Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Mevcut protokol, iki temas eden biyolojik karşı yüze eşzamanlı karşılıklı kayma ve normal yük uygulayan bir sürtünme test cihazını tanımlamaktadır.
Primer osteoartritte (OA), yaşlanma ile ilişkili normal 'aşınma ve yıpranma', kıkırdağın yük taşıma ve yağlama fonksiyonlarını sürdürme yeteneğini inhibe ederek zararlı bir fiziksel ortamı teşvik eder. Eklem kıkırdağı ve sinovyumun sürtünmesel etkileşimleri, doku seviyesi aşınması ve hücresel mekanotransdüksiyon yoluyla eklem homeostazını etkileyebilir. Bu mekanik ve mekanobiyolojik süreçleri incelemek için, eklemin hareketini kopyalayabilen bir cihaz tanımlanmıştır. Sürtünme test cihazı, karşılıklı çeviri hareketinin ve normal yükün iki temas eden biyolojik karşı yüze iletilmesini kontrol eder. Bu çalışmada kıkırdak üzerinde sinovyum konfigürasyonu benimsenmiştir ve fosfat tamponlu salin (PBS) veya sinovyal sıvı (SF) banyosunda yapılan testler için sürtünme katsayısı ölçümleri sunulmuştur. Test, SF'nin yüksek yükler altında yağlama özelliklerini vurgulayan bir dizi temas gerilimi için gerçekleştirildi. Bu sürtünme test cihazı, diartrodial eklem artikülasyonu ile ilişkili uygulanan fizyolojik yüke yanıt olarak canlı eklem dokularının fiziksel regülasyonunu incelemek için biyomimetik bir biyoreaktör olarak kullanılabilir.
Osteoartrit (OA), 32 milyondan fazla Amerikalı yetişkini etkileyen, sağlık ve sosyo-ekonomik maliyeti 16,5 milyar doların üzerinde olan zayıflatıcı, dejeneratif bir eklem hastalığıdır1. Hastalık klasik olarak eklem kıkırdağının ve subkondral kemiğin bozulması ile karakterizedir; Bununla birlikte, sinovyumdaki değişiklikler, sinovitin OA semptomları ve progresyonu 2,3,4 ile bağlantılı olması nedeniyle son zamanlarda takdir kazanmıştır. Primer (idiyopatik) OA'da, yaşlanma ile ilişkili normal 'aşınma ve yıpranma', kıkırdağın yük taşıma ve yağlama fonksiyonlarını sürdürme yeteneğini inhibe eder. Eklem kıkırdak tabakalarının uzun süreli kayma temasının veya kıkırdağın implant materyallerine karşı kayan temasının yarattığı gerilmelerin, yüzey altı yorulma yetmezliği nedeniyle delaminasyon aşınmasını kolaylaştırdığı gösterilmiştir 5,6. Eklem7,8 içinde dinamik bir mekanik ortam bulunduğundan, eklem kıkırdağı ve sinovyumun sürtünmesel etkileşimleri, doku seviyesi aşınması ve hücresel mekanotransdüksiyon yoluyla eklem homeostazını etkileyebilir. Bu mekanik ve mekanobiyolojik süreçleri incelemek için, 5,6,9,10,11,12,13 basınç vesürtünme yükü üzerinde sıkı kontrol ile eklemin hareketini çoğaltmak için bir cihaz tasarlanmıştır.
Mevcut protokol, canlı doku eksplantlarının temas eden yüzeylerine karşılıklı, çevirici hareket ve basınç yükü sağlayan bir sürtünme test cihazını tanımlamaktadır. Bilgisayar kontrollü cihaz, kullanıcının her testin süresini, uygulanan yükü, çeviri aşamasının hareket aralığını ve çeviri hızını kontrol etmesini sağlar. Cihaz modülerdir ve doku üzerinde doku (kıkırdak üzerinde kıkırdak ve kıkırdak üzerinde sinovyum) ve cam üzerinde doku gibi çeşitli karşı yüzlerin test edilmesine izin verir. Test cihazı tarafından elde edilen fonksiyonel ölçümlere ek olarak, doku ve yağlama banyosu bileşenleri, belirli bir deneysel rejimin sağladığı biyolojik değişiklikleri değerlendirmek için testten önce ve sonra değerlendirilebilir.
