Floresan Biyosensör Dinamiğinin ve Hormon Salgı Profillerinin Senkron Değerlendirmesi için İnsan Psödoislet Sistemi

Özet

Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.

Özet

Pankreas boyunca serpiştirilmiş özel endokrin ve destekleyici hücrelerin küçük 3D koleksiyonları olan Langerhans'ın pankreas adacıkları, kan şekerini düşüren beta hücreleri tarafından insülin salgılanması yoluyla glikoz homeostazının kontrolünde merkezi bir role sahiptir ve glukagon, kan şekerini yükselten alfa hücreleri tarafından. cAMP'nin aracılık ettiği hücreler de dahil olmak üzere hücre içi sinyal yolları, düzenlenmiş alfa ve beta hücre hormonu sekresyonu için anahtardır. 3D adacık yapısı, koordineli adacık işlevi için gerekli olmakla birlikte, birincil insan adacık hücrelerinde hücre içi sinyal yollarının mekanik çalışmaları için deneysel zorluklar sunar. Bu zorlukların ve sınırlamaların üstesinden gelmek için bu protokol, morfolojileri, bileşimleri ve işlevleri bakımından doğal adacıklara benzeyen, diyabeti olmayan donörlerden üretilen birincil insan psödoisletlerini kullanan entegre bir canlı hücre görüntüleme ve mikroakışkan platformunu tanımlar. Bu psödoadacıklar, birincil insan adacık hücrelerinin dağılma ve yeniden toplanma süreci yoluyla boyut kontrollüdür. Dağınık durumda, adacık hücresi gen ekspresyonu manipüle edilebilir; örneğin, genetik olarak kodlanmış cAMP biyosensörü, cADDis gibi biyosensörler tanıtılabilir. Bir kez oluşturulduktan sonra, genetik olarak kodlanmış bir biyosensörü ifade eden psödo-adacıklar, konfokal mikroskopi ve bir mikroperifüzyon platformu ile birlikte, hücresel süreçler ve işlev hakkında daha fazla bilgi sağlamak için floresan biyosensör dinamiklerinin ve alfa ve beta hücre hormonu salgı profillerinin eşzamanlı değerlendirmesine izin verir.

Giriş

Langerhans adacıkları, işlevi glikoz homeostazının sürdürülmesi için çok önemli olan pankreas boyunca dağılmış mini organlardır. İnsülin, glikoz metabolizmasını, ATP/ADP oranındaki artışı, ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının kapanmasını, plazma zarının depolarizasyonunu ve hücre dışı kalsiyum¹ akışını takiben beta hücrelerinden salgılanır. Alfa hücrelerinden glukagon sekresyonu daha az anlaşılmıştır, ancak hücre içi ve parakrin yolların glukagon granül ekzositozuna^katkıda bulunduğu varsayılmıştır ^2,3,4. Hem tip 1 hem de tip 2 diyabet, adacık hücresi d....

Protokol

İnsan adacıkları (N = 4 preparatları), Entegre Adacık Dağıtım Programı, İnsan Pankreas Analiz Programı, Prodo Laboratories, Inc. ve Imagine Pharma ile ortaklıklar yoluyla elde edildi. Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu, tanımlanmamış insan pankreas örneklerini insan denek araştırması olarak görmez. Organ bağışçıları, aileleri ve organ tedarik kuruluşları olmadan bu çalışma mümkün olmazdı. Donör demografik bilgileri için Tablo 1'e bakınız. Diyabeti olmayan pankreas donörlerinden insan adacıkları, 15 saatten daha az soğuk iskemi süresi ile izole edildi.

1. Psödoislet oluşumu (Walker ve ark.

Tartışmalar

Bir mikroperifüzyon sisteminin, biyosensör eksprese eden psödoadacıkların ve lazer taramalı konfokal mikroskopinin entegrasyonu, hücre içi sinyal olaylarının ve dinamik hormon salgı profillerinin senkronize değerlendirmesine izin verir. Dinamik mikroperifüzyon sistemi, psödoisletlere bir dizi iyi tanımlanmış uyaran iletebilir ve insülin ve glukagon konsantrasyonlarının ticari olarak temin edilebilen ELISA ile ölçülebildiği atık suyun toplanmasına izin verir. Aynı zamanda, bir konfokal mikroskop.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component