreftleri, allogreftin yaşayabilirliğini artırabilecek ve "kardiyoproteksiyon" sağlayabilecek alıcıya implantasyondan önce terapötiklerle tedavi edecektir. Bu tür girişimler iskemik hakaret, allogreft rejeksiyonu, kardiyak allogreft vaskülopatisi insidansını en aza indirmek ve hatta marjinal allogreftleri onarmak için profilaktik olarak verilecektir. Bu tür müdahalelerin geliştirilmesine yönelik translasyonel çalışmalar, kardiyak greftin uzun süreli gözetimine izin vermek için büyük bir hayvan tipi kardiyak transplantasyon modeli gerektirir. İntraabdominal pozisyondaki domuzlu, heterotopik kalp nakli modelinin bu amaç için ideal olduğu kanıtlanmıştır. Bu pozisyonda kalp transplantasyonu, yeni tedavilerin etkilerinin test edilmesine ve greft reddinin immünopatolojisinin değerlendirilmesine olanak tanır. Ek olarak, heterotopik model, alıcının daha iyi genel sağkalımı, kardiyopulmoner bypass gereksinimi olmaması ve alıcının dolaşımını korumak için greft gereksinimi olmaması nedeniyle ortotopik modele göre avantajlıdır³.

Gen, hücre veya immünoterapi gibi terapötik müdahalelerin kalbe etkili bir şekilde uygulanması, klinik uygulamanın önünde önemli bir engeldir ^4,5. Ex vivo perfüzyon cihazları tarafından tanıtılan teknoloji, greftlerin sürekli olarak perfüze edilmesine izin vererek, çalışmayan ancak metabolik olarak aktif bir durumda tutulmalarını sağlar 6,7,8,9. Bu, tüm kalbi gelişmiş terapötiklerle tedavi etmek için eşsiz bir fırsat sunarken, sistemik doğumun potansiyel yan etkilerini en aza indirir^10,11,12,13. Terapötik dağıtım için ex vivo perfüzyon cihazlarının kullanılmasının bir diğer avantajı, geleneksel soğuk statik depolama yöntemleri kullanılarak mümkün olmayan uzun süreler boyunca koroner dolaşıma ilaç verilmesine izin vermeleridir. Bu, terapötiklerin greft^14'e daha küresel olarak verilmesine izin verir. Burada sunulan protokolü kullanarak, adenoviral vektörler¹⁵ kullanarak ateşböceği lusiferaz genini bütün bir domuz kardiyak greftine başarıyla teslim ettik. Bu protokolün amacı, transplantasyondan önce tüm kardiyak allogreftin terapötik olarak verilmesini sağlamak için tekrarlanabilir ve sağlam bir yaklaşım sağlamaktır.

Protokol

NOT: İki dişi Yucatan domuzu seçilir, bunlardan biri kardiyak greft donörü, diğeri alıcı olarak belirlenmiştir. 6-8 aylık, yaklaşık 30 kg ağırlığında ve uyumlu kan gruplarına sahip domuzlar önerilir. Protokolün genel görünümü Şekil 1'de gösterilmiştir. Domuzlar için barınma ve tedavi prosedürleri, Duke Üniversitesi Tıp Merkezi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Ex vivo perfüzyon cihazının hazırlanması

1. Ex vivo perfüzyon cihazını ve hücre koruyucu cihazı üreticinin yönergelerine göre kullanılmak üzere hazırlayın.
2. Bir pacing kutusu ve defibrilatör bulundurun ve bunları ayarlayın.
3. Tam kan sayımını (CBC), temel metabolik paneli (BMP) ve arteriyel kan gazını (ABG) kontrol etmek için bir bakım noktası (POC) test cihazına sahip olun.
4. Üreticinin perfüzyon çözeltisinde mevcut değilse, üretici tarafından sağlanan perfüzyon astarlama çözeltisine aşağıdaki ilaçları ekleyin: 100 mL% 25 albümin, 10 mL 200 mg / 100 mL siprofloksasin, 1 g sefazolin sodyum, iki adet 5 mL çoklu vitamin enjeksiyonu şişesi, 250 mg metilprednizolon, 10.000 IU heparin ve 50 IU insülin.
   1. Elektrolit seviyelerinin normal fizyolojik aralıkta olduğundan emin olmak için ex vivo cihaz astarlama çözeltisinin POC testini gerçekleştirin. Değilse, herhangi bir subterapötik elektrolit veya glikoz seviyesini desteklemek için kalsiyum glukonat, dekstroz ve / veya sodyum bikarbonatı buna göre uygulayın.
5. Astarlama çözeltisini eklenen ilaçlarla birlikte eklemek için, çözeltiyi yükseltin ve çözeltiyi ex vivo perfüzyon cihazına ileten hattı havadan arındırın.
   NOT: ex vivo perfüzyon cihazının astarlanması ile ilgili talimatlar için bölüm 6'ya atlayın.

2. Donör domuzda anestezi ve IV erişiminin başlatılması

1. Domuzu 8-12 saat boyunca oruç tuttuktan sonra, ketamin (5-33 mg / kg, kas içi) ve midazolam (0.2-0.5 mg / kg, kas içi) ile önceden ilaçlayın ve bir yüz maskesi kullanarak izofluran (% 1-4) uygulayın.
2. Domuzu sırtüstü pozisyona yerleştirin ve hava yolunu korumak için bir endotrakeal tüp (ETT) (5.5-6.5 mm iç çap) ile entübe edin. ETT'yi domuzun burnuna bağlayarak sabitleyin. Ekstremiteleri masaya bağlı ağır bağlar kullanarak konumlandırın.
3. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem uygulayın.
4. Bir kulak damarına intravenöz (IV) bir kateter (20-22 G) yerleştirin.
5. Bakım IV sıvılarını başlatın (10 mL·( kg·h)^-1).
6. Analjezi için intramüsküler (IM) Buprenorfin 0.005-0.01 mg / kg uygulayın.

3. Yaşamsal belirtiler ve merkezi hat ayarları

1. Mekanik ventilasyona 10 mL· gelgit hacminde başlayın (kg·min) ^-1 ve izofluran ile dakikada 10-15 nefes hızı (%1-3) işlem boyunca reflekslerin olmadığı ve kalp atış hızının (>60 bpm, <100 bpm) ve kan basıncının (sistolik kan basıncı >90 mmHg, <130 mmHg) fizyolojik aralıkta kaldığı şekilde korunur.
   NOT: Paralitik eklenmesi isteğe bağlıdır.
2. Ameliyat boyunca oksijen doygunluğunu ve kalp atış hızlarını sürekli izleyin.

4. Donör domuzun medyan sternotomi

1. Sternumu manubriumdan ksifoide palpe edin. Orta hattı steril bir cerrahi işaretleyici kullanarak işaretleyin. Sahadaki herhangi bir saçı bir saç kesme makinesi ile tıraş edin ve toplam 3 tur sterilizasyon için% 4 klorheksidin kullanarak bölgeyi sterilize edin. Hemen cerrahi bölgenin etrafına steril bir cerrahi örtü uygulayın.
   NOT: Cerrahlar ellerini ve kollarını alkol veya iyot bazlı bir yıkama ile yıkamalı ve steril önlük ve eldiven giymelidir.
2. Domuzun büyüklüğüne bağlı olarak manubriyumdan ksifoide kadar bir kesi yapmak için 10 numaralı bir bıçak kullanın, domuzun büyüklüğüne bağlı olarak 20-30 cm ölçülür.
3. Pektoralis majörünü sternumdan ksifoide bölmek için elektrokoter kullanın, bunu sternumun orta çizgisi boyunca yapmaya dikkat edin. Sternuma indikten sonra, orta çizgiyi puanlayın ve sternotomiye ağır makasla bölerek ksifoidden başlayın.
4. Sternotomi sefaladını ağır makasla uzatın. Her kesimden sonra, parmak süpürmelerini kullanarak kalbi sternumdan açıkça ayırın. Bu şekilde, sternotomiyi manubriyumdan tamamlayın.
5. Sternotomiyi tamamladıktan sonra, kesilen kemik kenarlarına elektrokoter uygulayarak hemostaz elde edin.
6. Sternal bir retraktör yerleştirin ve cerrahi alanın maruz kalmasını optimize etmek için açın. Timüsü elektrokoter ile tanımlayın ve çıkarın. Perikardın diyaframdan aort kısmına uzunlamasına girin. 5-6 boyut kullanarak perikardiyal bir beşik oluşturun: 2-0, ipek dikişler.

5. Donör domuzun kalp durması ve kardiektomisi

1. Dokuyu aort ve pulmoner arter (PA) arasında tamamen bölün ve aort çapraz kelepçesinin uygun şekilde yerleştirilmesini kolaylaştırmak için aort arkının ve brakiyosefalik gövdenin yerini görselleştirin.
   NOT: Yükselen aort, domuzda insana göre çok daha kısadır.
2. Superior vena kavayı (SVC) makas ve künt diseksiyon kullanarak çevresel olarak serbest bırakın. İki geçiş, boyut: 0, SVC etrafında ipek bağlar.
3. İnferior vena kavayı (IVC) makas ve künt diseksiyon kullanarak çevresel olarak serbest bırakır. Benzer şekilde, IVC'nin etrafında iki 0 ipek bağ geçirin.
4. Yükselen aort için bir U-dikiş, boyut: 4-0, polipropilen sütür uygulayın.
5. Sağ atriyuma (RA) bir çanta ipi uygulayın, boyut: 4-0, polipropilen sütür.
6. 300 U / kg'lık bir başlangıç dozu kullanarak bir bolus heparin IV uygulayın.
7. Daha önce yerleştirilmiş U-dikişle sabitlenmiş bir pediatrik 4-Fr aort kök kanülü yerleştirin. Kanülü havalandırın ve bir Rummel turnikesi ile yerine sabitleyin.
8. Aort kökü kanülünü, tüp del Nido kardiyoplejisi ile yıkandıktan sonra kardiyopleji tüpüne bağlayın. Boru içindeki hava kabarcıklarını gidermek için gerekli miktarda yıkayın.
   NOT: Perfüzyon ekibi ile iletişim, kalp durmasını doğru bir şekilde yürütmek için bu noktada kritik öneme sahiptir.
   1. Perfüzyonist(ler)in hücre koruyucu tek kullanımlık malzemeleri steril bir şekilde taktıklarından, cihazı üretici tarafından önerildiği şekilde hazırladıklarından (bkz. bölüm 6) ve toplanan kanı işlemeye hazır olduklarından emin olun.
   2. Hücre koruyucu kardiyotominin (yıkandıktan sonra kanın depolandığı hücre koruyucu cihaza bağlı plastik kap) 10.000 U heparin ile hazır olduğunu ve kardiyotominin -150 mmHg basıncı geçmemek üzere emişe bağlı olduğunu doğrulayın.
      NOT: Bu, kırmızı kan hücrelerinin hemolizini önlemek içindir.
9. Daha önce yerleştirilmiş çanta ipi içinde doğru bir atriotomi oluşturun, RA'ya 24 Fr venöz kanül yerleştirin ve bir Rummel turnikesi ile sabitleyin.
10. Venöz kanülü hücre koruyucu kardiyotomiye bağlı steril bir emme hattına bağlayın ve yaklaşık 1-1.3 L kan toplayın. Daha sonra, aort çapraz kelepçesini uygulayın ve kelepçenin yükselen aortu tamamen tıkadığından emin olun. Bir basınç torbası kullanarak 500 mL Del Nido kardiyoplejisini 100-150 mmHg basınçta köke uygulayın.
    NOT: Kalp ağartılacak ve tutuklanacaktır.
11. Kalbe steril buz rüşveti yerleştirin.
12. Kardiyopleji verildikten sonra, aort kökü kanülünü ve RA venöz kanülünü çıkarın ve çanta ipi dikişlerini bağlayın.
13. Aşağıdakileri bölün: IVC, SVC azygos venine sadece proksimal olarak, ark seviyesindeki aort, Innominate artere sadece distal, bifurkasyondaki ana PA ve koroner sinüse girerken sol azigot ven.
    NOT: Domuzların koroner sinüse akan sol azigot damarı vardır.
14. Pulmoner damarları tanımlayın ve bunları boyutla bağlayın: 2-0, ipek bağlar veya büyük boyutlu klipsler. AG havalandırma deliğinin yerleştirilmesi için bir pulmoner veni açık bırakın.
15. Kalbi göğsünden çıkarın ve steril buz sulu bir kaba koyun.
16. Grefti ex vivo perfüzyon cihazına yerleştirilmek üzere hazırlamak için kalbi arka masaya taşıyın.

6. Donör kanının yıkanması ve ex vivo perfüzyon cihazının astarlanması

NOT: Bu adım, perfüzyona sokulduğunda terapötik iletimi nötralize edebilecek herhangi bir bileşeni donör serumundan çıkarmak için gereklidir. Allogreft iskemik süresini en aza indirmek için donör kalbin ekplantasyonu sırasında bu adımı uygulayın.

1. Bir hücre koruyucu prime ve yıkama döngüsünü tamamlayın.
   1. Tek kullanımlık bileşenleri üreticinin talimatlarına göre cihaza takın.
   2. Plasmalit A'yı yükselterek ve cihazdaki asal işlevi seçerek hücre koruyucu cihazı astarlayın. Donör domuzdan toplanan kan hacmi kadar Plazmalit A ekleyin: 1: 1 şekilde.
      NOT: Cihaz astarlama döngüsünü tamamladıktan sonra, kan eklenmesi için hazırdır. Donör domuzdan kanın nasıl ekleneceği hakkında bilgi için bölüm 5.9-5.11'e bakınız.
   3. Kan cihaza girdikten sonra, hücre koruyucu cihazdaki yıkama döngüsünü seçin.
      NOT: Bu işlem sırasında, kanı yıkamak için Plazmalit A verilirken kan santrifüj edilir. Bu adım kanı yoğunlaştırır ve yıkar.
2. Yıkanan kanı ex vivo cihaza aktarmak için bir kan toplama torbasına aktarın.
3. Yıkanan kanı ex vivo perfüzyon cihazına üreticinin yönergelerine göre ekleyin.
4. Exvivo makinenin astarlanması sırasında suda 500 mL% 5 dekstroz içine 0.25 mg epinefrin ve 30 IU insülin enjekte ederek bir epinefrin çözeltisi hazırlayın. Çözümü yükseltin ve çözümü ex vivo cihaza ileten hattı havadan arındırın.
5. Ex vivo perfüzyon cihazına 10.000 U heparin ekleyin.
6. Kanı yeniden oluşturmak için% 5 albümin ekleyin.
   NOT: Cihaza eklenen %5 albümin hacmi, hücre koruyucu cihaz tarafından çıkarılan plazma miktarına eşittir. Bu, fizyolojik onkotik basınç ve hematokrit elde etmeye yardımcı olmak için yapılır.
7. Pompayı 1-1,5 L/dak'da akacak şekilde açarak devreyi rezervuara verilen berrak asal, ilaçlar ve kanla astarlayın. Pompa akışını açtıktan ve astarın perfüzyon modülünden dolaştırılmasından sonra, devrenin hatlarının havasız olduğundan emin olun.
   NOT: Son bakım çözeltisi hacmi, yıkanmış kan hacmine ek olarak 1000 mL'dir.
8. POC test cihazını kullanarak POC kimyasını ve laktatı delen bir taban çizgisi elde edin. Elektrolitleri gerektiği gibi doldurun.
   1. Minimum glikoz seviyesi 100 mg / dL'yi korumak için yeterli dekstroz ekleyin.
   2. Minimum pH hedefi olan 7.4'ü korumak için yeterli sodyum bikarbonat ekleyin.
      NOT: Önemli olarak, ilave sodyum bikarbonat perfüzyondan çıkarılamaz. Aşırı sodyum seviyeleri kalbin ödemli hale gelmesine katkıda bulunur ve kaçınılmalıdır. Baz açığını tedavi ederken dikkatli olunmalıdır, çünkü kalp reanimasyon üzerine baz açığını düzeltmeye başlayacaktır.
   3. Minimum iyonize kalsiyum seviyesini 0.8 mmol / L'de tutmak için yeterli kalsiyum glukonat ekleyin.
9. Sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
10. Gaz akış hızını 150 mL / dak'ya ayarlayın ve fizyolojik pCO₂ seviyesine ulaşmak için gerektiği gibi ayarlayın.
11. Ortalama arteriyel basınç (MAP) hedefini 60-70 mmHg olarak ayarlayın.
12. Pompa akışını 0,6 L/dk'ya düşürün.