Kıkırdak tribolojisi çalışmaları on yıllardır yapılmakta ve kıkırdak ile cam arasındaki sürtünme katsayılarını ölçmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir ve kıkırdak üzerindeki kıkırdak14,15. Farklı yaklaşımlar, eklem ve / veya ilgili yağlama mekanizması tarafından motive edilir. Genellikle deneysel değişkenlerin kontrolü ile fizyolojik parametrelerin özetlenmesi arasında bir denge vardır. Sarkaç tarzı cihazlar, sağlam eklemleri, bir eklem yüzeyinin ikinci yüzey14,16,17,18 üzerinde serbestçe döndüğü basit bir sarkacın dayanak noktası olarak kullanır. Sağlam derzler kullanmak yerine kıkırdak eksplantları istenilen yüzeyler üzerinden kaydırılarak sürtünme ölçümleri elde edilebilir 14,19,20,21,22,23,24,25. Eklem kıkırdağının bildirilen sürtünme katsayıları, çalışma koşullarına bağlı olarak geniş bir aralıkta (0,002 ila 0,5) değişmiştir 14,26. Döner hareketi23,27,28 çoğaltmak için cihazlar oluşturulmuştur. Gleghorn ve ark.26, Stribeck eğrisi analizini kullanarak kıkırdak yağlama profillerini gözlemlemek için çok kuyulu özel bir tribometre geliştirdi ve kıkırdak ile düz cam karşı yüz arasında doğrusal bir salınımlı kayma hareketi uygulandı.
Bu cihaz, sürtünme tepkilerini izole etmeyi ve çeşitli yükleme koşulları altında canlı dokuların mekanobiyolojisini araştırmayı amaçlamaktadır. Cihaz, eklem kıkırdağı29'un ölçülen sürtünme katsayısına göre saf yuvarlanma hareketindeki direncin ihmal edilebilir olduğu anlayışıyla hem yuvarlanma hem de kayma hareketine yaklaşabilen sıkıştırma kayması yoluyla eklem artikülasyonunu simüle eden basitleştirilmiş bir test kurulumu kullanır. Aslen interstisyel sıvı basınçlandırmasının eklem kıkırdağı9'un sürtünme tepkisi üzerindeki etkilerini incelemek için inşa edilen test cihazı, o zamandan beri kıkırdağın yüzeysel bölgesini çıkarmanın sürtünmesel etkileri 10, sinovyal sıvının yağlama etkileri11, kıkırdak aşınma hipotezleri 5,6,30 ve doku üzerinde sinovyum sürtünme ölçümleri13 gibi konuları araştırmak için kullanılmıştır. . Sürtünme testi biyoreaktörü, steril koşullar altında sürtünme deneyleri yapabilir ve sürtünme kuvvetlerinin canlı kıkırdak ve sinovyumun mekanobiyolojik tepkilerini nasıl etkilediğini keşfetmek için yeni bir mekanizma sağlar. Bu tasarım, diartrodial eklem artikülasyonu ile ilişkili uygulanan fizyolojik yüklemeye yanıt olarak canlı eklem dokularının fiziksel regülasyonunu incelemek için biyomimetik bir biyoreaktör olarak kullanılabilir.
Bu çalışma, bir dizi temas gerilmesi üzerinde ve farklı yağlama banyolarında sinovyum-on-kıkırdak sürtünme testi için bir konfigürasyon sunmaktadır. Çoğu eklemin eklemli yüzey alanı, büyük ölçüde, sinovyal dokudur31. Sinovyum kıkırdak kayması, birincil yük taşıyan yüzeylerde meydana gelmese de, iki doku arasındaki sürtünme etkileşimlerinin doku seviyesi onarımı ve hücre mekanotransdüksiyonu için hala önemli etkileri olabilir. Daha önce, sinovyumun intimal tabakasında bulunan fibroblast benzeri sinovyositlerin (FLS) mekanosensitif olduğu ve sıvı kaynaklı kesme stresine yanıt verdiği gösterilmiştir32. Ayrıca streç 33,34 ve sıvı kaynaklı kesme gerilmesi35'in FLS yağlayıcı üretimini modüle ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, sinovyum ve kıkırdak arasındaki doğrudan kayma teması, sinovyumdaki yerleşik hücrelere başka bir mekanik uyaran sağlayabilir.
Sinovyum sürtünme katsayıları hakkında sadece birkaç rapor yayınlanmıştır31,36. Estell ve ark.13, biyolojik olarak ilgili karşı yüzleri kullanarak önceki karakterizasyonu genişletmeye çalışmışlardır. Sürtünme test cihazının canlı dokuları test etme kabiliyeti ile, temas kesme stresinin sinovyosit fonksiyonu üzerindeki rolünü ve sinovyum ile kıkırdak arasındaki çapraz konuşmaya katkısını aydınlatmak için eklem artikülasyonu sırasında fizyolojik doku etkileşimlerini taklit etmek mümkündür. İkincisi, artrit ve yaralanma sonrası sinovyal eklem iltihabına aracılık etmede rol oynamıştır. Kıkırdağın kondrogenez de dahil olmak üzere multipotent kapasite gösteren sinovyositler içeren sinovyum ve sinovyal sıvıya fiziksel yakınlığı nedeniyle, sinovyositlerin kıkırdak homeostazında rol oynadığı ve eklem yüzeyine kazınarak onarıldığı varsayılmaktadır. Bu bağlamda, kıkırdak-sinovyum ve sinovyum-sinovyumun fiziksel teması ve karşılıklı kesilmesi, sinovyositlerin kıkırdak hasarı olan bölgelere erişilebilirliğini artırabilir37,38,39,40. Sinovyum-on-kıkırdak konfigürasyonlarını kullanan çalışmalar sadece eklem brüt doku mekaniği ve tribolojisi hakkında fikir vermekle kalmayacak, aynı zamanda eklem sağlığını korumak için yeni stratejilere de yol açabilecektir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Bu çalışmada lokal bir mezbahadan elde edilen yavru sığır diz eklemleri kullanılmıştır. Bu tür sığır örneği örnekleriyle yapılan çalışmalar, Columbia Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nden (IACUC) muaf tutulmaktadır.
1. Sürtünme test cihazının tasarlanması
NOT: Sürtünme test cihazının şematik bir temsili Şekil 1'de gösterilmiştir. Cihaz, yapısal destek için bir platform görevi gören sert bir taban plakası (gösterilmemiştir) üzerine inşa edilmiştir.
2. Numune hazırlama ve montaj
3. Sürtünme testi
NOT: Bu testler için özel bir LabVIEW programı ve ilgili donanım (bkz: Ek kodlama dosyaları) kullanılır. Özel kodun LabVIEW 2010 üzerinde oluşturulduğunu ve aynı eski sürümde korunduğunu lütfen unutmayın. Sonuç olarak, kod yazılımın en son sürümüyle ileriye dönük olarak uyumlu olmayabilir. Aşağıdaki düğme ihtarları ve kullanıcı arabirimi başvuruları yalnızca özel kodla ilgili olacaktır. Farklı bir yazılım sürümüyle çalışıyorsanız, kod değiştirilerek benzer bir özel program yazılabilir.
4. Veri işleme
NOT: veri işleme için özel bir MATLAB programı kullanılır (bkz: Ek kodlama dosyaları). Kod, özel LabVIEW kodu tarafından belirtilen çıktı dosyalarını çağırır.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Genç sığır eksplantlarını sürtünme testi için kıkırdak üzerinde bir sinovyum konfigürasyonu kullanıldı. Sinovyum, 10 mm çapında bir akrilik yükleme plakası üzerine monte edildi, böylece intimal tabaka altta yatan kıkırdakla temas halinde olacaktı. Kıkırdak karşı yüzü olarak tibial şerit kullanıldı (Şekil 6A). Tibial şeritler yaklaşık 1,4 mm derinlikte ve 10 mm x 30 mm boyutlarında kesildi. Numuneler, fosfat tamponlu salin (PBS) banyosunda veya sığır s...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Kıkırdak basınç, çekme ve kesme kuvvetlerine ve hidrostatik ve ozmotik basınçlara maruz kaldığı için eklem içinde dinamik bir mekanik ortam bulunur44,45. Kıkırdak, eklemin ana yük taşıyan dokusu olmasına rağmen, sinovyum ayrıca kıkırdak yüzeyi ve dokunun katlandığı bölgelerde kendisiyle sürtünmeli etkileşimlere uğrar. Kıkırdak ve sinovyum arasındaki fiziksel etkileşimler muhtemelen hücrelerin aktarılmasından ve mezenkimal kö...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Bu çalışma Ortopedik Bilimsel Araştırma Vakfı, NIH 5R01 AR068133, NIH TERC 5P41EB027062 ve NIGMS R01 692 GM083925 (Fon Sağlayıcı Kimliği: 10.13039/100000057) tarafından desteklenmiştir.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aluminum foil | Reynolds Group Holdings | Reynolds Wrap | Sterile tissue harvest |
Aluminum-framed acrylic enclosure | Custom made | Friction tester component | |
Autoclavable instant sealing sterilization pouches | Fisherbrand | 01-812-54 | Sterilization of tools |
Autoclave | Buxton | Sterilization of tools | |
Beaker (250 mL) | Pyrex Vista | 70000 | Tissue harvest |
Betadine (Povidone Iodine Prep Solution) | Medline Industries, LP | MDS093906 | Sterile tissue harvest |
Biological safety cabinet | Labconco | Purifier Logic+ Class II, Type A2 BSC | Sterile tissue harvest |
Biospy punch | Steritool Inc. | 50162 | Tissue harvest |
Box cutter | American Safety Razor Company | 94-120-71 | Tissue harvest |
Circular acrylic-sillicone post (synovium) | Custom made | Tissue mounting | |
Culture media | Custom made | DMEM (Cat No. 11-965-118; Gibco) supplemented with 50 μg/mL L-proline (Cat. No. P5607; Sigma), 100 μg/mL sodium pyruvate (Cat. No. S8636; Sigma), 1% ITS (Cat. No. 354350; Corning), and 1% antibiotic–antimycotic (Cat. No. 15-240-062, Gibco) | |
Cyanoacrylate (Loctite 420 Clear) | Henkel | 135455 | Tissue mounting |
Dead weights | OHAUS | Normal load | |
Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | Dilute to 70 % |
Fixed base | ThorLabs, Inc. | SB1T | Friction tester component |
Forceps (synovium harvest) | Fine Science Tools | 11019-12 | Tissue harvest |
Forceps (synovium mounting) | Excelta | 3C-S-PI | Tissue mounting |
Horizontal linear encoder (for translating stage) | RSF Electronics, Inc. | MSA 670.63 | Friction tester component; system resolution of 1 µm |
Hot glue gun and glue | FPC Corporation | Surebonder Pro 4000A | Tissue mounting |
LabVIEW | National Instruments Corporation | LabVIEW 2010 | Friction testing program |
Load cell | JR3 Inc. | 20E12A-M25B | Friction tester component; 0.0019 lbs resolution in x&y, 0.0038 lbs resolution in z |
Loading platen | Custom made | Tissue mounting | |
O-ring | Parker | S1138AS568-009 | Tissue mounting |
Petri dish (60 mm) | Falcon | 351007 | Tissue mounting |
PivotLok Work Positioner (tibia holder) | Industry Depot, Pivot Lok | PL325 | Tissue harvest |
Removable base | ThorLabs, Inc. | SB1B | Friction tester component |
Ring stand | Tissue harvest | ||
Scalpel blades | Havel's Inc. | FSC22 | Tissue harvest |
Scalpel handle | FEATHER Safety Razor Co., Ltd. | No. 4 | Tissue harvest |
Screwdriver | Wera | 3334 | Tissue harvest |
Stage | JMAR | Friction tester component | |
Stepper motor | Oriental Motor Co., Ltd. | PK266-03B | Friction tester component |
Suction tool | Virtual Industries, Inc. | PEN-VAC Vacuum Pen | Tissue mounting |
Support rod | Custom made | Tissue mounting | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | Tissue mounting |
Synovial fluid (bovine) | Animal Technologies, Inc. | Friction testing bath | |
Testing bath | Custom made | Phosphate-Buffered Saline (PBS) with protease inhibitors: 0.04% isothiazolone-base biocide (Proclin 950 Cat. No. 46878-U; Sigma) and 0.1% protease inhibitor - 0.05 M ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA (Cat. No. 0369; Sigma) | |
Tissue culture incubator | Fisher Scientific | Isotemp | Sterile culture |
Vertical linear encoder (for loading stage) | Renishaw | T1031-30A | Friction tester component; 20 nm resolution |
Voice coil actuator | H2W Technologies | NCC20-15-027-1RC | Friction tester component |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır