Farelerde Atriyal Fibrilasyon Duyarlılığını Değerlendirmek için Transözofageal Atriyal Pacing'in Optimizasyonu

Özet

Mevcut protokol, farelerde atriyal fibrilasyon duyarlılığını değerlendirmek için transözofageal atriyal pacing kullanıldığında deneysel parametrelerin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Özet

Atriyal fibrilasyon (AF) için genetik ve edinilmiş risk faktörlerinin fare modelleri, AF'nin moleküler belirleyicilerinin araştırılmasında değerli olduğunu kanıtlamıştır. Programlanmış elektriksel stimülasyon, hayatta kalma prosedürü olarak transözofageal atriyal pacing kullanılarak gerçekleştirilebilir, böylece aynı hayvanda seri test yapılabilir. Bununla birlikte, tekrarlanabilirliği zorlaştıran çok sayıda pacing protokolü vardır. Mevcut protokol, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği artırmak için modele özgü deneysel parametreler geliştirmek için standartlaştırılmış bir strateji sağlamayı amaçlamaktadır. Çalışma sırasındaki yaş, cinsiyet ve pacing protokolünün parametreleri (örneğin, pacing modu ve AF duyarlılığının tanımı) dahil olmak üzere, incelenen spesifik model için deneysel yöntemleri optimize etmek için ön çalışmalar yapılır. Önemli olarak, yüksek uyaran enerjilerinden kaçınmak için özen gösterilir, çünkü bu, gangliyonik pleksi'nin yanlışlıkla parasempatik aktivasyonla uyarılmasına neden olabilir, pacing sırasında abartılı atriyoventriküler (AV) blok ile kendini gösterir ve genellikle yapay AF indüksiyonu ile ilişkilidir. Bu komplikasyonu gösteren hayvanlar analizin dışında tutulmalıdır.

Giriş

Atriyal fibrilasyon (AF), çoklu edinsel ve genetik risk faktörleri için son ortak yolu temsil eder. AF substratının patofizyolojik mekanizmalarını araştıran çalışmalar için, fare modelleri, genetik manipülasyonun kolaylığı ve genel olarak, farklı klinik fenotipler ^1,2,3 için insanlarda gözlenen AF duyarlılığını yeniden ürettikleri gerçeği göz önüne alındığında avantajlıdır. Bununla birlikte, fareler nadiren spontan AF⁴ geliştirir ve bu da provokatif atriyal pacing çalışmalarının kullanılmasını gerektirir.

Programlanmış elektriksel stimülasyon (PES), intrakardiyak⁵ veya transözofageal⁶ pacing kullanılarak murin atriyal elektrofizyolojisini ve AF duyarlılığını değerlendirmek için yapılabilir. Transözofageal yaklaşım bir sağkalım prosedürü olarak özellikle avantajlı olsa da, kullanımı çok sayıda yayınlanmış deneysel protokol ^7,8 ve tekrarlanabilirliği engelleyebilecek değişkenlik kaynakları⁹ ile karmaşıktır. Ayrıca, sınırlı rapor edilen protokol karşılaştırmaları, uygun bir pacing protokolünün seçilmesini zorlaştırmaktadır.

Mevcut protokol, tekrarlanabilirliği artırmak amacıyla murin AF duyarlılığını değerlendirmek için modele özgü transözofageal PES yöntemleri geliştirmek için sistematik bir strateji kullanmayı amaçlamaktadır. Daha da önemlisi, yaş, cinsiyet ve pacing modu değişkenliğini hesaba katarak pacing protokolünü optimize etmek için ilk pilot çalışmalar yapılır ve sonuçları karıştırabilecek yanlışlıkla parasempatik stimülasyonu en aza indirmek için tasarlanmış pacing⁹.

Protokol

Bu prosedür Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile tutarlıdır. Protokol hem genetik⁹ kullanılarak geliştirildi hem de AF duyarlılığının¹⁰ (örneğin hipertansiyon) fare modelini edindi. Operatör, incelenen farenin fenotipine kör edildi.

1. Hayvan seçimi

1. Genetik modeller için, optimal AF duyarlılığı dönemini belirlemek için fareleri aşağıda açıklandığı gibi iki haftada bir (yani her iki haftada bir) atriyal pacing'e maruz bırakın (bkz. adım 6.).
   1. 8 haftalıkken iki haftada bir tempoya başlayın. Değişkenliği azaltmak için vahşi tip çöp arkadaşlarını kontrol olarak kullanın. Her iki cinsiyeti de inceleyin, çünkü AF fenotip⁹ gelişmeyebilir.
2. Edinilmiş modeller için, fareler fiziksel olgunluğa ulaştıktan sonra (~ 12 haftalık) pacing ^yapın10. Yukarıda belirtildiği gibi, her iki cinsiyeti de inceleyin.
3. Bu ön çalışmalar sırasında, optimum pacing modunu belirlemek için hem patlama hızı⁸ (sabit bir pacing döngü uzunluğu [CL] kullanarak) hem de azalan pacing⁷ (giderek daha kısa bir pacing CL ile) gerçekleştirin. Her prosedürü en az 24 saat ayırın.
   NOT: Artan sayıda fare incelendikçe, AF'ye duyarlı farelerde AF'yi destekleyen ancak kontrolleri destekleyen optimal yaş, cinsiyet ve pacing modunu belirlemek için biriken verileri gözden geçirin.
   1. AF duyarlılığının birden fazla tanımını kullanarak verileri analiz edin (örneğin, AF ataklarının sayısı⁸, toplam AF süresi 9, AF insidansı⁴ ve yaygın olarak 10^s 11 veya 15 s 12 olarak tanımlanan sürekli AF insidansı ve hatta 5 dakika^13,14'e kadar) çünkü bazı modeller biri için bir AF fenotipi gösterebilir^, ancak tüm tanımlar⁹ için değil.
      NOT: AF atağının tanımı ve AF duyarlılığı yayınlanmış çalışmalar arasında farklılık göstermektedir ^4,7. AF atak⁸ genellikle en az 1 saniye boyunca meydana gelen düzensiz düzensiz ventrikül yanıtı ile hızlı atriyal aktivite olarak tanımlanır (Şekil 1). AF'ye ek olarak, atriyal pacing ayrıca düzenli veya düzensiz bir ventrikül yanıtı ile atriyal flutter'ı da indükleyebilir.
4. Ek fareler üzerinde sonraki çalışmalar için optimize edilmiş modele özgü parametreleri ve AF duyarlılığının tanımını kullanın.

2. Hayvan hazırlığı

1. Fareyi bir indüksiyon odasında, 1 L/dak %100 oksijende %3 izofluran kullanarak (bakınız Malzeme Tablosu) anestezi altına alın.
   NOT: İzofluran zararlıdır. Cildi veya gözü tahriş edebilir ve diğer merkezi sinir sistemi toksisitelerinin yanı sıra baş dönmesine, yorgunluğa ve baş ağrısına neden olabilir. İyi havalandırılan bir alanda uygun bir süpürme yöntemiyle (örneğin, aktif karbon bidonu) kullanın.
2. Pedal refleksinin kaybedilmesinden sonra, fareyi, arka bacakları ped yüzeyine bantlanmış olarak vücut ısısını yaklaşık 37 ° C'de tutmak için tasarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü bir konuma getirin.
3. Kurumayı önlemek için gözlere yağlayıcı göz merhemi uygulayın.
4. Farenin burnunun üzerine güvenli bir şekilde anestezik bir maske yerleştirin. 1 L/dk %100 oksijende %1 izofluran kullanarak anestezi idaresine başlayın. Burun deliklerinin tıkanıklıktan arındırıldığından emin olun, çünkü fareler zorunlu burun soluyanlardır.
5. Bir biyolojik amplifikatöre bağlı 27 G EKG iğne elektrotlarının deri altına yerleştirilmesiyle bir yüzey elektrokardiyogramı (EKG, kurşun I) ve ön ayaklara veri toplama donanımı elde edin. Sol arka bacağa bir iğne elektrodu yerleştirerek sinyali topraklayın.

3. Kateter yerleştirme

1. İzofluran maskesini fareden kısaca çıkarın.
2. Yemek borusuna bir uyarıcı ve uyaran izolatörü (bkz. Malzeme Tablosu) bağlı 2-F oktapolar elektrot kateteri ( elektrot genişliği ve aralığı = 0,5 mm) yerleştirin (Şekil 2).
   1. Ağızdan (boyun uzatılmış) kifoid kıkırdağın hemen üstüne kadar olan mesafeye yaklaşan bir derinliğe yerleştirin.
3. İzofluran maskesini farenin burun deliklerinin üzerine yeniden yerleştirin.
4. Analiz yazılımı kullanarak EKG derivasyonunun sürekli kaydedilmesiyle veri toplamaya başlayın (bkz.
5. Uyaran izolatör modunu bipolar olarak ayarlayın. Stimülasyon sırasında en çok kullanılan elektrot çiftini kullanın.
6. Yakalamayı sağlamak için kateteri yemek borusu içinde uygun şekilde konumlandırın. Bunu yapmak için, sinüs CL'sinden biraz daha kısa bir CL'de darbe genişliği 2 ms olan 1,5 mA'lık bir uyaran uygulayın (örneğin; sinüs CL 120 ms ise 100 ms'lik bir CL kullanın). Tutarlı atriyal yakalama elde edilene kadar kateteri dikkatlice konumlandırın.

4. Eşik belirleme

1. Atriyal diyastolik yakalama eşiğini (TH) belirlemek için, atriyal yakalama için kullanılan CL'de 2 ms'lik bir darbe genişliği ile 1.5 mA'da pacing başlatın. Atriyal yakalama kaybına kadar uyaran genliğini 0,05 mA artışlarla azaltın, ardından yakalamaya kadar artırın.
   NOT: Tutarlı atriyal yakalamanın elde edildiği en düşük genlik atriyal TH'dir. Yüksek uyaran genliklerinde parasempatik stimülasyon endişesi nedeniyle, yapay AF indüksiyonu⁹ ile pacing sırasında aşırı AV bloğu tarafından yansıtılan maksimum kabul edilebilir TH, 0.75 mA'dır. Gerekirse, TH ≤0.75 mA'ya ulaşmak için kateteri yeniden konumlandırın.
2. Uyaran genliğini TH'nin iki katına ayarlayın.

5. Elektrofizyolojik özelliklerin belirlenmesi

1. AF indüksiyonu¹⁵ için hızlı atriyal pacing öncesinde sinüs düğümü iyileşme süresi (SNRT), Wenckebach döngü uzunluğu (WCL) ve atriyoventriküler etkili refrakter dönem (AVERP) dahil olmak üzere elektrofizyolojik parametreleri ölçün.

6. Atriyal aritmi duyarlılığı

1. Farklı CL'lerde patlama hızı veya ilk çalışmalardan belirlenen düşük tempoyu kullanarak 2 ms'lik bir darbe genişliğine sahip iki TH'de pacing gerçekleştirin (adım 1.1.-1.4.).
2. Patlama hızı için, 15 s için 50 ms'lik bir başlangıç CL'sinde hızlayın ve sonraki trenler 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms ve 15 ms ^8,10'luk CL'lerde gerçekleşir. Devam etmeden önce iyileşmeye izin vermek için her tempolu trenden sonra tempoyu 30 sn duraklatın. Bir tempolu trenden sonra AF oluşursa, sonraki tempoya geçmeden önce sonlandırmadan sonra 30 s bekleyin.
3. Azaltılmış tempo için, 40 ms'lik bir CL'de hız yapın ve CL'yi 20 ms^7'de sona erene kadar her 2 saniyede bir 2 ms azaltın. Her treni takiben iyileşme için 30 saniyelik bir duraklama ile üçlü¹⁶ veya beşli^17'de tempolu trenler gerçekleştirin. Yukarıdaki gibi, AF gelişirse, devam etmeden önce sonlandırmadan sonra 30 s bekleyin.
   NOT: Ön deneyler sırasında protokol parametrelerini optimize ederken (yani, adım 1.1.-1.5.), beş trenle azaltılmış tempo gerçekleştirin. Üç veya beş trenin en yüksek hassasiyeti sağlayıp sağlamadığını belirlemek için post hoc bir analiz yapın.
4. Son tempo trenini takiben 30 sn sinüs ritmi üzerine veya 10 dakikalık bir AF atağından sonra, hangisi önce gelirse, prosedürü sonlandırın.

7. İşlem sonrası

1. Veri alımını durdurun.
2. Kateter ve EKG elektrotlarını nazikçe çıkarın.
3. Anesteziyi durdurun.
4. Anestezi uygulanan fareyi bir kafese yerleştirin ve iyileşmeyi sağlamak için 10 dakika boyunca gözlemleyin.
5. Veri dosyasını kaydedin. Seri test durumunda, pacing prosedürünü tekrarlamadan önce en az 24 saat bekleyin.

Sonuçlar

Transözofageal atriyal pacing çalışmaları, SNRT ve AVERP'nin yanı sıra AF duyarlılığını 6'yı belirleyerek SA ve AV düğümlerinin elektrofizyolojik özelliklerini^{değerlendirir (}Şekil 1). EKG kaydı, P dalga süresi, PR aralığı, QRS süresi ve QT / QTc aralıklarının ölçülmesini sağlar. Hızlı atriyal pacing sırasında EKG'nin sürekli kaydedilmesi, AF kırılganlığının aşağıdaki ölçümlerini sağlayabilir: çalışma sırasında ind...

Tartışmalar

Transözofageal atriyal pacing sadece aynı hayvanda seri çalışmalara izin vermekle kalmaz, aynı zamanda süresi tipik olarak intrakardiyak çalışmalardan (~ 20 dakika) daha kısadır, böylece anestezik kullanımı ve elektrofizyolojik parametreler üzerindeki etkilerini en aza indirir.

Her bir fare modeli için yöntemleri başlangıçta optimize etmek çok önemlidir. Yaşlanma, normal farelerde AF indüklenebilirliğini^{arttırır 18,19}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G ECG electrodes	ADInstruments	MLA1204
2-F octapolar electrode catheter	NuMED	CIBercath
Activated carbon canister	VetEquip	931401
Analysis software	ADInstruments	LabChart v8.1.13
Biological amplifier	ADInstruments	FE231
Data acquisition hardware	ADInstruments	PowerLab 26T
Eye ointment	MWI Veterinary	NC1886507
Heating pad	Braintree Scientific	DPIP
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Stimulator	Bloom Associates	DTU-210
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	Model A365