Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Özet

mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.

Özet

Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), floresan mikroskobu (FM) tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini ve elektron mikroskobu (EM) tarafından elde edilen hücresel üst yapı bağlamını birleştiren kapsamlı bir mikroskopidir. CLEM, floresan ve üst yapı arasında bir değiş tokuştur ve genellikle üst yapı floresansı tehlikeye atar. Glisidil metakrilat, HM20 veya K4M gibi diğer hidrofilik gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon, üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür. Daha önce, mEosEM'nin osmiyum tetroksit fiksasyonuna ve Epon gömülmesine dayanabileceğini göstermiştik. mEosEM'i kullanarak, ilk kez, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyan Epon post gömme CLEM'i elde ettik. Burada, EM numune hazırlama, FM görüntüleme, EM görüntüleme ve görüntü hizalama hakkında adım adım ayrıntılar sunuyoruz. Ayrıca, EM görüntüleme sırasında FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücreyi tanımlama prosedürlerini iyileştiriyoruz ve FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Geleneksel EM tesislerinde bu yeni protokolü takiben Epon post gömülü bağıntılı ışık ve elektron mikroskobunun kolayca elde edilebileceğine inanıyoruz.

Giriş

Floresan mikroskobu (FM), hedef proteinin lokalizasyonunu ve dağılımını elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, hedef proteini çevreleyen bağlam kaybolur, bu da hedef proteini iyice araştırmak için çok önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), birkaç hücre altı ayrıntı sağlayan en yüksek görüntüleme çözünürlüğüne sahiptir. Bununla birlikte, EM hedef etiketlemeden yoksundur. FM tarafından alınan floresan görüntüsünü EM tarafından elde edilen gri görüntü ile doğru bir şekilde birleştirerek, bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), bu iki görüntüleme modu 1,2,3,4 tarafından elde edilen bilgileri birleştirebilir.

Protokol

Hayvancılık ve deneyler, Fujian Tıp Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Geçerli protokolün adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. Numune hazırlama

1. Fare beyni
   1. Bu fareleri genotiplemek için transgenik fareler (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oligonükleotid primerleri (Malzeme Tablosuna bakınız) satın alın.
   2. Daha önce yayınlanmış protokol ^12,13'ü izleyerek sağlam beyni kraniyal tonozdan perfüze edin ve çıkarın.

Tartışmalar

Burada sunulan protokol, ışık mikroskobundan (LM) hedef proteinin lokalizasyon bilgisini ve elektron mikroskobundan (EM) hedef proteini çevreleyen bağlamı birleştirebilen çok yönlü bir görüntüleme ^yöntemidir6. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ile yaygın olarak kullanılan yöntem, korelasyon ışığı ve elektron mikroskobunun (CLEM) önceden gömülmesidir, bu da LM görüntülemenin EM numune hazırlığından önce yapıldığı anlamına gelir. Hemen hemen tüm mev.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)			NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	Hazardous chemical
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetone	SCR	10000418
Ammonium hydroxide	J&K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses			50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Hazardous chemical
DDSA	SPI company	GS02827	Hazardous chemical
Desktop centrifuge	WIGGENS	MINICEN 10E
Diamond knife	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Hazardous chemical
DNA transfection reagent	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812	SPI company	GS02659	Hazardous chemical
Ethanol	SCR	10009218
Fiji image J	National Institutes of Health
Fixative solution			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
Gold nanoparticles	Corpuscular	790120-010
Gradient resin			Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acid	SCR	10011118
Hydrogen peroxide	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamber	Thermo Fisher	A7816
Large gelatin capsules	Electron Microscopy Sciences	70117
Mounting buffer			Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4 ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI company	GS02828	Hazardous chemical
Oligonucleotide primers	Takara Biomedical Technology (Beijing)		Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtome	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	Hazardous chemical
OsO4 solution			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine	Sigma	25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O)	SCR	10016818
Scalpel blades	Merck	S2771
Scalpel handles	Merck	S2896-1EA
Stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Transgenic mice	The Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.
Transmission electron microscope (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			Aqueous solution
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	Hazardous chemical