7. Donör kalbin arka masa hazırlığı ve kalbin yeniden canlandırılması

1. SVC'yi oversew. Dört adet rehinli, boyut: 4-0, polipropilen dikişleri distal aortun iç kısmına, kesme kenarının 5 mm altına basit bir yatay yatak şeklinde yerleştirin ve bağlayın.
2. 4'ü tutarken, boyut: 4-0, aort dikişleri sözü verdi, aort konektörünü aortun içine yerleştirin ve konektörü sabitlemek için aortun etrafına göbek bandı bağlayın.
3. Bir boyut yerleştirin: 4-0, polipropilen çanta ipi ana PA'nın distal kesim kenarının etrafına. PA kanülünü yerleştirin ve kanülü sabitlemek için çanta ipinin uçlarını bağlayın.
4. Hazırlanan grefti arka masadan ex vivo perfüzyon cihazına alın ve aort konnektörünü cihaza bağlayın. Kalbi cihaza sabitlemeden önce aort/aort konektörünün havasını boşalttığınızdan emin olun.
5. Perfüzyon saatini çalıştırın, pompa akışını 0,6 L/dak civarında tutun ve sıcaklık ayar noktasını 34 °C'ye düşürün.
6. Üreticinin tavsiyelerine göre epinefrin ve bakım damlamalarını başlatın.
7. PA kanülünü cihazdaki PA konektörüne bağlayın ve bir bağ ile sabitleyin.
8. Sol ventrikül (LV) havalandırma drenajını bağlanmamış pulmoner venden sol atriyuma ve mitral kapak boyunca LV'ye yerleştirin.
9. AG serbest duvarına iki kardiyak tempo ucu yerleştirin.
10. Her saat başı laktat, ABG, CBC ve BMP'yi kontrol edin. Normal fizyolojik seviyeleri korumak için potasyum,% 50 dekstroz ve kalsiyumu gerektiği gibi uygulayın.
    NOT: Laktat bazlı yeterli perfüzyon sağlamak için erken stabilizasyon sırasında daha sık laktat örneklemesi uygun olabilir.
11. Pacing gerekiyorsa, ventriküler hızı 10 mA'da dakikada 80 atıma ayarlayın (atriyal pacing tipik olarak kullanılmaz).
12. Defibrilasyon gerekiyorsa, cihazdaki sıcaklık 34 ° C'ye ulaştıktan sonra 10 J'de başlayın.
    NOT: Hedef toplam ortalama akış 600 mL/dak ve ortalama koroner akış 400 mL/dak'dır.

8. Terapötik uygulamanın yapılması

1. Terapiyi steril bir şekilde bir şırıngaya hazırlayın.
2. Porttan kan almak için steril bir 3 mL şırınga kullanarak kardiyopleji portunu havalandırın. Terapiyi kardiyopleji portuna (veya eşdeğeri) uygulayın, böylece terapötik doğrudan aort köküne sokulur.
3. Portu havasızlandırırken adım 8.2'de çekilen toplanan kanın hacmiyle portu yıkayın; onunla herhangi bir hava yıkamamaya dikkat edin.
   NOT: Bu, tedavinin kalbin aort köküne uygulanmasını sağlamak içindir.
   NOT: Bu bölüm daha önce Bishawi ve ark .'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Lusiferaz ekspresyonu için viral vektörleri tanıtmak¹⁵.
4. Terapötiği tanıttıktan sonra grefti cihazdaki 2 saat boyunca perfüze edin.

9. Alıcının hazırlanması ve vasküler maruziyet ile laparotomi

1. Kardiyak allogreft cihaza sabitlendikten ve terapötik devreye sokulduktan sonra, alıcı domuz için bölüm 2'de açıklandığı gibi anestezi ve preoperatif hazırlığın indüksiyonuna başlayın.
2. İmmünsüpresyon ilaçlarının infüzyonunu başlatın: prosedür boyunca yavaş damla infüzyonu olarak toplam 50 mg / kg siklosporin ve metilprednizolon 1 g IV bolus.
3. Antibiyotik uygulayın: enrofloksasin IM (5 mg / kg) ve sefazolin 1 g IV bolus.
4. Mesanenin içine bir Foley kateteri yerleştirin.
   NOT: Mesanenin sıkıştırılmasının açılması, infrarenal aort ve IVC'nin optimal maruziyetinin elde edilmesine yardımcı olur.
5. Steril bir cerrahi belirteç kullanarak karın orta hattını karın ortasından pubise kadar işaretleyin. Sahadaki herhangi bir saçı bir saç kesme makinesi ile tıraş edin ve toplam 3 tur sterilizasyon için% 4 klorheksidin kullanarak bölgeyi sterilize edin. Hemen cerrahi bölgenin etrafına steril bir cerrahi örtü uygulayın.
   NOT: Cerrahlar ellerini ve kollarını alkol veya iyot bazlı bir yıkama ile yıkamalı ve steril önlük ve eldiven giymelidir.
6. Cildi kesmek için 10 bıçak kullanın (20-30 cm kesi) ve fasyaya kadar diseksiyon yapmak için elektrokoter'e geçin.
7. Fasya ve periton kaldırmak için iki Kocher kelepçesi kullanın ve Metzenbaum makası kullanarak periton boşluğuna dikkatlice küçük bir kesi (1 cm) yapın.
8. Elektrokoter kullanarak peritoneal açıklığı insizyonun tam uzunluğu boyunca uzatın, altta yatan iç organı korumak için altına bir parmak yerleştirin. Pozlamayı optimize etmek için bir Balfour retraktörü yerleştirin. İnce bağırsağı kraniyal olarak ve ıslak havlularla geri çekin.
9. Böbreklerden daha düşük olan retroperitoneal boşluğu, üreterleri tanımlamaya ve yaralanmayı önlemeye yönelik özenle açın.
10. Diseksiyonu abdominal aort ve IVC'ye kadar taşıyın. Lenfatikleri orta ve büyük klipslerle bağlayın.
11. Damarları çevresel olarak inceleyin ve her bir geminin etrafına büyük bir Satinsky kelepçesi sığacak kadar büyük bir segmenti ortaya çıkarın. Aortun arka kısmından çıkan lomber arteriyel dalların bozulmasını önlemeye özen gösterin. Aort ve IVC'nin etrafına iki damar halkasını maruziyetin proksimal ve distal uçlarına yerleştirin.

10. Son tutuklama ve kalbin ex vivo perfüzyon cihazından çıkarılması

1. 2 saatlik ex vivo perfüzyonun sonunda, ısıtıcı-soğutucu makinesini ex vivo cihaza bağlayın. Isıtıcı soğutucu sıcaklığını 34 °C'ye ayarlayın.
2. Steril ve havasız bir şekilde, havasızlaştırılmış kardiyopleji dağıtım hattını aort erişim portundaki ex vivo cihaza bağlayın.
3. ex vivo cihazdaki sıcaklık ayar noktasını kapatın.
4. Isıtıcı-soğutucu sıcaklığını 24 °C'ye düşürün ve MAP'yi 60 ila 70 mmHg arasında tutmak için pompa akışını azaltın (tipik olarak pompa akışında 1 L/dk'dan 0,9 L/dk'ya kadar bir değişiklik).
5. Ex vivo perfüzyon cihazındaki sıcaklık okuması 24-26 °C'ye ulaştığında, ısıtıcı-soğutucu sıcaklığını 14 °C'ye daha da düşürün ve pompa akışını 100 mL / dak daha da azaltın.
6. Sıcaklık 14-16 ° C'ye ulaştığında, PA kanülünü PA portundan ayırın, antegrad del Nido (500 mL) teslimatına başlayın, AO hat vanasını kapatın, pompayı durdurun ve AO havalandırma hattını hızla sıkıştırın.
   NOT: Ex vivo cihaz monitöründe gösterildiği gibi ortalama 45-65 mmHg dağıtım basıncını korumak için kardiyopleji dağıtım basıncının titre edilmesi gerekir.
7. PA kanülünü ve aort konektörünü keserek ve pacing tellerini keserek kalbi ex vivo perfüzyon cihazından çıkarın.
8. Kalbi steril buz kütlesi ile dolu bir kovaya yerleştirin.
9. Arka masada, LV havalandırmasının yerleştirildiği pulmoner ven/sol atriotomi overse. Aort ve PA'nın distal yönünün (1 veya 2 mm) kesilmesi, kanüllere bağlanmanın dokuyu ezmiş olabileceği yerlerde.
   NOT: Kalp artık intraabdominal, heterotopik implantasyon için hazırdır.

11. Kardiyak greftin heterotopik implantasyonu

1. Satinsky kelepçelerini yerleştirmeden önce, alıcı domuza 300 U / kg IV heparin uygulayın.
2. IVC'ye bir Satinsky kelepçesi yerleştirin ve 11 bıçaklı ve Pott'un makası kullanarak ~ 1,5 cm uzunluğunda uzunlamasına bir venotomi oluşturun.
3. Greft PA'yı alıcının infrarenal IVC'sine uçtan uca bir şekilde anastomoz, boyut: 4-0, polipropilen sütür kullanarak. Önce anastomozun iç kısmını uygulayın ve anastomozun dış kısmını tamamlamadan önce kesilen dikişlerle gerektiği gibi güçlendirin.
   NOT: İlk önce PA-IVC anastomozu yapılır ve aort tıkanıklığı süresini azaltmak için en son aort-aort anastomozu yapılır.
4. Aort üzerine bir Satinsky kelepçesi yerleştirin ve 11 bıçaklı ve Pott'un makası kullanarak ~ 1,5 cm uzunluğunda uzunlamasına bir aortotomi oluşturun.
   NOT: Kelepçe yerleştirmeden önce bir ABG alın. Kelepçe salınımından hemen sonra ve alıcıda iskemik hasarın göstergesi olan hiperkalemi, hiperlaktatemi veya asidemideki değişiklikleri değerlendirmek için 15-30 dakika sonra tekrar kontrol edin.
5. Greft aortunu alıcının infra-renal aortuna uçtan yana bir şekilde anastomoz, bir koşu, boyut: 4-0, polipropilen sütür kullanarak. Önce anastomozun iç kısmını uygulayın ve anastomozun dış kısmını tamamlamadan önce kesilen dikişlerle gerektiği gibi güçlendirin.
6. Kalbi reperfüze etmek için Satinsky kelepçelerini çıkarın; İlk önce IVC kelepçesini ve ardından aort kelepçesini çıkarın.
7. Havayı boşaltmak için greftin LV tepesine 18 G'lik bir anjiyokatat yerleştirin. Tamamlandığında, anjiyokattı çıkarın ve bölgeyi rehinli bir dikişle kapatın.
8. Anastomozları herhangi bir kanama için dikkatlice kontrol edin.
9. Kalbi dikkatlice sağ retroperitoneal boşluğa yerleştirin, böylece anastomozlarda gerginlik olmaz ve damarların bükülmesi olmaz. İnce bağırsağı değiştirin.

12. Laparotominin kapatılması

1. Fasyayı ilmekli, boyut: 0, Maxon sütürü, insizyonun her iki ucundan başlayarak ve ortada bağlayarak çalışan bir şekilde kapatın. Bağırsakta herhangi bir yaralanmayı önlemeye özen gösterin.
2. Derin dermal tabakayı boyutla kapatın: 2-0, Vicryl koşu tarzında ve cildi boyutla: 4-0, Monocryl koşu şeklinde.
3. Cilt kesisini temizleyin ve cilt yapıştırıcısı uygulayın.

13. Ameliyat sonrası tedavi ve ötenazi

1. Ameliyatın tamamlanmasından sonra, izofluran akışını kapatın ve kas tonusunun ve nöromüsküler reflekslerin (kornea refleksi, ağrılı uyaranlara çekilme, yutma) geri dönüşü için domuzu izleyin.
2. Bu fonksiyonların restorasyonunu onayladıktan sonra, mekanik ventilasyonu kapatın ve spontan nefes almayı gözlemleyin. Spontan solunum varsa, endotrakeal tüpü çıkarın; yoksa, endotrakeal tüpü mekanik ventilasyona yeniden bağlayın.
3. Domuzu ameliyat masasından, hayati belirtilerinin (rektal sıcaklık, kan basıncı, kalp atış hızı) yakından izlenebileceği izole bir muhafazaya aktarın. Domuzu gerektiği gibi ısıtmak için bir ısıtma lambası kullanın. Hipotansiyon ayarında 250 mL Laktasyonlu Ringer çözeltisinin IV sıvı bolusunu sağlayın (sistolik kan basıncı < 100mmHg). Sternal yatışlığı koruyana ve hayati belirtiler tamamen normalleşene kadar domuzu izlemeye devam edin.
   NOT: Hayvan, yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmaz. Ek olarak, hayvan tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmez.
4. Ağrı yönetimi için, 72 saatlik analjezi için bir kerelik bir doz buprenorfin (sürekli salınım) deri altı enjeksiyonu 0.12 mg / kg uygulayın.
5. Deney süresinin sonunda, yerli (torasik) kalbin ve allogreft (karın) kalbin ekplantasyonu için domuzu ötenazi yapın.
   1. Domuzu prosedür için bölüm 2 ve 3'te açıklandığı gibi hazırlayın. Her kalbi tutuklamak için iki torba del Nido ve iki kardiyopleji hattı hazırlayın.
   2. Torasik kalbi bölüm 4'te açıklandığı gibi ortaya çıkarın. Tamamlandığında, bölüm 9'da açıklandığı gibi bir laparotomi yapmaya devam edin.
   3. Aorto-aort ve PA-IVC anastomozları açığa çıktıktan sonra, allogrefti sistemik dolaşımdan izole etmek için alıcı aort üzerine bir Satinsky kelepçesi ve alıcı IVC'ye bir tane daha yerleştirin.
   4. Allogreftin aort köküne bir pediatrik 4-Fr aort kök kanülü yerleştirin ve kateterin içine bir kardiyopleji hattı bağlayın. Bir basınç torbası kullanarak 500 mL del Nido kardiyoplejisini 100-150 mmHg basınçta köke uygulayın. İnfüzyon başladıktan sonra, allogrefti havalandırmak için PA-IVC anastomozu seviyesinde 2 cm'lik bir kesi yapmak için Metzenbaum makası kullanın.
   5. Allogreft tutuklandıktan sonra, aorto-aort anastomozu ve PA-IVC anastomozunun geri kalanı düzeyinde eksize etmek için Metzenbaum makası kullanarak allogrefti ekplante etmeye devam edin. Satinsky kelepçelerinden hiçbirini çıkarmayın.
   6. Bölüm 5'te açıklandığı gibi torasik kalbin çıkarılmasına devam edin.
      NOT: Tek önemli fark, pulmoner venlerin dikkatli bir şekilde bağlanmasına gerek kalmaması ve bunun yerine kardiektomi yapılırken Metzenbaum makası kullanılarak ağır bir şekilde diseke edilebilmesidir.

Sonuçlar

Bu grup, çalışma tasarımına bağlı olarak, burada sunulan protokolü takip eden 5 ila 35 gün arasında 9 domuzu başarıyla hayatta bırakmıştır. Bu protokole tabi tutulan 10 domuzdan sadece 1'i cerrahi komplikasyonlardan erken öldü ve% 90'lık bir hayatta kalma oranı elde edildi. Şekil 2'de gösterilen, bir domuzda karın içi pozisyonda nakledilen heterotopik bir kalbin konfigürasyonunun bir diyagramıdır. Allogreftin anastomozu için bölgeyi belirlerken, anastomozda herha...

Tartışmalar

Kardiyak transplantasyonda ex vivo perfüzyon sırasında terapötiklerin verilmesi, allogrefti modifiye etmek ve potansiyel olarak nakil sonuçlarını iyileştirmek için bir strateji sunmaktadır. Burada sunulan protokol, son teknoloji normotermik ex vivo sanguinöz perfüzyon depolamasını içerir ve allogreft^11,12,13'e hücre^, gen veya immünoterapilerin izole edilmiş dağıtımını test etmek için umut verici bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Looped Maxon suture	Covidien	GMM-341L	Used to close fascia of the laparotomy incision
0 Silk ties	Medtronic, Inc	S346
18 G Angiocath	BD	381144	Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation
20 Fr LV vent	Medtronic, Inc	12002
2-0 Silk sutures	Ethicon, Inc.	SA11G
2-0 Silk ties	Ethicon, Inc.	SA65H
2-0 Vicryl suture	Ethicon, Inc.	J259H
24 Fr venous cannula	Medtronic, Inc	68124
3-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8522
4-0 Monocryl suture	Ethicon, Inc.	Y469G
4-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8521
Animal hair cutting clipper	Wahl	8786-452
Aortic clamp	V. Mueller	CH6201
Army Navy retractor	V. Mueller	SU3660
ATF 40, Cell saver disposable set	Fresenius Kabi	9108494	Cell saver device insert
Balfour retractor	V. Mueller	SU3042	Used as an abdominal wall retractor
C.A.T.S cell saver	Fresenius Kabi	ES0019	Cell saver device used to wash donor blood
Cardiac defibrillator	Zoll	M Series	Cardiac defibrillator
Castro needle holder	V. Mueller	CH8589
CG4 iStat cartridges	Abbott	03P85-25	POC testing
CG8 iStat cartridges	Abbott	03P88-25	POC testing
DeBakey forceps	V. Mueller	CH5902
Electrocautery disposable pencil	Covidien	E2450H
Gerald forceps	V. Mueller	NL1451
Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater	Cincinnati Sub-Zero	86022	Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device
iSTAT 1	Abbott	04P75-03	POC testing device
Kocher clamp	V. Mueller	SU2790
Large clip applier	Sklar	50-4300
Large clips	Teleflex	4200
Large soft pledgets	Covidien	8886867901
Medium clip applier	Sklar	50-4335
Medium clips	Teleflex	2200
Metzenbaum scissor	V. Mueller	CH2006-001
No. 10 scalpel blade	Swann-Mortan	301	Used for skin incision
No. 11 scalpel blade	Kiato Plus	18111	Used for vascular incision
OCS device with base	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device
OCS disposable	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits
Pacing cable	Remington Medical	FL-601-97
Pediatric cardioplegia catheter (4Fr)	Medtronic, Inc	10218	Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root
Pediatric Foley catheter	Teleflex	RSH170003080	Placed pre-op to decompress the recipient's bladder
Potts scissors	V. Mueller	CH13038
Pressure bag x2 (1,000 mL)	Novaplus	V4010H	Used to deliver cardioplegia at a set pressure
Satinsky clamp	V. Mueller	CH7305	Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels
Scissors	Felco	FELCO 200A-50	Used to perform sternotomy
Small hard pledgets	Covidien	8886867701
Sternal retractor	V. Mueller	CH6950-007
Temporary cardiac pacing wires	Ethicon, Inc.	TPW32
Temporary dual chamber pacemaker	Medtronic, Inc	5388	Cardiac pacing device
Tourniquet kit	Medtronic, Inc	79005	Rummel tourniquets
Umbilical tape	Covidien	8886861903
Vessel loops	Covidien	31145686