Polikarbonat Ultrasantrifüj Tüpünün Hücre Dışı Veziküllerin Proteomik Analizlerinde Yeniden Kullanımı

Özet

Proteomik deneyler için uygun hücre dışı vezikül izolasyonu gerçekleştirmek için polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinin temizlenmesi ve yeniden kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır.

Özet

Tek kullanımlık laboratuvar plastikleri kirlilik krizini daha da kötüleştiriyor ve sarf malzemesi maliyetlerine katkıda bulunuyor. Hücre dışı vezikül (EV) izolasyonunda, ilişkili yüksek merkezkaç kuvvetlerine dayanmak için polikarbonat ultrasantrifüj (UC) tüpleri kullanılır. EV proteomiği gelişmekte olan bir alandır ve bu tüpler için doğrulanmış yeniden kullanım protokolleri eksiktir. Düşük verimli protein izolasyon protokolleri ve aşağı akış proteomikleri için sarf malzemelerinin yeniden kullanılması, santrifüj tüpünden türetilmiş sentetik polimer kontaminasyonunun olmaması ve artık proteinlerin yeterli miktarda uzaklaştırılması gibi kütle spektroskopisi edinimleriyle reaktif uyumluluğu gerektirir.

Bu protokol, EV proteomik deneylerinde yeniden kullanım için polikarbonat UC tüplerinin temizlenmesi için bir yöntemi tanımlar ve doğrular. Temizleme işlemi, protein kurumasını önlemek için UC tüplerinin H₂O'ya hemen daldırılmasını, %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) deterjanla yıkanmasını, sıcak musluk suyunda, demineralize suda ve %70 etanolde durulamasını içerir. Aşağı akış EV proteomiği için UC tüpü yeniden kullanım protokolünü doğrulamak için, diferansiyel UC ve yoğunluk gradyan ayrımı kullanılarak EV'leri kardiyovasküler dokudan izole eden bir deneyin ardından kullanılmış tüpler elde edildi. Tüpler temizlendi ve deneysel işlem, hiç kullanılmayan boş UC tüplerini temizlenmiş UC tüpleriyle karşılaştıran EV örnekleri olmadan tekrarlandı. İzolasyon prosedürlerinden elde edilen yalancı EV peletleri, düşük bollukta protein örnekleri için modifikasyonlara sahip ticari bir protein örneği hazırlama kiti kullanılarak sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi için parçalandı ve hazırlandı.

Temizlemeyi takiben, tanımlanan proteinlerin sayısı, aynı tüpten alınan önceki EV izolasyon örneğine kıyasla yalancı pelette% 98 oranında azaltıldı. Temizlenmiş bir tüp ile boş bir tüp karşılaştırıldığında, her iki numune de %86 benzerliğe sahip çok az sayıda protein (≤20) içeriyordu. Temizlenen tüplerin kromatogramlarında polimer piklerinin olmadığı doğrulandı. Sonuç olarak, EV'lerin zenginleştirilmesi için uygun bir UC tüp temizleme protokolünün doğrulanması, EV laboratuvarları tarafından üretilen atıkları azaltacak ve deney maliyetlerini düşürecektir.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), protein gibi biyolojik olarak aktif kargo taşıyan hücrelerden salınan ve hücre-hücre iletişimi ve biyolojik mineralizasyonun oluşumu dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlere katılan lipid-çift tabaka ile sınırlandırılmış parçacıklardır¹. Bu parçacıklar tüm vücut sıvılarında ve dokularında bulunur ve biyolojik aktiviteleri ve kullanımları hızla gelişen bir bilimsel araştırma alanıdır. Bu nanopartiküllerin izolasyonu ve doğrulanması, küçük boyutları ve lipozomlar ve protein agregatları gibi diğer partiküllere biyo-benzerlikleri nedeniyle çeşitli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. En son Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği kılavuzları, Hücre dışı vezikül çalışmaları için minimum bilgi 2018 (MISEV2018), EV bilimsel araştırmaları için tanınan standarttır².

EV izolasyonu için yukarı akış kaynağına ve aşağı akış uygulamalarına bağlı olarak, genellikle birlikte çeşitli yöntemler kullanılmalıdır. 2015 itibariyle, EV'ler için en yaygın birincil izolasyon yöntemi diferansiyel ultrasantrifüjleme (UC)² idi. Prensip olarak, ilk düşük hızlı santrifüjleme, hücreler ve hücre kalıntıları gibi daha büyük veya daha yoğun istenmeyen bileşenleri ayırır ve EV'leri süpernatantta bırakır. Daha sonra, UC, EV'leri daha küçük veya daha az yoğun olan ancak aynı zamanda yoğun EV olmayan parçacıklar da içerebilen diğer parçacıklardan ayırmak ve saflaştırmak için çok yüksek merkezkaç kuvveti kullanır. Çoğu protokol, EV'leri bir sıvıdan izole etmek için genellikle bir adımda veya başka bir adımda UC kullanır³. Ayrıca UC, EV'leri kaldırma kuvvetine göre ayırmak için Optiprep^TM iyodiksanol ve merkezkaç kuvveti gibi ortamları kullanan yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme (DGUC) gibi diğer EV izolasyon yöntemlerinde^{kullanılır 4}. EV izolasyonu için başka yöntemler de mevcuttur³.

EV'ler tarafından dikte edilen biyolojik süreçlerin hızla gelişen anlayışı ve bunların biyobelirteç ve patofizyoloji ile ilgili bilgi olarak potansiyelleri göz önüne alındığında, proteomik gibi keşfe dayalı analizler ilgi görmüştür 5,6,7,8. EV'ler küçüktür ve kaynağa bağlı olarak, tüm doku veya hücre lizatı ile karşılaştırıldığında düşük bir protein verimine (<1 μg) sahiptir. Proteomik analiz için EV'lerin izolasyonu, EV olmayan protein kirleticilerinin yukarı akış sıvısından veya dokudan uzaklaştırılması, izolasyon işlemi sırasında EV protein bozunmasının dikkate alınması ve peptit hazırlama ve kütle spektrometresi analizleri ile kimyasal olarak uyumlu protein çözeltileri oluşturan yöntemlerin kullanılması gibi özel hususlar gerektirir.

Araştırma laboratuvarı sarf malzemeleri genellikle plastiktir ve doğası gereği tek kullanımlıktır. Bu tek kullanımlık malzemeler, küresel plastik kirliliği krizine ve sarf malzemesi maliyetlerine katkıda bulunur. Özel polikarbonat ve polistiren UC tüpleri, laboratuvar uygulamalarında EV'leri peletlemek için gereken yüksek merkezkaç kuvvetlerine dayanacak şekilde tasarlanmıştır. UC tüplerini yeniden kullanım için sterilize etmek ve dezenfekte etmek mümkün olsa da, proteomik analizler, özellikle EV'ler gibi düşük protein verimine sahip olanlar özel dikkat gerektirir. Önceki kullanımdan kalan kalıntı proteinin yeterli miktarda uzaklaştırılması çok önemli olmakla kalmaz, aynı zamanda kütle spektroskopisi ve plastik türevli polimer kontaminasyonu ile kimyasal uyumluluk da dikkate alınmalıdır.

Burada, kütle spektrometresi için uygun deterjanlar kullanan polikarbonat tüplerin bir temizleme protokolünü sunuyoruz ve kalıntı proteinin tespit sınırlarının altında başarılı bir şekilde uzaklaştırılmasını ve tespit edilebilir polimer kirleticilerin eksikliğini doğrulamak için deneyler yapıyoruz. Hem UC hem de DGUC amaçlarını kullanarak EV proteomik uygulamaları için temizleme protokolünü doğrulamak için, kombine bir UC ve DGUC protokolü ile insan damar dokusu EV'lerinin izolasyonlarından tüpler elde ettik. Tüpler, tarif edilen protokol kullanılarak temizlendi ve deneysel işlem, hiç kullanılmayan boş bir UC tüpü ile temizlenmiş bir UC tüpü karşılaştırılan numuneler olmadan tekrarlandı. Sonuç olarak, EV'lerin zenginleştirilmesi için uygun bir UC tüp temizleme protokolünün doğrulanması, EV laboratuvarları tarafından üretilen atıkları azaltacak ve bu tür deneylerle ilişkili maliyeti düşürecektir.

Protokol

1. Tüp temizleme

NOT: EV izolasyon prosedürü, hem kapaklı hem de kapaksız polikarbonat UC tüpleri kullanır (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Hem kapaklı hem de kapaksız tüpler için aynı prosedür izlendi. Kapaklı tüpler söz konusu olduğunda, kapak parçaları ayrı ayrı temizlendi ve kurutma ve ön depolamadan sonra yeniden birleştirildi.

1. Polikarbonat tüplerin ilk kullanımından ve numunenin çıkarılmasından sonra, numunenin tüpün yan tarafına kurumasını önlemek için UC tüplerini hemen musluk suyuna batırın.
2. Tüpleri %0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içinde 10 dakika musluk suyuna aktarın ve daldırın.
3. Her seferinde bir tüp, SDS çözeltisinin hepsini olmasa da çoğunu tüpten boşaltın ve EV peletinin bulunduğu tüp alanını iyice silmek için bir pamuklu çubuk kullanın.
   NOT: Kıllı hiçbir şey kullanmayın. Bu protokolde normal pamuklu çubuklar kullanılırdı; Bununla birlikte, tüpleri temizlemek için özel, az tüy bırakan pamuklu çubuklar kullanılabilir.
4. En az 3 kez sıcak musluk suyuyla (~50 °C) durulayın. Tüpü tamamen doldurduğunuzdan ve boşalttığınızdan emin olun.
5. 1x'i bir sprey şişesi veya dar ağızlı bir yıkama şişesi kullanarak demineralize su ile durulayın.
6. Bir sprey şişesi kullanarak 1x'i %70 etanol ile durulayın.
7. Tüpü kuruması için baş aşağı bırakın.
   NOT: Floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması için tüp rafları, UC tüplerini kurutmak için iyi çalışır.
8. Tamamen kurumuş tüpleri temiz bir kavanoza koyun; Yeniden kullanıma hazırdırlar.
   NOT: Şu anda, protokol 2x'e kadar yeniden kullanım için doğrulanmıştır.

2. EV zenginleştirme

NOT: Aşağıdaki EV izolasyonu ve proteomik protokolü, hem orijinal doku EV izolasyonu hem de boş (hiç kullanılmamış) ve temizlenmiş tüp örneklerini elde etmek için kullanılan "sahte örnekler" için kullanılmıştır. Orijinal örnekler, karotis endartektomi uygulanan hastaların karotis plaklarından doku tuzağına düşürülmüş EV'ler olarak yeniden süspanse edildi. Cerrahi örnekler Üniversite Sağlık Ağı'ndan (Toronto, Kanada) toplandı ve kurumsal etik kurul tarafından onaylandı. Tüm hastalar, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak numune toplama ve veri analizi için bilgilendirilmiş onam verdiler. Sahte numuneler, boş ve temizlenmiş tüplerin EV izolasyon numuneleri ile aynı çözeltiler ve işleme adımlarıyla işlenmesinden elde edilen sahte peletlerdi.

1. EV numunelerinin buzunu çözün veya PBS'de buz üzerinde sahte numuneler yapın.
2. NTE tamponu (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.137 M NaCl pH 7.4) ve steril filtre yapın.
3. Numuneleri 10.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika döndürün.
4. Süpernatanı 1 mL'lik üstü açık polikarbonat tüpe taşıyın.
5. Süpernatanı 4 ° C'de 1 saat boyunca 100.000× g'da santrifüjleyin.
6. Pelet, proteaz inhibitörü ile 150 μL steril filtreli NTE tamponunda yeniden süspanse edin.
7. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve toplam 1.5 mL'lik bir numune hacmine ulaşmak için NTE tamponu ekleyin.
8. Numuneleri buz üzerinde tutun.

3. Yoğunluk gradyanlarının hazırlanması ve yoğunluk gradyan ayrımı

NOT: Bu EV izolasyon protokolü daha önce Blaser ve ^ark.9 tarafından tanımlanmıştır Kısaca:

1. Seyreltici olarak NTE tamponu ile beş İodiksanol Yoğunluk Gradyan Ortamı (% 10,% 15,% 20,% 25 ve% 30) çözeltisi hazırlayın.
2. Beş yoğunluk çözeltisini, %30'u altta ve %10'u üstte olacak şekilde kapaklı ultrasantrifüj tüp(ler)ine sırayla katmanlayın.
3. Kapakları tüp(ler)in üzerine sabitleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça sabit bir yatay konuma hareket ettirin.
4. 1 saat sonra, gradyanı soğutmak için tüp(ler)i 30 dakika boyunca buz üzerinde yavaşça dikey konuma getirin.
5. Hazırlanan yoğunluk gradyan tüp(ler)inin üstüne 1.5 mL numune veya sahte numune (NTE tamponu) ekleyin.
6. 4 ° C'de 40 dakika boyunca 250.000 × g'da ultrasantrifüj tüp(ler)i.
7. Yoğunluk gradyanının (2.4 mL) üst fraksiyonlarını kapaksız ultrasantrifüj tüp(ler)ine çıkarın. Steril filtrelenmiş NTE tamponu ile 9 mL'ye kadar doldurun.
8. EV'leri 4 °C'de 1 saat boyunca 100.000 × g'da ultrasantrifüj ederek peletleyin.
   NOT: Görünür EV peletinin konumunu veya beklenen konumu bir işaretleyici ile daire içine alın. Bu, pelet alanını doğrudan çubukla temizlemenizi sağlar.
9. Tüpü 3 dakika boyunca baş aşağı konuma getirirken süpernatanı aspire edin. Tüpü sağ tarafı yukarı çevirmeden önce kalan damlacıkları pamuklu çubukla çıkarın.
10. EV peletini referans alınan kitte 12 μL liz tamponu içinde yeniden süspanse edin.

4. Proteomik için peptit hazırlama

NOT: Proteomik numune hazırlama, düşük bolluktaki protein numuneleri için kurum içi modifikasyonlarla kit protokolüne göre gerçekleştirilmiştir. Değiştirilen protokol aşağıdaki gibidir:

1. Numuneleri lizse tamponunda 95 °C'de 10 dakika ısıtarak parçalayın, denatüre edin, indirgeyin ve alkilleyin.
2. Numuneden 10 μL liz çözeltisi ve 10 μL sindirim çözeltisi kullanarak 37 ° C'de 2 saat boyunca Lys-C / tripsin sindirim solüsyonunu kullanarak numuneleri sindirin.
3. Hidrofilik ve hidrofobik kirleticileri yıkayarak ve kit çözeltileri kullanarak saflaştırılmış peptitleri dışarı atarak peptitleri bir kartuştan saflaştırın.
4. Saflaştırılmış peptitleri 45 ° C'de 45 dakika veya kuruyana kadar hızlı bir vakumda kurutun.
   NOT: Peptitlerin aşırı kurumasını önleyin.
5. Numuneleri kütle spektrometresi dizileme zamanına kadar -80 °C'de saklayın.
6. Kurutulmuş peptitlere 17 μL LC yük çözeltisi ekleyin.
7. Numuneleri 1 saat buz üzerinde bırakın.
8. Örnekleri kısaca vorteksleyin ve ardından 5 dakika boyunca ultrasonik bir su banyosunda sonikasyon yapın.
9. LC yük numunelerini 1 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüjleyin, üstten 15 μL aspire edin ve yeni bir tüpe ayırın.

5. Sıvı kromatografisi ve tandem kütle spektrometresi dizilimi

1. Bir kütle spektrometresi üzerine 2 μL LC yüklü peptit çözeltisi enjekte edin.
2. Çift sütunlu bir kurulum kullanarak peptitleri fraksiyonlayın.
3. Kolonu 45 °C'lik sabit bir sıcaklıkta ısıtın.
4. Analitik gradyanı 300 nL/dk'da %5 ila %21 Solvent B'den (asetonitril /%0.1 formik asit) 60 dakika çalıştırın, ardından 10 dakika %21 ila %30 Solvent B ve 10 dakika daha %95-%5 dekupaj testere yıkama.
5. MS1'i 120 K çözünürlüğe (maksimum enjeksiyon süresi, 25 ms) ayarlayın, üst öncü iyonları (3,0 sn döngü süresi içinde) HCD izolasyon genişliği 1,2 m/z'ye, dinamik dışlama etkin (60 sn) duruma getirin ve MS2 çözünürlüğünü 60 K (maksimum enjeksiyon süresi, otomatik; normalleştirilmiş çarpışma enerjisi, %24, %26 ve %28) olarak ayarlayın.
6. MS1 ve MS2 alım aralığını sırasıyla 400 m/z-1.200 m/z ve 120 m/z-1.200 m/z olarak ayarlayın.

6. Peptit / protein tanımlaması

1. Elde edilen peptit spektrumlarını, bir insan uniProt veritabanına karşı ticari bir arama algoritması kullanarak bir proteomik arama yazılımı ile arayın.
2. Sindirim enzimini tripsine ayarlayın ve iki adede kadar kaçırılan bölünmeye izin verin.
3. Öncü toleransı 10 ppm'ye ve parça tolerans penceresini 0,02 Da'ya ayarlayın.
4. Metiyonin oksidasyonunu ve N-terminal asetilasyonunu değişken modifikasyonlar olarak ve sistein karbamidometilasyonunu sabit modifikasyon olarak ayarlayın.
5. Peptitleri, Percolator algoritması tarafından hesaplanan %1.0'lık bir yanlış keşif oranı (FDR) eşiğine göre filtreleyin.
6. Yalnızca belirli bir protein grubuna atanan ve başka herhangi bir protein grubunda tespit edilmeyen peptitleri benzersiz olarak kabul edin ve bunları daha fazla analiz için kullanın.
7. Analizlerde her protein için yalnızca en az iki benzersiz peptit ekleyin.
8. Öncü iyon algılama ile kimlikleri en üst düzeye çıkarın.
9. Maksimum 10 dakikalık tutma süresi kayması, 10 ppm kütle toleransı ve minimum 5 sinyal-gürültü ile kromatografik hizalama gerçekleştirin.
10. Peptit bolluğunu toplam peptit miktarına göre normalleştirin.

Sonuçlar

Temizleme protokolünü doğrulamak için (Şekil 1) iki deney yapıldı. İlk olarak, temizlenmiş tüpten alınan "sahte numunenin" proteomu, tanımlanan proteinlerin taşınmasını belirlemek için tüpün ilk kullanımından elde edilen doku EV numunesinin proteomu ile karşılaştırıldı. Temsili kromatogramlar, tüplerin temizlenmesini takiben tepe heterojenliğinde bir azalma gösterir (Şekil 2). Orijinal EV izolasyonunda, 806 protein iki veya daha fa...

Tartışmalar

Burada, EV zenginleştirme ve proteomik uygulamalar için polikarbonat UC tüplerinin temizlenmesi için bir protokolü açıklıyor ve doğruluyoruz. Bu kütle spektrometresi edinim protokolünün tespit sınırının altında temizlenmiş bir psödo-pelet analizi ile karşılaştırıldığında, önceki UC tüp numunesinden kalıntı proteinin başarılı bir şekilde uzaklaştırıldığını gösterdik ve temizlenmiş UC tüpü psödo-peletlerine kıyasla hiç kullanılmamış boş UC tüpünün proteomik benzerliğ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent