JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Islatılmış boncuk testi, hücre farklılaşmasının ve morfogenezinin düzenlenmesini incelemek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında test reaktifinin hedeflenmiş olarak verilmesini içerir. Üç farklı tipte ıslatılmış boncuk hazırlamak ve bunları bir tavuk embriyosunun ara rakamlarına implante etmek için herhangi bir deneysel hayvan modeline uygulanabilir ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Embriyonik gelişim sırasında, şaşırtıcı bir somatik hücre, doku ve organ çeşitliliği oluşturmak için hücre farklılaşmasını düzenleyen çok sayıda genetik program aktive edilir. Bu genetik programların kesin aktivasyonu, hücre kaderini farklı eşiklerde yönlendiren difüzyon molekülleri olan morfojenler tarafından düzenlenir. Genetik aktivasyonun morfogenezi nasıl koordine ettiğini anlamak, gelişim sırasında morfojenler tarafından tetiklenen yerel etkileşimlerin incelenmesini gerektirir. Proteinlere batırılmış boncukların veya embriyonun farklı bölgelerine implante edilmiş ilaçların kullanılması, belirli moleküllerin rakamların ve diğer gelişimsel süreçlerin oluşturulmasındaki rolünün incelenmesini sağlar. Bu deneysel teknik, hücre indüksiyonunun kontrolü, hücre kaderi ve desen oluşumu hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, bu ıslatılmış boncuk testi, diğer embriyonik modellere uygulanabilir son derece güçlü ve değerli bir deneysel araçtır.

Giriş

Embriyonik gelişim sırasında gen ekspresyonunu kontrol eden moleküler mekanizmalardaki atılımlar, hücre kaderinin nasıl belirlendiğini anlamamızı sağlamıştır. Farklı hücre soylarına bağlılık, hücreler transkripsiyon faktörlerinin moleküler ekspresyonuna başladığında ortaya çıkar1. Bu ifade paterni uzay ve zamanda oldukça koordine edilir ve böylece hücrelerin, dokuların ve organların şekillendirilmesini, konumlandırılmasını ve modellenmesini yönlendirir 1,2,3,4,5. Embriyonik indüksiyon, hücrelerin potansiyelini kısıtlayan hiyerarşiler oluşturarak hücrelerin belirli soylara bağlandığı süreçtir, hatta Spemann organizatörü 6,7'de olduğu gibi temel vücut planının oluşturulmasını bile içerir. Blastopore dorsal dudak, konakçı embriyo 8,9'da ikinci bir embriyonik ekseni indükler. Günümüzde, moleküler yaklaşımlarla birleştirilen aşılama ve diğer klasik deneylerin yardımıyla, farklı transkripsiyon faktörlerinin ve büyüme faktörlerinin Spemann organizatörü10'da embriyonik indüksiyonu yönlendirmek için işlev gördüğü bilinmektedir. Bu nedenle, deneysel manipülasyon, embriyogenez sırasında hücre farklılaşmasını, morfogenezi ve modelleme süreçlerini anlamak için önemli bir araçtır.

İlginçtir ki, doku naklinin zor olduğu embriyonik sistemlerde veya indükleyiciler zaten iyi biliniyorsa, taşıyıcılar, hücre farklılaşmasını, morfogenezi ve hatta modellemeyi düzenlemek için molekülleri (örneğin proteinler, kimyasallar, toksinler vb.) Böyle bir taşıyıcı sistem, söz konusu reaktifin etkisini belirlemek veya söz konusu modelin farklılaşmasını yönlendirmek için herhangi bir gelişimsel zaman noktasında herhangi bir deneysel model organizmada belirli bir moleküle batırılmış boncukların implante edilmesini içerir. Örneğin, retinoik asit (RA) ile ıslatılmış boncukları tavuk kanadı uzuv tomurcuğuna implante ederek, Cheryl Tickle ve ark. (1985), RA'nın polarize edici aktivite (ZPA) bölgesinde sonik kirpi ekspresyonunu indüklediğini göstermiştir 11,12. Aynı deneysel strateji, RA'nın basamak gelişimi sırasında ekstremite tomurcuğundaki somitlerin asimetrisini ve hücre ölümünü kontrol ettiğini ve diğer embriyonik uzuv bölgelerinde13,14,15 olduğunu keşfetmek için kullanıldı. Diğer faktörler, esas olarak proteinler (örneğin, fibroblast büyüme faktörleri [FGF], dönüştürücü büyüme faktörü-beta [TGF-ß]), erken embriyoların yanlarında uzuvları ve interdigital bölgede yeni basamakları indüklemek için kullanılmıştır, sırasıyla 16,17,18,19,20,21 . Bu deneyler, moleküllere maruz kalan dokuların veya hücre gruplarının bağlılık veya yeterlilik aşamasını belirlemek için bu tekniğin gücünü ve faydasını kanıtlamaktadır.

Bu protokolde, basamak oluşumu aşamasındaki civciv uzuv, ıslatılmış boncukların nasıl hazırlanacağını ve implante edileceğini adım adım sunmak için deneysel model olarak hizmet etti. Bununla birlikte, bu deneysel araç bu uygulama ile sınırlı değildir, ancak herhangi bir deneysel hayvan modelinde ve indüksiyon, farklılaşma, hücre ölümü ve modellemeyi incelemek için in vitro ve in vivo herhangi bir zaman noktasında kullanılabilir.

Protokol

Bu araştırma, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México'nun (UNAM, Mexico City, Meksika) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Yumurta inkübasyonu ve embriyo evrelemesi

NOT: Döllenmiş tavuk yumurtaları yerel çiftliklerden elde edilebilir. Döllenmiş Beyaz Leghorn tavuk yumurtası en yaygın olarak kullanılır. Taze döllenmiş tavuk yumurtalarını kuluçkadan önce 1 haftaya kadar 15 ° C'de saklayın.

  1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını, nemlendirilmiş bir inkübatörde 38 ° C'de ve% 70 bağıl nemde, 28 HH aşamasına ulaşana kadar (Hamilton ve Hamburger, 1951'e göre yaklaşık 5.5 gün)22 nemlendirilmiş bir inkübatörde sivri uçlu tarafı aşağı bakacak şekilde dikey olarak inkübe edin. Embriyonun kabuk zarına yapışmasını önlemek için kuluçka sırasında yumurtaları döndürün.
    NOT: Gelişim aşamasının seçimi deneysel amaçlar tarafından bilgilendirilir. Bu durumda, 28 HH aşaması, ektopik bir basamağı indüklemek veya hücre ölümünü teşvik etmek için rakamlar arası boncuk implantasyonu için idealdir.
  2. Yumurtaları inkübatörden çıkarın,% 70 etanol ile silin ve havanın kurumasını bekleyin. Çalışma alanını, mikroskopları ve aletleri% 70 etanol ile dezenfekte edin.
  3. Kan damarlarını tanımlamak ve embriyoyu bulmak için yumurtayı mumlayın. Embriyosu olmayan yumurtaları atın.
  4. Dişsiz forsepslerin ucunu kullanarak, bir yumurtanın künt ucuna dokunarak yaklaşık beş yumurtada bir pencere açın ve forsepslerle kabuğun 1cm2'lik bir bölümünü çıkarın.
  5. Yumurtayı bir karton veya plastik tutucuya aktarın ve stereomikroskop altına yerleştirin. Hava zarını ince cerrahi forsepslerle delip çekerek çıkarın. Embriyoya temas edebilecek küçük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın.
    NOT: Hava membranı, yumurtanın pencerelenmesinden hemen sonra gözlenen beyaz, opak membrandır.
  6. Amniyotik kesesi hafifçe açarken, ince cerrahi forseps kullanarak yırtarak mikroskop altında gözlemleyin. Korioallantoik membranın vaskülatürüne zarar vermemeye dikkat edin.
    NOT: Amniyon, embriyoyu yakından çevreleyen ve onu amniyotik sıvı içinde kapsülleyen şeffaf zardır.
  7. İstenilen aşamada olup olmadıklarını belirlemek için embriyoları ovo'da sahneleyin. Daha erken aşamalardaki embriyolar, yumurta kabuğu penceresini bantla kapattıktan sonra inkübatöre geri gönderilebilir.

2. Boncuk hazırlama

NOT: Söz konusu deneysel amaca ve tedaviye bağlı olarak, alternatif boncuk tipleri (örneğin, Affi-Gel, AG1-X2, heparin) daha uygun olabilir. Affi-Gel boncukları proteinler (örneğin, TGF-ß1) için en uygunken, heparin boncukları büyüme faktörleri (örneğin, FGF'ler, WNT) ve organik çözücülerde (örneğin, DMSO) çözünen kimyasallar için AG1-X2 boncukları için idealdir.

  1. Affi-Jel ve heparin boncuk hazırlama
    1. 45 mm'lik bir Petri kabına sığacak şekilde bir kare parafilm kesin. Parafilmi, örtmek için petri kabının dibine yerleştirin ve dişsiz forsepslerin ucunu kullanarak her köşeyi iterek Petri kabının dibine sabitleyin. Kenara.
    2. Bir pipet veya spatula kullanarak, boncukları bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve çökelterek ve pipetleyerek 1x PBS'de iki kez yıkayın.
    3. 1. adımdan itibaren parafilme alınmış Petri kabının merkezine bir mikropipetle ~ 40-50 boncuk aktarın.
    4. Mikroskopu kullanarak, kullanım için ~ 30 Affi-Gel veya ~ 100 μm çapında heparin boncukları seçin. Boncukları boyutlandırmak için mikroskop göz merceği nişangahı kullanın veya bir HH 28 embriyosunun üçüncü ara basamağını referans olarak kullanın; boncuk interdigit'ten daha küçük olmalıdır.
    5. Boncukları çevreleyen fazla PBS'nin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın ve bunları arıtma çözeltisinin 2-5 μL'sine batırın. Çözümün boncukları tamamen kapladığından emin olun.
    6. Paralel olarak, deneysel arıtma çözeltisinde kullanılanla aynı miktarda araç içeren bir çözeltiye batırarak kontrol boncukları hazırlayın.
      NOT: Deneye göre her tedavi için konsantrasyonların hesaplanması gerekir. Potansiyel olarak zararlı reaktifleri kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.
    7. Çözeltideki boncukları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında boncukların kurumasını önlemek için, yerel atmosferi nemlendirmek ve buharlaşmayı yavaşlatmak için çanağı parafilm ile örtmek için boncukların etrafına birkaç damla 1x PBS veya su damlatın.
    8. Petri kabını buzun üzerine yerleştirin ve boncukları aynı gün içinde implante edin.
  2. AG 1-X2 boncuk hazırlama
    1. 45 mm'lik bir Petri kabına sığacak şekilde bir kare parafilm kesin. Petri kabının tabanını parafilm ile örtün ve dişsiz forsepslerin ucunu kullanarak her köşeyi iterek yapıştırın. Kenara.
    2. AG 1-X2 boncuklarını bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir spatula kullanın. İstenilen son konsantrasyonda 30-50 μL arıtma çözeltisi ekleyin.
    3. Buna paralel olarak, kontrol boncuklarını, ilgilenilen deneysel kimyasal veya protein olmadan hazırlanmış, yalnızca araçla bir çözelti içinde inkübe edin.
    4. Oda sıcaklığında yavaşça sallanırken boncukları 20 dakika boyunca inkübe edin. Tüm inkübasyon sırasında ışıktan korumak için mikrosantrifüj tüplerini folyo ile sarın, çünkü bu moleküllerin çoğu ışığa duyarlıdır.
    5. Bir pipet kullanarak çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve bir girdapta hafif ajitasyonla 2 dakika boyunca oda sıcaklığında suda çözünmüş% 2 fenol kırmızısı ile lekeleyin.
      NOT: Şeffaf AG 1-X2 boncukların boyanması, embriyoya implantasyonlarını kolaylaştırır.
    6. % 2 fenol kırmızısını çıkarın ve fazla boyayı gidermek için boncukları 1x PBS'de iki kez yıkayın.
    7. Bir mikropipet ucu ile ~40-50 AG 1-X2 boncukları adım 1'de hazırlanan parafilm kaplı Petri kabının merkezine aktarın ve bunları 5 μL 1x PBS'ye batırın. Mikroskop altında, ~ 100 μm çapında yaklaşık 30 boncuk seçin. Kullanılmayan boncukları atın.
    8. Boncuklar implante edilmeye hazırdır. Yerel atmosferi nemlendirmek ve / veya buharlaşmayı yavaşlatmak için çanağı parafilm ile örtmek için boncukların etrafına birkaç damla 1x PBS veya su pipetleyerek boncukların implantasyon boyunca PBS'ye batırıldığından emin olun.

3. Embriyo manipülasyonu ve interdigit implantasyon

  1. Embriyoları manipüle etmeden önce, bir tezgah üstünde yan yana iki stereomikroskop yerleştirin. Biri embriyo manipülasyonu ve boncuk implantasyonu içindir, diğeri ise tedavi edilen boncukların embriyoya implante edilmeye hazır tutulması içindir.
  2. Dişsiz forseps kullanarak, yumurta kuluçka ve embriyo evreleme bölümünde açıklandığı gibi kalan yumurtalarda bir pencere oluşturun.
  3. Mikroskop altında, amniyotik zarı sağ arka bacağın yakınında ince cerrahi forseps ile yırtarak amniyotik kesesi sadece prosedürü gerçekleştirmek için gereken miktarda (yani, mümkün olduğunca az) açın.
  4. İnce forseps kullanarak, sağ arka bacağı açığa çıkarmak için embriyoyu amniyotik zardan tutun. İnce bir tungsten iğnesi kullanarak, arka bacağın üçüncü ara basamağının distal-çoğunda ortalanmış bir delik açın.
  5. Embriyoyu ve maruz kalan arka bacağı serbest bırakmadan, forsepsin uçlarından birini kullanarak diğer mikroskoptan tedavi edilmiş bir boncuk alın. Forseps, bir boncuğun forseps ucuna yapışması için açık konumda olmalıdır.
  6. Boncuğu arka bacağın yakınındaki civciv embriyosuna aktarın ve rakamlar arası deliğin üzerine yerleştirin.
  7. Deliğe girene kadar boncuğa basınç uygulamak için forsepsleri kapatın.
  8. Embriyoyu serbest bırakın ve yumurta kabuğu penceresini bantla kapatın.
  9. Gerekli aşamaya ulaşana kadar yumurtaları inkübatöre geri koyun. Gerekli manipüle edilmiş embriyo sayısına ulaşılana kadar prosedürü tekrarlayın. Boncukların hiçbir noktada kurumamasını sağlamak zorunludur.
    NOT: Tam bir ektopik parmağı gözlemlemek için, boncuk implantasyonundan sonra ~ 72 saat kuluçkaya yatırın. Buna karşılık, erken farklılaşma genleri (örneğin, Sox9), TGF-ß1-ıslatılmış bir boncuğun implantasyonundan ~ 30 dakika sonra ifade edilir.

Sonuçlar

Embriyonik civciv uzuvlarındaki hücre davranışını değerlendirmek için ıslatılmış boncukların kullanılması
Bu tahlilin etkinliğini sağlamak için, boncuk tutarlı ve kesin olarak doğru yere yerleştirilmelidir; bu durumda, apikal ektodermal sırt AER'nin altındaki üçüncü interdigitin distal-en büyüğü (Şekil 1A). Bu konumlandırma, söz konusu molekülün interdigital doku boyunca eşit olarak yayılmasına izin verir. Dahası, AER'nin altındaki...

