Polikarbonat Ultrasantrifüj Tüpünün Hücre Dışı Veziküllerin Proteomik Analizlerinde Yeniden Kullanımı

Özet

Proteomik deneyler için uygun hücre dışı vezikül izolasyonu gerçekleştirmek için polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinin temizlenmesi ve yeniden kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.

Özet

Tek kullanımlık laboratuvar plastikleri kirlilik krizini daha da kötüleştiriyor ve sarf malzemesi maliyetlerine katkıda bulunuyor. Hücre dışı vezikül (EV) izolasyonunda, ilişkili yüksek merkezkaç kuvvetlerine dayanmak için polikarbonat ultrasantrifüj (UC) tüpleri kullanılır. EV proteomiği gelişmekte olan bir alandır ve bu tüpler için doğrulanmış yeniden kullanım protokolleri eksiktir. Düşük verimli protein izolasyon protokolleri ve aşağı akış proteomikleri için sarf malzemelerinin yeniden kullanılması, santrifüj tüpünden türetilmiş sentetik polimer kontaminasyonunun olmaması ve artık proteinlerin yeterli miktarda uzaklaştırılması gibi kütle spektroskopisi edinimleriyle reaktif uyumluluğu gerektirir.

Bu protokol, EV proteomik deneylerinde yeniden kullanım için polikarbonat UC tüplerinin temizlenmesi için bir yöntemi tanımlar ve doğrular. Temizleme işlemi, protein kurumasını önlemek için UC tüplerinin H₂O'ya hemen daldırılmasını, %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) deterjanla yıkanmasını, sıcak musluk suyunda, demineralize suda ve %70 etanolde durulamasını içerir. Aşağı akış EV proteomiği için UC tüpü yeniden kullanım protokolünü doğrulamak için, diferansiyel UC ve yoğunluk gradyan ayrımı kullanılarak EV'leri kardiyovasküler dokudan izole eden bir deneyin ardından kullanılmış tüpler elde edildi. Tüpler temizlendi ve deneysel işlem, hiç kullanılmayan boş UC tüplerini temizlenmiş UC tüpleriyle karşılaştıran EV örnekleri olmadan tekrarlandı. İzolasyon prosedürlerinden elde edilen yalancı EV peletleri, düşük bollukta protein örnekleri için modifikasyonlara sahip ticari bir protein örneği hazırlama kiti kullanılarak sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi için parçalandı ve hazırlandı.

Temizlemeyi takiben, tanımlanan proteinlerin sayısı, aynı tüpten alınan önceki EV izolasyon örneğine kıyasla yalancı pelette% 98 oranında azaltıldı. Temizlenmiş bir tüp ile boş bir tüp karşılaştırıldığında, her iki numune de %86 benzerliğe sahip çok az sayıda protein (≤20) içeriyordu. Temizlenen tüplerin kromatogramlarında polimer piklerinin olmadığı doğrulandı. Sonuç olarak, EV'lerin zenginleştirilmesi için uygun bir UC tüp temizleme protokolünün doğrulanması, EV laboratuvarları tarafından üretilen atıkları azaltacak ve deney maliyetlerini düşürecektir.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), protein gibi biyolojik olarak aktif kargo taşıyan hücrelerden salınan ve hücre-hücre iletişimi ve biyolojik mineralizasyonun oluşumu dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlere katılan lipid-çift tabaka ile sınırlandırılmış parçacıklardır¹. Bu parçacıklar tüm vücut sıvılarında ve dokularında bulunur ve biyolojik aktiviteleri ve kullanımları hızla gelişen bir bilimsel araştırma alanıdır. Bu nanopartiküllerin izolasyonu ve doğrulanması, küçük boyutları ve lipozomlar ve protein agregatları gibi diğer partiküllere biyo-benzerlikleri nedeniyle çeşitli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. En son Uluslararası Hücre Dışı Ve....

Protokol

1. Tüp temizleme

NOT: EV izolasyon prosedürü, hem kapaklı hem de kapaksız polikarbonat UC tüpleri kullanır (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Hem kapaklı hem de kapaksız tüpler için aynı prosedür izlendi. Kapaklı tüpler söz konusu olduğunda, kapak parçaları ayrı ayrı temizlendi ve kurutma ve ön depolamadan sonra yeniden birleştirildi.

1. Polikarbonat tüplerin ilk kullanımından ve numunenin çıkarılmasından sonra, numunenin tüpün yan tarafına kurumasını önlemek için UC tüplerini hemen musluk suyuna batırın.
2. Tüpleri %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde 10 dakika musluk suyuna aktarın ve daldırın.

Tartışmalar

Burada, EV zenginleştirme ve proteomik uygulamalar için polikarbonat UC tüplerinin temizlenmesi için bir protokolü açıklıyor ve doğruluyoruz. Bu kütle spektrometresi edinim protokolünün tespit sınırının altında temizlenmiş bir psödo-pelet analizi ile karşılaştırıldığında, önceki UC tüp numunesinden kalıntı proteinin başarılı bir şekilde uzaklaştırıldığını gösterdik ve temizlenmiş UC tüpü psödo-peletlerine kıyasla hiç kullanılmamış boş UC tüpünün proteomik benzerliğ.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent