Domuz Kalbinde Kapasitif İmmünoprob ile Nöropeptit Dinamiğinin İn Vivo Ölçümü

Özet

Peptit vericilerini in vivo olarak ölçmek için yerleşik immünokimyasal yöntemler, çevrimdışı analiz için numune almak üzere mikrodiyaliz veya dökme sıvı çekilmesine dayanır. Bununla birlikte, bunlar mekansal zamansal sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, mevcut tekniklerin sınırlamalarının üstesinden gelen kapasitif bir immünoprob biyosensörünün üretimini ve uygulanmasını açıklamaktadır.

Özet

Hastalığın ilerlemesinin değerlendirilmesi ile ilgili biyobelirteçleri in vivo olarak ölçme yeteneği, bilimsel ve tıbbi topluluklar için büyük ilgi çekicidir. Belirli biyobelirteçleri ölçmenin mevcut yöntemlerinden elde edilen sonuçların çözünürlüğü, hem mekansal hem de geçici olarak çözünürlükte sınırlı olabileceğinden elde edilmesi birkaç gün veya hafta sürebilir (örneğin, enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA], yüksek performanslı sıvı kromatografisi [HPLC] veya kütle spektrometrisi ile analiz edilen interstisyel sıvının sıvı bölmesi mikrodiyalizi); böylece zamanında tanı ve tedavi rehberlikleri bozulur. Bu çalışmada, kapasitif immünoprob biyosensörü (CI probu) kullanılarak peptid transmitterlerinin in vivo olarak saptanması ve ölçülmesi için benzersiz bir teknik bildirilmiştir. Bu probların üretim protokolü ve in vitro karakterizasyonu tanımlanmıştır. Sempatik stimülasyonla uyarılan nöropeptit Y (NPY) salınımının in vivo ölçümleri sağlanmaktadır. NPY salınımı referans olarak norepinefrin sempatik salınımı ile ilişkilidir. Veriler, nöropeptitlerin in vivo hızlı ve lokalize ölçümü için bir yaklaşım göstermektedir. Gelecekteki uygulamalar, hastalık progresyonunun intraoperatif gerçek zamanlı değerlendirmesini ve bu probların minimal invaziv kateter bazlı yayılımını içermektedir.

Giriş

Biyobelirteçlerin tespiti ve nicelleştirilmesi için çeşitli kimyasal yöntemler, hem protein kimyasında hem de klinik tanılarda, özellikle kanser tanılarında ve kardiyovasküler hastalık progresyonunun değerlendirilmesinde rutin olarak kullanılmaktadır. Günümüzde, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve kütle spektrometresi gibi yöntemler, toplu sıvı çekme yoluyla vasküler bölme ^1,2,3'ten veya mikrodiyaliz ile interstisyel bölmeden numune toplanmasına dayanmaktadır. Mikrodiyaliz, ilgilenilen bir bölgeye yerleştirilen bilinen uzunlukta yarı geçirgen bir membran tüpü kullanır. Toplama sıvısı, analiz⁵ için^numuneyi toplamak için birkaç dakika 4 boyunca tüpün içinden geçirilir, böylece zamansal çözünürlüğü sınırlar. Bu şekilde, toplanan örnekler sadece yerel mikro çevrenin zaman içinde ortalama bir değerini sağlar ve perfüzyon hızı ve yeterli numune hacminin toplanması ile sınırlıdır. Ayrıca, bu yöntemler deneysel verilerin ve sinyal ortalamasının bir araya getirilmesini gerektirir; bu nedenle, denekler arasındaki değişkenliği hesaba katmayabilir. Daha da önemlisi, numune toplama ve sonraki çevrimdışı analiz arasındaki süre, acil klinik müdahale ve terapötikleri engellemektedir.

Mevcut protokolde, spesifik biyoaktif peptitlerin zamana bağlı elektriksel tespiti için kapasitif immünoprob biyosensörünün (CI probu) kullanımı özetlenmiştir. Vaskülatür, endokard, kardiyomiyositler ve intrakardiyak gangliyonları innerve eden post-gangliyonik sempatik nöronlardan salınan nöropeptit Y (NPY), kardiyovasküler sistemde majör bir nöromodülatör peptid vericisidir 6,7,8,9. Burada sunulan yöntem NPY'yi ölçmek için tasarlanmıştır ve deneysel fizibilite bir domuz kalp modelinde gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, seçici bir antikorun mevcut olduğu herhangi bir biyoaktif peptit için geçerlidir¹⁰. Bu yöntem, bir platin tel probu ile işlevselleştirilmiş uç^11,12'deki iletken sıvı arasındaki kapasitif bağlantıya dayanır. Bu uygulamada, elektrot ucuna bağlanan ve iletken sıvı ortamına bakan hedef nöropeptide (NPY) karşı bir antikor aracılığıyla etkileşime aracılık edildi. Bu işlevselleştirme, reaktif polidopaminin platin tel probu^10,13'ün ucuna elektrodepozisyonu ile sağlandı.

Antikor işlevselleştirilmiş prob in vivo olarak ilgi çekici bir bölgeye yerleştirildiğinde, uyarılmış endojen NPY salınımı prob ucundaki tutucu antikorlara bağlanmaya yol açar ve elektrot yüzeyindeki iletken sıvı NPY proteini tarafından yer değiştirir. Elektriksel ortamdaki lokal değişiklik, yüksek hareketlilikli, yüksek dielektrik sıvının hareketsiz, statik yüklü bir molekülle yer değiştirmesine neden olur. Bu, elektrot-akışkan arayüzünü ve dolayısıyla bir adım fonksiyonlu komut potansiyeline yanıt olarak yük akımındaki bir değişiklik olarak ölçülen kapasitansını değiştirir. Her bir ölçüm döngüsünün hemen ardından, bağlı NPY'yi elektrostatik etkileşim yoluyla antikordan itmek için negatif bir "sıfırlama" potansiyeli kullanılır, böylece sonraki ölçüm¹⁰ turları için antikor bağlanma bölgeleri temizlenir. Bu, NPY'nin zaman çözümlü bir şekilde ölçülmesine etkili bir şekilde izin verir. Benzersiz CI tekniği, veri havuzu oluşturmadan veya birkaç deney üzerinde sinyal ortalaması olmadan tek bir deneyden dinamik biyobelirteç seviyelerini ölçmek için yukarıda özetlenen mikrodiyaliz tabanlı immünokimyasal yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden gelir⁹ ve neredeyse gerçek zamanlı olarak veri sağlar. Ayrıca, bu yöntemi, zaman içinde çözülmüş ve lokalize bir ölçekte uygun bir antikorun bulunduğu herhangi bir biyobelirteç ile uyarlama yeteneği, hastalık progresyonunun değerlendirilmesi ve terapötik müdahalelerin yönlendirilmesi için immünokimyasal ölçümlerde önemli bir teknik ilerleme sağlamaktadır.

Veri toplama ve analiz yazılımı, IGOR Pro'da (tamamen etkileşimli bir yazılım ortamı) özel olarak yazılmıştır. Bir analogdan dijitale dönüştürücü (A/D) sistemi, bilgisayar kontrolü altında bir komut voltajı yayınladı ve özel bir amplifikatörden veri aldı. Amplifikatör bazı benzersiz özelliklere sahipti. Bunlar, elektrotun değişkenliğini entegre etmek için 1 MOhm veya 10 MOhm geri besleme voltajı kelepçesi devresinin seçilmesine izin veren dört edinme kanalının her biri için bir geri besleme direnci (değiştirilebilir) içeriyordu. Dört edinme kanalının tümü için tek bir kafaya ve karşılıklı topraklama / referans devresine sahip bir sahne ünitesi de cihazı göğsün yakınına tek bir fiziksel modüle yerleştirmek için inşa edildi. Bildirilen tüm verileri toplamak için 1 MOhm geri besleme direnci ayarı kullanılmıştır.

Filtre ve kazanç ayarları amplifikatörden telgrafla çekildi ve veri dosyasına kaydedildi. Veriler, 10 kHz'de sayısallaştırılmış 2 kutuplu analog Bessel filtresi ile 1 kHz'de filtrelendi. Prob ve çevresindeki iletken çözelti arasındaki potansiyel farkı, prob ucunda bir Helmholtz kapasitif tabaka oluşturur. Ligandın prob ucundaki antikora bağlanması, lokal yükün değişmesine ve dolayısıyla Helmholtz kapasitansında bir değişikliğe neden olur. Devrenin kapasitif bileşenindeki bu değişiklik, probu adım fonksiyonlu voltaj protokolündeki potansiyele getirmek için gereken enjekte edilen yükün büyüklüğünde bir kaymaya neden olur. Böylece, belirli bir ligandın işlevselleştirilmiş proba bağlanması, pik kapasitif akımda bir değişiklik olarak elektrot kapasitans ölçümünde bir değişikliğe neden olur.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (8. baskı, 2011) tarafından belirtilen yönergeleri izleyerek gerçekleştirilmiştir. Yaklaşık 75 kg'lık yetişkin erkek Yorkshire domuzları in vivo çalışmalar için kullanılmıştır¹⁰.

1. Kapasitif immünoprob üretimi ve işlevselleştirme

1. 25 cm uzunluğunda perfloroalkoksi (PFA) kaplı platin teli kesin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve platin teli kesmemeye dikkat ederek bir neşter kullanarak bir ucundan yaklaşık 5 mm PFA kaplamayı sıyırın.
2. Platin telin soyulmuş ucunu altın kaplama 1 mm'lik bir erkek konektör pimine yerleştirin ve iğne burunlu pense kullanarak konektör pimi dişlerini platin telin soyulmuş ucunun etrafına sıkın (bkz.
3. Platin teli altın kaplama konektör pimine lehimleyin. Aşırı miktarda lehim kullanmamaya dikkat edin.
4. 50 mg dopamin HCl'yi karıştırarak 10 mM fosfat tamponlu salinin (PBS, pH 6.0) 50 mL'sinde çözerek dopamin çözeltisi hazırlayın.
5. Dopamin tamamen çözündükten sonra, platin telin ucunu taze yapılmış dopamin takviyeli PBS'yi içeren kaba yerleştirin. Altın konektör pimini başlığın bir kanalına takın (bkz.
6. AgCl disk elektrodunu (topraklama elektrodu, bakınız Malzeme Tablosu) baş sahnesindeki toprak kanalına bağlayın. AgCl diskini dopamin takviyeli PBS ve platin tel içeren kaba yerleştirin; sadece disk elektrodunu suya batırmaya dikkat edin, telin veya lehimin herhangi bir uzunluğuna dikkat etmeyin. Devam etmeden önce başlığın referans kanallarına bir tel şönt bağlayın.
7. Etkileşimli veri toplama yazılımını açın (bkz. Aşağıdaki parametrelerle bir testere dişi elektrodepozisyon komutu potansiyel protokolü hazırlayın: başlangıç potansiyeli = -0,6 V; bitiş potansiyeli = +0,65 V; tarama hızı = 0,04 V∙^s-1; biriktirme süresi = 420 s. Tüm tellerin düzgün bir şekilde bağlandığından emin olmak için polidopamin biriktirme protokolüne başlayın.
8. Polidopamin birikimini tamamladıktan sonra, AgCl öğütülmüş peleti ve platin telin ucunu gemiden çıkarın, platin tel elektrodunun ucunu rahatsız etmemeye dikkat edin. Telin ucunu, antikor çözeltisi hazırlanırken 2-5 dakika boyunca PBS (pH 7.4) içeren bir mikrotüpe yerleştirin; tel ucunun mikrotüpün yanlarına veya altına temas etmediğinden emin olun.
   NOT: Polidopamin birikimi sırasında antikor çözeltisi yapılabilir; Bununla birlikte, polidopamin birikimini takiben platin telin dopamin içeren damardan PBS mikrotüpüne aktarılması atlanmamalıdır.
9. Antikor çözeltisini hazırlayın. İlgili antikoru PBS (pH 7.4) ile uygun büyüklükte bir kapta (örneğin, bir mikrotüp) 1:20 oranında birleştirin.
   NOT: Burada kullanılan anti-NPY monoklonal antikoru (bakınız Malzeme Tablosu) 1 mg/mL'de aliquoted edilmiştir; Buradaki örnek bir antikor preparatı, 76 μL PBS'ye karşı 4 μL antikor olacaktır.
10. Platin elektrodun polidopamin biriktirilmiş ucunu oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca antikor çözeltisine batırın, yine platin tel ucunun çözelti içinde asılı kalmasını ve mikrotüpün iç yüzeyinde durmamasını sağlayın.
    NOT: Bu tekniğin yakın zamanda uygulanması, daha sonra kullanmak üzere ıslak veya kuru depolama yerine bu adımdan hemen sonra platin tel elektrodunun kullanılmasını tercih etmiştir.
11. Antikor çözeltisine batırıldıktan sonra, yeni işlevselleştirilmiş kapasitif immünoprob (CI probu) ucunu PBS'de (pH 7.4) kısaca durulayın. Prob artık kullanıma hazırdır.

2. Peptitin in vitro tespiti ve ölçümü için deneysel kurulum

1. CI probunun fonksiyonel ucunu akış odasına yerleştirin, elektrotun ucunu hiçbir şekilde rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü bunu yapmak probun duyusal ucuna zarar verebilir.
   NOT: Akış odası, silikon elastomerin (bakınız Malzeme Tablosu) 35 mm'lik bir kültür kabına dökülmesiyle ve kabın ortasında uzun bir oval boşluk dolgusu ile oluşturulmuştur. Sertleştikten sonra, oval şekil elastomerden çıkarılır. Oda daha sonra Tris tamponlu salin (TBS) ile süperfüzyona tabi tutulur ve 3 mL / dak'lık bir akış hızına izin verilir. Giriş ve çıkışın odadaki sıvı seviyesini koruduğundan emin olun, böylece süperfüzyonatın gelgit hareketi gözlenmez. Akış, CI probu kullanımda olduğu sürece yerinde kalmalıdır.
2. İlk deneysel testten önce, CI probunu koşullandırmak için TBS standart çalıştırması gerçekleştirin. Aşağıdaki komut voltajı protokolünü ayarlayın: pozitif adım potansiyeli = +100 mV; negatif adım potansiyeli = −5 mV; adım süresi = 20 ms; edinme süresi = 600 s.
   NOT: Veri toplamadan önce döngü komuta potansiyelinin ilk aşamasında probun dengelenmesine izin vermek önemlidir.
3. Süperfusatın bileşimini korumak için aynı TBS'yi kullanarak ilgilenilen peptidin bir çözeltisini oluşturun. Süperfüzyonun, boru sistemine veya akış odasına kabarcıklar sokmadan TBS ve peptid takviyeli TBS arasında değiştirilebileceği bir manifold sistemi kurun.
   NOT: Bu çalışmada sentetik domuz NPY peptidi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
4. TBS standart parametrelerini kullanarak peptid algılama veri toplama protokolünü ayarlayın (bkz. adım 2.2.).
   NOT: Bu uygulamada, her deneysel testin süresi 360 s idi (120 s TBS, 120 s peptid takviyeli TBS, 120 s TBS).

3. Kİ probunun in vivo kullanım için uyarlanması

1. Polidopamin birikiminden önce (adım 1.7.), platin tel elektrodunun açıkta kalan ucunu 22 G hipodermik bir iğneden geçirin ve iğnenin ucunun yaklaşık 2 mm ötesinde bırakın. Forseps kullanarak, platin tel elektrodunun ucunu yavaşça geriye doğru bükün ve hipodermik iğnenin ucundan sarkan bir "diken" oluşturun.
   1. İğneyi dikenli uçtan yavaşça çekin, iğne sıvıya temas etmeden kaba yerleştirmek için yeterli tel bırakın. 1.4.-1.11 adımlarıyla devam edin.
      NOT: İn vivo kuruluma bağlı olarak, 25 cm'den daha uzun bir platin tel uzunluğunun kesilmesi gerekebilir.
2. CI probunu ana merkeze bağlamadan önce, tüm elektrik kurulumunun doğru şekilde topraklandığından emin olun. Bunun yapılmaması, deneysel kayıtlar sırasında istenmeyen elektriksel parazitlere neden olabilir.
3. Daha önce yayınlanmış bir rapor^10'u takiben hayvanları uyuşturun.
4. İlgilenilen bölgeyi ortaya çıkarmak için ameliyat yapın.
   NOT: Bu çalışmada kalbi açığa çıkarmak için medyan sternotomi uygulanmıştır. Hayvan cerrahisi ile ilgili ayrıntılar için lütfen Kluge ve ^ark.10'a bakınız.
5. İşlevselleştirilmiş ucu PBS durulamasından nazikçe çıkarın (adım 1.11.), hidodermik iğneyi dikenli C.I. probuna ilerletin ve altın konektör pimini baş kısmına takmadan önce nazikçe ilgili bölgeye yerleştirin. İmplante edildikten sonra, elektrodu yerinde bırakarak hipodermik iğneyi geri çekin.
   NOT: Bu çalışmada prob sol ventrikül miyokard^10'un orta-lateral duvarına yerleştirildi.
6. Uygun elektrik kurulumunu sağladıktan sonra, standart ve deneysel test protokolleriyle devam edin (adım 2.2. ve adım 2.4.).
7. Deneylerin tamamlanmasının ardından, kurumsal olarak onaylanmış teknikleri izleyerek hayvanı ötenazi yapın.
   NOT: Bu çalışmada, hayvanlar derin anestezi altında ventriküler fibrilasyon indüksiyonu ile ötenazi¹⁰.

Sonuçlar

Elektrot üretimi ve karakterizasyonu
Esnek bir kapasitif immünoprob (CI probları) üretildi ve Şekil 1A'da temsili bir görüntü tasvir edildi. Elektrot potansiyeli, bilgisayar kontrollü bir voltaj kelepçesi devresi tarafından ayarlandı (Şekil 1B) ve elektrot, PBS'de yapılan bir polidopamin çözeltisine daldırıldı. Polidopamin, işlevselleştirme için iletken elektrot ucu¹³ üzerine elektro-olarak yatı...

Tartışmalar

Mevcut protokol, hem in vitro hem de in vivo ortamlarda ilgilenilen biyobelirteçleri tespit edebilen ve ölçebilen kapasitif bir immünoprobun (CI probu) üretimini ve test edilmesini açıklamaktadır. Algılama, biyobelirtecin elektrot ucunda hapsedilmesiyle elde edilir. Yakalama olayı, bir platin tel kapasitif immünoprob ile çevresindeki iletken sıvı ortamı arasındaki kapasitif bağlantıyı değiştirir ve probun potansiyel bir kaymasına yanıt olarak yük akımında bir değişiklik olara...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgCl disc electrode	Warner Instruments (Holliston, MA)	64-1307
Anti-NPY monoclonal antibody	Abcam, (Cambridge, MA)	ab112473
Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage	NPI Electronic, (Tamm, Germany)	NA	Based on NPI VA-10M multichannel amplifier
Dopamine HCl	Sigma Aldrich (St. Louis, MO)	H8502-10G
Gold-plated male connector pin	AMP-TE Connectivity (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device	HEKA Elektronik, (Holliston, MA)	NA
Igor Pro data acquisition software, v. 7.08	WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)		Software driving command potential and data acquisition was custom written
Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump	Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)
PFA-coated platinum wire	A-M Systems, (Sequim, WA)	773000	0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter
Silicone elastomer	World Precision Instruments (Sarasota, FL)	SYLG184
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654
Synthetic porcine NPY peptide	Bachem (Torrance, CA)	4011654