Tartışmalar

Bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan deneysel aracın temel avantajı, belirli bir deneysel moleküle batırılmış boncuklara maruz kalma süresini ve yerini kontrol edebilmektir. Doğru konumlandırmayı hassas gelişimsel zamanlama ile birleştirmek, hücre farklılaşma süreçlerini incelemek için muazzam olanaklar sağlar. Bu deneylerin farklılaşmamış dokuda yapılması, hücresel soydaki ilk önemli olayların araştırılmasını sağlar. Örneğin, embriyonik uzuvların interdigital dokusuna TGFß...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, JC-M'ye verilen Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [hibe numaraları IN211117 ve IN213314] ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [hibe numarası 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tarafından desteklenmiştir. JC M-L, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología'dan (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) doktora sonrası burs aldı. Yazarlar Lic'in yardımını takdir ediyor. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM'dan Lucia Brito, bu makalenin hazırlık referanslarında.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Affi-Gel Blue Gel beadsBio-Rad153-7302
AG1-X2 beadsBio-Rad1400123
Egg incubatorIncumatic de MexicoIncumatic 1000
Fine surgical forcepsFine Science Tools9115-10
Heparine Sepharose beadsAbcamab193268
Petri dishNest705001
StereomicroscopeZeissStemi DV4
TapeNANA
Tungsten needleGoodFellowE74-15096/01

Referanslar

  1. Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion. Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).
  2. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  3. Irizarry, J., Stathopoulos, A. Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies. Development. 148 (2), 196113 (2021).
  4. Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), (2019).
  5. Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis. Frontiers in Genetics. 10, 977 (2019).
  6. Gurdon, J. B. Embryonic induction--molecular prospects. Development. 99 (3), 285-306 (1987).
  7. Bouwmeester, T. The Spemann-Mangold organizer: the control of fate specification and morphogenetic rearrangements during gastrulation in Xenopus. International Journal of Developmental Biology. 45 (1), 251-258 (2001).
  8. Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86 (4), 589-598 (1996).
  9. Cho, K. W., Blumberg, B., Steinbeisser, H., De Robertis, E. M. Molecular nature of Spemann's organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell. 67 (6), 1111-1120 (1991).
  10. Thisse, B., Thisse, C. Formation of the vertebrate embryo: Moving beyond the Spemann organizer. Seminars in Cell & Development Biology. 42, 94-102 (2015).
  11. Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Analytical Biochemistry. 142 (2), 542-555 (1984).
  12. Tickle, C., Lee, J., Eichele, G. A quantitative analysis of the effect of all-trans-retinoic acid on the pattern of chick wing development. Developmental Biology. 109 (1), 82-95 (1985).
  13. Vermot, J., Pourquié, O. Retinoic acid coordinates somitogenesis and left-right patterning in vertebrate embryos. Nature. 435 (7039), 215-220 (2005).
  14. Rodriguez-Leon, J., et al. Retinoic acid regulates programmed cell death through BMP signalling. Nature Cell Biology. 1 (2), 125-126 (1999).
  15. Rodriguez-Guzman, M., et al. Tendon-muscle crosstalk controls muscle bellies morphogenesis, which is mediated by cell death and retinoic acid signaling. Developmental Biology. 302 (1), 267-280 (2007).
  16. Cohn, M. J., Izpisúa-Belmonte, J. C., Abud, H., Heath, J. K., Tickle, C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
  17. Ohuchi, H., et al. An additional limb can be induced from the flank of the chick embryo by FGF4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 209 (3), 809-816 (1995).
  18. Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis. BMC Medical Genomics. 8, 8 (2015).
  19. Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
  20. Merino, R., et al. Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling. Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).
  21. Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis. Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  23. Díaz-Hernández, M. E., Bustamante, M., Galván-Hernández, C. I., Chimal-Monroy, J. Irx1 and Irx2 are coordinately expressed and regulated by retinoic acid, TGFβ and FGF signaling during chick hindlimb development. PLoS One. 8 (3), 58549 (2013).
  24. Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).
  25. Chimal-Monroy, J., et al. Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling. Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 179tavuk embriyosuuzuv geli imih cre farkl la masmorfogenezr nt olu umukimyasal protein iletimi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır