Aşil Tendonu Sıkışmasının Mekanobiyolojisini İncelemek için Murin Hind Limb Eksplant Modeli

Özet

Tendon sıkışmasının mekanobiyolojisini keşfetmek için uygun bir model sağlayarak, sürekli hücre canlılığı ile murin arka ekstremite eksplantlarında Aşil tendonu insokulasyonunun sıkışmasının neden olduğu fibrokartilajinöz değişikliği yeniden yaratan özel bir deneysel platform ve doku kültürü protokolü sunuyoruz.

Özet

Tendonun kemiğe çarpması, glikozaminoglikan (GAG) açısından zengin matris birikimi ve kollajen ağının yeniden şekillenmesi ile karakterize lokalize bir fibrokartilaj fenotipi ortaya çıkaran, belirgin şekilde yükselmiş enine kompresyon gerilmesi ile çok eksenli bir mekanik gerilme ortamı oluşturur. Fibrokartilaj, sağlıklı tendonların sıkışmış bölgelerinde normal bir özellik iken, aşırı GAG birikimi ve kollajen ağının düzensizliği tendinopatinin ayırt edici özellikleridir. Buna göre, sıkışma klinik olarak tendinopatinin başlamasında ve ilerlemesinde önemli bir ekstrinsik faktör olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, tendon sıkışmasının altında yatan mekanobiyoloji yeterince çalışılmamıştır. Tendon sıkışmalarına hücresel yanıtı aydınlatmaya yönelik önceki çabalar, hücrelere tek eksenli kompresyon uygulamış ve tendon eksplantlarını in vitro olarak eksize etmiştir. Bununla birlikte, izole hücreler, mekanoyanıt için çok önemli olan üç boyutlu bir hücre dışı ortamdan yoksundur ve hem in vitro hem de eksize edilmiş eksplant çalışmaları, sıkışan bölgenin anatomik özelliklerine bağlı olarak in vivo tendon sıkışması tarafından üretilen çok eksenli gerilme ortamını özetlemekte başarısız olur. Ayrıca, in vivo tendon sıkışma modelleri, mekanik gerilme ortamı üzerinde kontrolden yoksundur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, Aşil tendonu sıkışmasının mekanobiyolojisini incelemek için uygun yeni bir murin arka uzuv eksplant modeli sunuyoruz. Bu model, lokal anatomiyi korumak için Aşil tendonunu yerinde tutar ve hücreleri doğal ortamlarında tutarken, pasif olarak uygulanan ayak bileği dorsifleksiyonu sırasında Aşil tendonunun kalkaneus üzerine sıkışmasının oluşturduğu çok eksenli gerilme ortamını yeniden üretir. Bu modelin ayrılmaz bir parçası olan bir doku kültürü protokolünü tanımlıyoruz ve 7 gün boyunca sürekli eksplant canlılığını belirleyen verileri sunuyoruz. Temsili sonuçlar, artmış histolojik GAG boyaması ve sıkışmaya sekonder azalmış kollajen lif dizilimi olduğunu gösterir, bu da artmış fibrokartilaj oluşumunu düşündürür. Bu model, farklı mekanik yükleme rejimlerini araştırmak için kolayca uyarlanabilir ve sıkışmaya yanıt olarak Aşil tendonundaki fenotipik değişime aracılık eden mekanizmaları tanımlamak için ilgilenilen moleküler yolların manipülasyonuna izin verir.

Giriş

Aşil tendonu ve rotator manşet tendonları da dahil olmak üzere çok sayıda tendon, normal anatomik konumlandırma nedeniyle kemik sıkışması yaşar^1,2,3,4. Tendon sıkışması, uzunlamasına lif eksenine enine yönlendirilmiş basınç gerilimi oluşturur^5,6,7. Tendon sıkışma bölgeleri, büzülmüş, yuvarlak hücrelerin (fibrokondrositler) belirgin şekilde artmış glikozaminoglikan (GAG) içeriğine sahip düzensiz bir kollajen ağı içine gömüldüğü benzersiz bir fibrokar....

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylandı.

1. Doku kültürü ortamının hazırlanması

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (1x DMEM) tüm eksplantları 37 °C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde %1 v / v penisilin-streptomisin ve 200 μM L-askorbik asit ile kültürleyin. İlk 48 saatlik ön işlem için, her bir eksplantın 100 nM deksametazon⁷⁴ ile desteklenmiş 70 mL kültür ortamında kültürlenmesi. Ön tedaviden sonra, her 48-72 saatte bir ortam değiştirerek, deksametazon olmadan 7 gün daha kültür uzuvları.
   NOT: Kültür ortamına fetal sığır ser....

Tartışmalar

Bu çalışmada tarif edilen doku kültürü protokolü ile eşleştirilmiş deneysel murin arka ekstremite eksplant platformu, Aşil tendonu girişinde sıkışmaya bağlı fibrokartilaj oluşumunun mekanobiyolojisini incelemek için uygun bir model sağlar. Bu eksplant modelinin faydası, 7 günlük statik sıkışmadan sonra Toluidin mavisi boyamasında önemli ve mekansal olarak heterojen bir değişiklikle birlikte hücre canlılığının korunmasını gösteren temsili sonuçlarla gösterilmiştir. Bu bulgular, di.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	-	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	-	-	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining