Uzun Süreli Yetiştirme için İnsan Miyokard Dokusunun Hazırlanması

Özet

İnsan ventriküler miyokard dokusunun ex vivo ekimi için bir protokol sunuyoruz. Kasılma kuvveti ve kinetiğin ayrıntılı analizinin yanı sıra, in vivo fizyolojik ortamı daha yakından taklit etmek için ön ve son yükün uygulanmasına izin verir.

Özet

Kardiyomiyosit yetiştiriciliği, iki boyutlu (2D) hücre yetiştiriciliğinden iPSC türevi organoidlere kadar çok sayıda gelişme göstermiştir. 2019 yılında, miyokard kasılmasının in vivo durumuna yaklaşırken, insan kalp örneklerinden elde edilen miyokard dilimlerini yetiştirmenin ex vivo bir yolu gösterilmiştir. Bu örnekler çoğunlukla kalp transplantasyonlarından veya sol ventrikül destek cihazı yerleşimlerinden kaynaklanmaktadır. Bir vibratom ve özel olarak geliştirilmiş bir yetiştirme sistemi kullanılarak, sabit ve yaylı bir tel arasına 300 μm kalınlığında dilimler yerleştirilir ve birkaç hafta boyunca istikrarlı ve tekrarlanabilir bir ekime izin verir. Yetiştirme sırasında, dilimler bireysel ayarlara göre sürekli olarak uyarılır. Kasılmalar gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir ve kaydedilebilir ve farmakolojik ajanlar kolayca uygulanabilir. Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerini değerlendirmek için planlanabilir ve gerçekleştirilebilir. Ayrıca, sistem daha fizyolojik bir yetiştirme için değişken bir ön ve son yük ayarı sağlar.

Burada, ticari bir biyomimetik yetiştirme çözeltisi kullanarak, insan sol ventrikül miyokard dilimlerinin başarılı bir şekilde uzun vadeli bir şekilde nasıl yetiştirileceğine dair adım adım bir kılavuz sunuyoruz.

Giriş

Son on yılda, miyokard hücrelerinin in vitro yetiştirilmesi, 2D ve üç boyutlu (3D) tekniklerden, organoidlerin kullanımına ve kardiyak miyositlere farklılaştırılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımına kadar büyük ilerlemeler kaydetmiştir ^1,2,3. Ex vivo ve primer hücre yetiştiriciliğinin, özellikle genetik çalışmalar ve ilaç geliştirme için büyük bir değere sahip olduğu gösterilmiştir ^4,5,6. İnsan dokularının kullanılması, sonuçların translasyonel değerini arttırır. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip miyokard dokularının uzun süreli 3D yetiştiriciliği iyi kurulmamıştır. Bozulmamış geometri, in vivo koşulları taklit etmek için önemli bir özelliktir, çünkü uygun kalp fonksiyonu, farklı hücreler arasındaki iletişim ve hücre-matris etkileşimleri ön koşuldur. Miyokard doku yetiştiriciliği, gelişimin çeşitli aşamalarından geçti. Ex vivo miyokard doku yetiştiriciliğinin başarı oranı ve stabilitesi başlangıçta oldukça düşüktü, ancak son yaklaşımlar umut verici sonuçlar verdi 7,8,9,10,11.

Bunlar arasında, Fischer ve ark., insan miyokard dokusunun yaşayabilirliğinin ve kontraktil performansının ex vivo hücre yetiştiriciliğinde⁷. hafta boyunca korunabileceğini gösteren ilk kişilerdi. Teknikleri, tanımlanmış biyomekanik koşullar ve sürekli elektriksel stimülasyon sağlayan yeni geliştirilen yetiştirme odalarına monte edilen ekilen insan miyokardından kesilen ince doku dilimlerine dayanıyordu. Bu yetiştirme yöntemi, miyokard dokusunun in vivo fonksiyonuna çok benzemektedir ve birkaç bağımsız araştırma grubu^{2,12,13,14,15} tarafından çoğaltılmıştır. Daha da önemlisi, Fischer ve ark. tarafından kullanılan odalar, gelişmiş kuvvetlerin 4 aya kadar sürekli olarak kaydedilmesini sağladı ve böylece bozulmamış insan miyokardının⁷ fizyolojik ve farmakolojik araştırması için benzeri görülmemiş fırsatlar yarattı.

Benzer teknikler diğer gruplar tarafından bağımsız olarak geliştirilmiş ve insan, sıçan, domuz ve tavşan miyokard ^7,10,11'e uygulanmıştır. Pitoulis ve ark. daha sonra bir büzülme döngüsü sırasında normal kuvvet-uzunluk ilişkisini yeniden üreten, ancak yüksek verimli analiz için daha az uygun olan daha fizyolojik bir yöntem geliştirdiler¹⁶. Bu nedenle, biyomimetik yetiştiriciliğin genel yaklaşımı, hayvan deneylerinin azaltılması, iyileştirilmesi ve değiştirilmesi (3R) için bir sonraki adım olarak kabul edilebilir.

Bununla birlikte, bu potansiyelden yararlanmak için standartlaştırılmış prosedürler, yüksek içerik analizleri ve yüksek bir verim seviyesi gerekir. Yaşayan insan miyokardının otomatik dilimlenmesini, ticari olarak temin edilebilen biyomimetik bir yetiştirme sisteminde in vitro bakım ile birleştiren bir teknik sunuyoruz (bakınız Malzeme Tablosu). Önerilen yaklaşımla, tek bir transmural miyokard örneğinden üretilebilecek bireysel dilimlerin sayısı sadece işlem süresi ile sınırlıdır. Yeterli boyut ve kalitede (3 cm x 3 cm) bir örnek genellikle otomatik bir vibratom ile uygun şekilde kesilen 20-40 doku dilimi verir. Bu dilimler sisteme ait yetiştirme odalarına yerleştirilebilir. Odalar, parametreleri modüle edilebilen elektriksel stimülasyona (yani, darbe süresi, polarite, hız ve akım) ve ayrıca odaların içindeki yaylı teller kullanılarak ön ve son yükün ayarlanmasına izin verir. Her dilimin büzülmesi, bir yay teline bağlı küçük bir mıknatısın hareketinden kaydedilir ve yorumlanabilir bir grafik olarak görüntülenir. Veriler her zaman kaydedilebilir ve serbestçe kullanılabilen yazılımlar kullanılarak analiz edilebilir. Sabit taban çizgisi hızının yanı sıra, refrakter dönemlerini, stimülasyon eşiğini, duraklama sonrası potansiyellerini ve kuvvet-frekans ilişkilerini işlevsel olarak değerlendirmek için planlanmış protokoller gerçekleştirilebilir.

Bireysel bir kalpten çoklu miyokard dilimlerinin bu uzun süreli biyomimetik ekimi, hem insan hem de hayvan dokusunda gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açar ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkilerinin taranmasını kolaylaştırır. Çeşitli deneysel yaklaşımlara zaten uygulanmıştır 2,12,13,15. Burada, insan dokusunun hazırlanmasının ayrıntılı bir adım adım tanımını veriyoruz ve sık karşılaşılan yetiştirme sorunlarına çözümler sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada açıklanan deneyler için doku toplama, Münih Üniversitesi ve Bochum Ruhr Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmalar Helsinki Deklarasyonu kılavuzlarına göre yürütülmüştür. Hastalar doku toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onamlarını verdiler.

1. Doku edinimi

1. Kalp nakli veya kalp ameliyatı geçiren hastalardan insan dokusu elde edin.
2. Dokuyu tedarik etmeden önce, 2 L kardiyoplejik çözelti hazırlayın (ayrıca dilimleme tamponu olarak adlandırılır (Tablo 1)).
3. 4 cm x 4 cm boyutlarında transmural sol ventrikül (LV) biyopsisi elde edildikten sonra, dokuyu derhal (eksizyondan sonraki 5 dakika içinde) yaklaşık 70 mL soğuk (4 °C) dilimleme tamponu içeren kapatılabilir plastik tek kullanımlık steril bir beherin içine yerleştirin. 4 °C'de tutun.
   NOT: Bu protokolde kullanılan dilimleme tamponu, dokunun 36 saate kadar soğuk depolanmasına (4 °C) izin verir. Bu, dokunun laboratuvara yakın olmayan kliniklerden soğuk taşınmasına izin verir. Bununla birlikte, 24 saat ≤ taşıma sürelerinin en uygun olduğu kanıtlanmıştır.

2. Agaroz ve vibratomun hazırlanması

1. Yeterli yetiştirme odalarının hazırlandığından ve sterilize edildiğinden emin olun (Şekil 1A).
   1. Odaları ve grafit elektrotları% 10'luk bir izopropanol çözeltisinin 1 L'sine batırın ve gece boyunca çalkalayın. Ertesi gün, odaları 3 dakika boyunca% 100 izopropanol çözeltisine aktarın ve grafit elektrotları 10 dakika boyunca 120 ° C'de otoklav yapın.
   2. Haznelerin ve grafit elektrotların laminer bir akış başlığı altında hava ile kurumasını bekleyin.
   3. Rocker üzerindeki mevcut konumlara göre odaların her birine bir devre kartı takın. Üreticinin talimatlarına göre devre kartına iki grafit elektrot yerleştirin.
   4. Kirlenmeyi önlemek için haznenin üstüne 35 mm'lik bir Petri kabı kapağı yerleştirin.
2. Sistemi bir bilgisayara bağlayarak bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO_2'de Miyodish yetiştirme sistemini (Malzeme Tablosuna bakınız) kurun (Şekil 1B).
3. % 4 düşük eriyik agarozunu dilimleme tamponunda hazırlayın (glikoz olmadan; Tablo 2). Agaroz 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
   1. Deney gününde, 80 ° C'de ayarlanmış bir su banyosu kullanarak bir stok hacmi agaroz çözeltisini eritin. Miktara bağlı olarak, erime yaklaşık 30 dakika sürer.
   2. Agaroz sıvı olduğunda, ek 2 mL hava ile 10 mL'lik bir şırıngaya 8 mL sıvı agaroz çekin. Şırıngayı steril bir kapakla kapatın ve agarozun katılaşmasını önlemek ve numunenin hipertermi hasarını önlemek için sıcaklığını dengelemek için 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna baş aşağı yerleştirin.
4. Varsa, yeterli soğutma kapasitesine izin vermek için doku dilimlemeden en az 30 dakika önce vibratomun su soğutma cihazını açın. Su sirkülasyonunun sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.
   NOT: Burada kullanılan kesme tepsisi ve soğutma plakasının her ikisi de dahili bir su sirkülasyonu içeriyordu. Bu, soğutma ve kontaminasyon risklerini azaltmak için şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, buzu bir soğutma tekniği olarak kullanmak da mümkündür. Ayrıca, su soğutma cihazının protokolün bu noktasında vibratomun kesme tepsisine ve / veya soğutma plakasına bağlanması gerekmez.
5. Vibratomun dilimleme tepsisini ve numune plakasını, tüm yüzeyleri en az 3 dakika boyunca% 100 izopropanol ile yıkayarak temizleyin.
   NOT: Kullanılan vibratom sistemine bağlı olarak, vibratom kurulumu farklı olabilir. Kurulum ve bıçak kalibrasyon yöntemleri hakkında bilgi için laboratuvarda bulunan vibratomun el kitabına bakın.
6. Kesme tepsisini dilimleme tamponu ile %90-%95'e kadar doldurun. Şu anda kullanılan kurulumda, bu yaklaşık 400 mL'ye karşılık gelir. Su soğutma cihazının borusunu, vibratomun kesme tepsisindeki ve soğutma plakasındaki valflere bağlayın.
7. Hazırlık için gerekli tüm aletleri, 5 s için% 100 izopropanol çözeltisine batırarak dezenfekte edin. Aletleri izopropanol çözeltisinden çıkarın ve laminer akış başlığının altında hava ile kurulayın.

3. Numunelerin kesilmesi ve gömülmesi

1. Doku örneğini soğuk dilimleme tamponu ile doldurulmuş 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Çanağı 4 ° C'de bir soğutma plakasında tutun (soğutucuya bağlı veya buz üzerine yerleştirilmiş).
2. Endokardın cımbızla tutulmasını ve yaklaşık 3 mm endokardiyal dokuyu kesmek için makas kullanılmasıyla endokardiyal trabekülleri çıkarın. Aynı şekilde, varsa epikardın altındaki aşırı yağ dokusunu çıkarın.
3. Kesilmiş doku numunesini, endokardiyal tarafı yukarıya, kare konumda (0,9 cm x 0,9 cm; Şekil 1C, D). Her iğne ucunun çapraz kenarının içe dönük olduğundan emin olun. Bu, fiksasyonu arttırır ve miyokardın zarar görmesini önler.
   DİKKAT: Yukarıda belirtilen karenin oryantasyonu, beklenen baskın miyofiber yönüne ortogonal olmalıdır.
4. Bir neşter kullanarak dört iğne karesinin dışındaki tüm fazla dokuları kesin. Orijinal numunenin boyutu izin veriyorsa, bu preparat sırasında aynı ham numuneden iki miyokard dokusu örneği kullanın.
5. Cımbız kullanarak, numune üzerinde kalan fazla dilimleme tamponunu çıkarmak için kesilmiş numuneyi steril bir doku parçasına yerleştirin. Numunenin kurumasını önlemek için, numuneyi doku üzerinde 10 saniyeden daha uzun süre tutmayın.
6. Numuneleri 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin, böylece bıçak kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak kesilir ve epikard aşağı doğru bakar. Preparat iki numune içeriyorsa, numunelerin ortalandığından ve birbirine temas etmediğinden emin olun.
7. Agaroz şırıngasını su banyosundan alın ve örnekleri agaroza batırın. (Şekil 2A). Agarozun bir soğutma plakası üzerinde 5 dakika katılaşmasına izin verin. Numune (ler) Petri kabı ile temas halinde kalmalıdır, bu da kesme düzleminin baskın miyokard lifi yönüne paralel olmasını sağlayacaktır.
   DİKKAT: Hava kabarcıklarını önlemek için şırıngayı tamamen boşaltmayın. Numunelerin daldırılması sırasında şırıngada kalan agaroz miktarına dikkat edin. Numunelerle birlikte tabakta hava kabarcıkları olması durumunda, hava kabarcıklarını dikkatlice şırıngaya geri çekin.

4. Numunelerin kesme tepsisine yerleştirilmesi

1. Numuneyi (ler) i içeren katılaşmış agarozu, bir spatula veya benzeri bir alet kullanarak, numune ile Petri kabının yan tarafı arasına sokarak 35 mm'lik Petri kabından çıkarın. Örnekleri kapalı tutarken agarozun bir kısmını neşter kullanarak kesin.
   DİKKAT: Agarozu çok fazla çıkarmayın. X/Z düzleminde uzun ve kısa kenarlarda en az 5 mm agaroz kalmalıdır.
   NOT: Adım 4.2-4.4'ün hızlı bir şekilde art arda (yani, maksimum 5 sn) gerçekleştirilmesi gerekir. Başlamadan önce gerekli tüm araçları elinizin altında bulundurun. Yerleştirmeden sonra numunenin yeniden konumlandırılması mümkün değildir. Tutkalın havaya ve neme maruz kalmasını sınırlamaya çalışın. Hava veya sıvılarla temas, yapıştırıcıyı katılaştıracak ve kullanılamaz hale getirecektir.
2. Bir pipetle, kesme platformunun ortasına ve çevresine 60 μL yapıştırıcı yerleştirin ve dağıtın.
3. Agarozda bulunan numunenin epikardiyal tarafını cımbız kullanarak yapıştırılmış alanın üzerine yerleştirin. Yeniden konumlandırmayın. Numunenin endokardiyal tarafı agarozda görünür olmalıdır. Tutkalın 1 dakika katılaşmasına izin verin. Numuneyi içeren agarozu üstten künt bir aletle (örneğin cımbız) hafifçe bastırırken, agarozun kesilmesini veya zarar görmesini önleyin.
4. Numune platformunu, dilimleme tamponu ile doldurulmuş vibratomun kesme tepsisine belirlenen konumuna yerleştirin.

5. Vibratomu başlatma

1. Titreşim genliğini 1 mm'ye ve ilk kesme hızını 0,07 mm/sn'ye ayarlayın. Dilimleri kesmek için dilimin kalınlığını 300 μm'ye ayarlayın.
2. Bıçak sadece agarozu kestiği sürece, kesme hızını maksimuma çıkarın, bu durumda 1,50 mm / s'dir. Vibratom dokuyu kesmeye başlar başlamaz, hızı hemen 0,07 mm / s'ye düşürün.
   NOT: Doku düzgün bir şekilde dilimlenmezse, örneğin numunede geniş fibrotik alanlar varsa, kesme genliğini 1,5 mm'ye kadar artırmaya ve kesme hızını 0,04 mm / s'ye düşürmeye yardımcı olabilir.

6. Dilimleme prosedürü sırasında orta ve inkübatör hazırlığı

1. Her yetiştirme odasını 2,4 mL tam yetiştirme ortamı ile doldurun (Tablo 3).
2. Yetiştirme sistemi üzerinde ortamla dolu yetiştirme odalarını 37 °C, %5 CO 2, %_{21 O 2} ve %80 nem olarak ayarlanmış inkübatöre yerleştirin. Ortamı en az 20 dakika boyunca dengeleyin.
3. Yetiştirme sistemini bir bilgisayara bağlayın ve ilgili yazılım programını başlatın.
4. Rocker hızını 60 rpm'ye ayarlayın ve stimülasyon parametrelerini (stimülasyon darbeleri ve frekansı) önceden ayarlayın. İnsan kalp dilimleri için, standart stimülasyonu, her biri 3 ms pozitif akım, 1 ms duraklama ve 3 ms ters akım darbesinden oluşan, dakikada 30 atım (BPM) hızında 50 mA akımlı bifazik impulslara ayarlayın.
   NOT: İyi korunmuş dokularda, tipik stimülasyon eşiği yaklaşık 15 mA'dır. Güvenilir stimülasyonu sağlamak ve stimülasyon eşiğindeki olası herhangi bir artışı hesaba katmak için, akımı stimülasyon eşiğini iki ila üç kat aşan bir değere ayarlamanız önerilir.
5. Yetiştirme odalarının elektrotlarının doğru çalıştığını doğrulamak için yazılımın elektrot göstergelerini kontrol edin.
   NOT: Yetiştirme yazılımındaki kanal göstergesi kırmızıya döndüğünde harekete geçilmesi gerekir. Bu durumda, bipolar nabız yükleri dengeli değildir.

7. Dilimlerin hazırlanması

NOT: İlk subendokardiyal dilimler genellikle doku ekimi için uygun değildir ve düzensiz morfoloji nedeniyle atılması gerekir. İlk beş ila 10 dilimden sonra, dilim dokusu ve morfolojisi gelişir. İdeal dilim en az 1 cm x 1 cm'dir, fibrotik yamaları yoktur veya sadece sınırlı değildir, parçalanmamıştır ve homojen lif hizalamasına sahiptir (Şekil 2B, D). Miyozit lifleri arasında yer alan interstisyel fibroz, başarısız insan miyokardında sıklıkla bulunur. Şaşırtıcı bir şekilde, bu uygulama başarısının olumsuz bir göstergesi değildir.

1. Dilimlerin kurumamasını sağlamak için 5 cm'lik Petri kabı kapağına yeterli miktarda soğuk dilimleme tamponu dökün. Dilimleri, soğuk dilimleme tamponunu içeren Petri kabı kapağına yerleştirin.
2. Ağarozu cımbız kullanarak dokudan ayırın. Dokuya dokunmayı önleyin. Dokuyu dikkatli bir şekilde ele alın, çünkü dokudaki herhangi bir hasar, yetiştiriciliğin başarı oranını azaltacaktır.
3. Bir ışık kaynağına karşı yakın inceleme yaparak miyokard liflerinin yönünü belirleyin. Bu, plastik üçgenleri adım 7.6'da dokuya bağlarken önemlidir.
   NOT: Adım 7.4 ve 7.5'in 5 saniye içinde hızlı bir şekilde art arda gerçekleştirilmesi gerekir.
4. Dokuyu yetiştirme odalarının içine sabitlemek için yapıştırıcı kullanarak bir numuneye iki plastik üçgen takın.
   1. Steril bir Petri kabı kapağına 1 μL yapıştırıcı yerleştirin. Otoklavlanmış plastik üçgenlerden birini almak için kancalı bir cımbız kullanın. Üçgenin ön kenarını hızlı bir şekilde yapıştırıcıya batırın ve üçgeni kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak numuneye yapıştırın. Diğer üçgen için bu işlemi tekrarlayın.
5. Üçgen genişliğini aşan dokuyu bir neşter ile kesin (Şekil 2C). Dilimi, takılı iki üçgenle birlikte kesme tepsisinin dilimleme tamponuna geri yerleştirin.
   NOT: Yetiştirme odalarını doldurmak için yeterli dilim hazırlanana kadar 7.2 ila 7.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Dilimlerin zayıf kasılma ile değiştirilmesine izin vermek için birkaç ek dilim hazırlamanızı öneririz.

8. Dilimlerin montajı

NOT: Son yük, yetiştirme odalarındaki yay telinin sertliği ile belirlenir. Yay telinin kalınlığına bağlı olarak üç farklı tip mevcuttur.

1. Kuluçka makinesinden orta dolgulu bir ekim odası alın. Hazırlanan dilimlerden birini seçin ve her pime bir üçgen bağlayarak hazneye yerleştirin.
2. Montaj pimleri arasındaki mesafeyi numune boyutuna göre ayarlayın. Numunenin ortama batırıldığından emin olun. Odayı, inkübatördeki yetiştirme sisteminin belirlenmiş soketine geri yerleştirin.
   DİKKAT: Dokuyu aşırı germeyin ve yay telini aşırı bükmeyin!
3. Tabağın rocker'a yerleştirilmesinden sonra ön yük gerilimini ayarlayın.
   1. Ayar vidasını saat yönünün tersine çevirerek ön yükü azaltın. Bilgisayar ekranındaki ilgili grafiğin taban çizgisi artık değişmeyene kadar bunu yapın.
   2. Ayar vidasını saat yönünde çevirerek ön yükü dikkatlice artırın (yani gerilimi artırın). En yüksek sertliğe sahip odalar için, grafikteki karşılık gelen taban çizgisi, 1 mN ön yüke karşılık gelen 1000-1200 birim artana kadar devam edin.
      NOT: Kesin ayarlama, üreticinin talimatlarına göre bir deneyden önce kalibrasyonla belirlenebilen bir yetiştirme odasının bireysel yay sabitine bağlı olacaktır. Kayıt yazılımı, kuvvetlerin μN cinsinden eşit olarak görüntülenmesi için bireysel oda kalibrasyonunun dikkate alınmasına izin verir. Yetiştiriciliğin başlangıcından itibaren elektriksel stimülasyon uygulanması tavsiye edilir. Bu nedenle, ön yük ayarı sırasında dilimin büzülmeye başlaması mümkündür. Bu durumda, ön yükü değerlendirmek için diyastolik taban çizgisine odaklanın.

9. Ortamın değiştirilmesi

1. Tablo 3'teki tarife göre yetiştirme ortamı hazırlayın. Ortamın kullanımından kısa bir süre önce, 50 mL'lik bir tüpe 50 μL β-merkaptoetanol (50 mM) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
2. Her 2 günde bir, ekim ortamını kısmen değiştirin. Miyokard dilimlerinin uzun süreli ekimi isteniyorsa, ortamı her 2 günde bir yenileyin.
3. Taze ortamı bir su banyosunda veya sıcak hava inkübatöründe 37 ° C'de 30-45 dakika önceden ısıtın. Bir yetiştirme odasını inkübatörden çıkarın ve laminer bir akış başlığının altına yerleştirin.
   DİKKAT: Düşük sıcaklığa bağlı hiper kontraktürleri önlemek için odayı ve ortamı 37 ° C'de (> 35 ° C) sıcak tutmak önemlidir. Orta değişimden sonraki birkaç saat içinde diyastolik gerilimin artması olarak daha az belirgin hasar mevcut olabilir. Bu iyileşmiş gibi görünebilir, ancak tekrarlanan stres biriken bozulmaya neden olabilir.
4. Ortamı ekim odasından çıkarın, odada yaklaşık 0,8 mL bırakın. Aynı odaya 1,6 mL taze ortam ekleyin. Toplam ortam hacmi, oda başına yaklaşık 2,4 mL olmalıdır.
5. Odanın kapağını geri yerleştirin ve yetiştirme odasını tekrar kendi konumuna getirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Miyokard dilimlerinin daralması, yetiştirme odasının karşılık gelen konektörüne yerleştirilmesinden sonra bilgisayar ekranında görüntülendi (Şekil 3). İnsan miyokard dilimlerinin kasılması, stimülasyondan hemen sonra başladı. Dilimler 5-10 dakika boyunca hiperkontrakte edildi. Bu, hasarlı doku fraksiyonlarının tonik kontraktürünün neden olduğu diyastolik kuvvetlerin artması olarak görülebiliyordu. Bu işlem 1-1.5 saat içinde değişen derecelere geri döndür?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Geçmişte, kardiyovasküler araştırmalar kardiyomiyositlerin yetiştirilmesinde büyük ilerlemeler kaydetmiştir. Bununla birlikte, bozulmamış geometriye sahip kardiyomiyositlerin 3D ekimi henüz iyi kurulmamıştır. Miyokard dokusunun ex vivo yetiştirilmesi için uygulanan önceki protokollerle karşılaştırıldığında, burada anlattığımız protokol, dokunun in vivo ortamını daha yakından andırmaktadır. Ayrıca, yükleme öncesi ve sonrası uygulama daha biyomimetik bir ortam sağla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish culture system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070