Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Özet

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Özet

Yüklerin akson boyunca çift yönlü taşınması, fonksiyonel sinapsları, nöral bağlantıyı ve sağlıklı nöronları korumak için kritik öneme sahiptir. Aksonal taşıma, çoklu nörodejeneratif hastalıklarda bozulur ve projeksiyon nöronları, hücresel materyalleri uzun mesafeler boyunca taşıma ve önemli aksonal kütleyi sürdürme ihtiyacı nedeniyle özellikle savunmasızdır. Tau, amiloid-β, α-sinüklein, süperoksit dismutaz ve huntingtin dahil olmak üzere hastalıkla ilişkili çeşitli proteinlerin patolojik modifikasyonları, patolojik proteinlerin hastalıkta toksisite uyguladığı potansiyel bir ortak mekanizma sağlayarak transportu olumsuz etkiler. Bu toksik mekanizmaları inceleme yöntemleri, nörodejeneratif bozuklukları anlamak ve potansiyel terapötik müdahaleleri belirlemek için gereklidir.

Burada, kültürlenmiş primer kemirgen hipokampal nöronları, floresan etiketli kargo proteinlerinin canlı hücre konfokal görüntülemesini kullanarak patolojik proteinlerin hızlı aksonal taşıma üzerindeki etkilerini incelemek için çoklu plazmitlerle birlikte transfekte edilir. Kemirgenlerden birincil hipokampal nöronların toplanması, ayrıştırılması ve kültürlenmesi ile başlıyoruz. Daha sonra, floresan etiketli kargo proteinini ve vahşi tip veya mutant tau'yu (patolojik proteinlerin bir örneği olarak kullanılır) eksprese etmek için nöronları plazmit DNA yapılarıyla birlikte transfekte ederiz. Aksonlar, canlı hücrelerde, hücre dışı bir nörofasin alanını, bir akson başlangıç segmenti proteinini bağlayan bir antikor kullanılarak tanımlanır ve floresan kargo taşınmasını ölçmek için ilgilenilen bir aksonal bölge görüntülenir.

Ücretsiz olarak kullanılabilen bir ImageJ makrosu olan KymoAnalyzer'ı kullanarak, tümü patolojik proteinlerin varlığından etkilenebilecek aksonal taşımanın hızını, duraklama frekansını ve yönlü kargo yoğunluğunu kapsamlı bir şekilde karakterize ediyoruz. Bu yöntem sayesinde, patolojik tau proteininin ekspresyonu ile ilişkili artmış kargo duraklama sıklığının bir fenotipini tanımlarız. Ek olarak, diğer proteinlerin taşıma bozulmasına aracılık etmedeki rolünü test etmek için transfeksiyon karışımına gen susturucu shRNA yapıları eklenebilir. Bu protokol, diğer nörodejeneratif hastalıkla ilişkili proteinlerle kullanım için kolayca uyarlanabilir ve bu proteinlerin aksonal taşımayı nasıl bozduğunun mekanizmalarını incelemek için tekrarlanabilir bir yöntemdir.

Giriş

Nöronlar, fonksiyonel sinapsları ve sinirsel bağlantıyı sürdürmek için akson boyunca yükün çift yönlü taşınmasına bağlıdır. Aksonal transport eksikliklerinin, Alzheimer hastalığı (AD) ve diğer tauopatiler, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığı^dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların patogenezine kritik katkıda bulunduğu düşünülmektedir ^1,2,3. Gerçekten de, hastalıkla ilişkili çeşitli proteinlerdeki patolojik modifikasyonlar, taşımayı olumsuz yönde etkiler (^4'te gözden geçirilmiştir). Patolojik proteinlerin hastalıkta toksisite uyguladığı mekanizmaları araştırmak için yöntemler geliştirmek, nörodejeneratif bozuklukları anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel hedefleri belirlemek için gereklidir.

Konvansiyonel kinesinin keşfi, motor proteinleri düzenleyen kinaz ve fosfataz bağımlı yollar ve patolojik proteinlerin akson taşınmasının düzenlenmesini bozduğu mekanizmalar da dahil olmak üzere akson taşınmasına ilişkin birçok önemli bilgi, izole kalamar aksoplazma modeli ^4,5 kullanılarak yapılmıştır. Kalamar aksoplazmasının tau proteininin patolojik formları ile perfüzyonu, protein fosfataz 1'i (PP1^{) aktive} eden tau'nun fosfataz aktive edici alanının maruz kalmasına bağlı bir etki olan anterograd hızlı aksonal taşımayı (FAT) inhibe ^eder6,7,8. PP1, glikojen sentaz kinaz 3'ü (GSK3) aktive eder, bu da kinesin hafif zincirlerini fosforile ederek kargonun salınmasına neden olur. AD'deki bir diğer patolojik protein amiloid-β'dir. Amiloid-β'in oligomerik formları, kinesin hafif zincirlerini⁹ fosforile eden kazein kinaz 2 yoluyla çift yönlü FAT'ı inhibe eder. Ayrıca, bir poliglutamin genişlemesi ve ailesel ALS'ye bağlı bir SOD1 mutantı barındıran patolojik huntingtin proteininin her biri, sırasıyla c-Jun N-terminal kinaz ve p38 mitojenle aktive olan protein kinaz aktivitesi yoluyla kalamar aksoplazmasında aksonal taşımayı bozar^10,11.

Kalamar aksoplazma modeli, patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini anlamada değerli bir araç olmaya devam ederken, ekipmana ve örneklere sınırlı erişim, daha yaygın olarak kullanılmasını engellemektedir. Kemirgen (fare ve sıçan) primer nöronlarının canlı hücre konfokal mikroskopi görüntülemesini kullanarak bir taşıma testi geliştirdik. Bu model, yaygın olarak bulunan hücre kaynakları ve mikroskopi sistemleri kullanılarak kolayca uyarlanabilir ve manipüle edilebilir memeli nöron tabanlı bir yaklaşımı temsil eder. Örneğin, bu proteinlerin spesifik modifikasyonlarının aksonlarda taşınmayı nasıl etkilediğini belirlemek için çeşitli patolojik proteinler (örneğin, hastalıkla ilgili modifikasyonları barındıran) ifade edilir. Benzer şekilde, kargoya özgü değişiklikleri incelemek için çeşitli floresan etiketli kargo proteinleri kullanılabilir. Ayrıca, altta yatan moleküler mekanizmalar, bu etkilere aracılık edebilecek seçilmiş proteinlerin ekspresyonunu (yani, knockdown veya aşırı ekspresyon) hedefleyerek nispeten kolay bir şekilde incelenir. Bu yöntem aynı zamanda çok çeşitli hayvan modellerinden türetilen birincil nöronlar için kolayca uyarlanabilir.

Frontotemporal lober demanslarla ilişkili mutant tau proteinlerinin (FTLD; P301L veya R5L tau), floresan etiketli kargo proteinlerinin duraklama frekansını çift yönlü olarak^{artırın 12}. Ayrıca, PP1γ izoformunun yıkılması, duraklatma etkilerini¹² kurtardı. Bu, yukarıda ^6,7,12 tarif edildiği gibi PP1 tarafından başlatılan bir sinyal yolunun anormal aktivasyonu yoluyla aracılık edilen patolojik tau kaynaklı bozulma modeli için destek sağlar. Ayrı bir çalışmada, tau'nun S199 / S202 / T205'te (taupatilerle ilgili patojenik AT8 fosfoepitopu) psödofosforilasyonunun kargo duraklama sıklığını ve anterograd segment hızını arttırdığını gösterdik. Bu etkiler, tau^13'ün N-terminal fosfataz aktive edici alanına bağlıydı. Bu örnekler, patolojik proteinlerin memeli nöronlarında akson taşınmasını nasıl bozduğunun mekanizmalarını belirlemek için bu modelin faydasını vurgulamaktadır.

Bu makale, birincil fare hipokampal nöronlarının toplanması, ayrıştırılması ve kültürlenmesi ile başlayan, ardından nöronların bir floresan proteini ile kaynaşmış kargo proteinleri ile transfeksiyonu ve son olarak canlı hücre görüntüleme ve görüntü analizi yaklaşımının ayrıntılı bir tanımını sunmaktadır. Örnek olarak, modifiye tau'nun vezikülle ilişkili protein olan sinaptofizinin çift yönlü taşınması üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntemin nasıl kullanıldığını gösteriyoruz. Bununla birlikte, ilgilenilen patojenik protein ve taşıma kargo proteininde esneklik vardır, bu da bunu aksonal taşımayı incelemek için çok yönlü bir yaklaşım haline getirir.

Protokol

Bu protokoller Michigan Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokol, C57BL / 6J arka planındaki Tau Knockout farelerine ve vahşi tip Sprague Dawley sıçanlarına başarıyla uygulanmıştır. Diğer suşlar da kabul edilebilir olmalıdır.

1. Birincil hipokampal nöron hasadı

1. Borat tamponunda (12,5 mM sodyum borat dekahidrat ve 50 mM borik asit) filtrelenmiş 0,5 mg / mL poli-d-lizin (PDL) ile 4 oyuklu bir cam alt hazne sürgüsünü kaplayın. 750 μL/kuyucuk ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
2. Hazne sürgüsünü 4x steril deiyonize su ile yıkayın. Son yıkamadan sonra havayla kurutun ve kısa süreli saklama için (<1 hafta) 4 °C'de saklayın.
   NOT: Kültürler için toksik olduğundan, PDL'nin yıkamadan önce ve yıkamalar arasında slayt üzerinde kurumasına izin vermeyin. PDL kaplı slaytların daha uzun süreli depolanmasının nöronal sağlığı etkileyebileceğini ve kaplama ile kaplama arasındaki tutarlı aralıkların korunmasının, kültür canlılığındaki çalışmalar arası değişkenliği azalttığını bulduk.
3. Zamanlanmış hamile bir fare veya sıçan edinin.
   NOT: Zamanlanmış hamile hayvanlar çeşitli şirketlerden sipariş edilebilir veya kendi bünyesinde yetiştirilebilir. Embriyonik sıfırıncı gün, vajinal tıkacın bulunduğu günü ifade eder ve bu yaklaşımla E16-18 fare birincil hipokampal ve kortikal nöronlarını kültürlemede başarılı olduk. Sıçan nöronları da embriyonik 18. günde hasat edilir.
4. E18'de hamile kadını onaylanmış bir yöntemle ötenazi yapın. Karın duvarını kesin ve iki rahim boynuzunu çıkarın. Bunları buz gibi %0,9 tuzlu su içeren bir Petri kabına aktarın. Tuzlu su temiz olana kadar durulayın.
   NOT: İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla aşırı dozda sodyum pentobarbital (en az 100 mg / kg) uyguluyoruz.
5. Yavruların kafasını kesin. Foramen magnumdan (kafatasının arkasındaki açıklık) başlayarak, cildi ve kafatasını orta hat boyunca kesmek için mikrodiseksiyon makası kullanın ve beyin dokusuna zarar vermemek için makasın alt ucunu kafatasının iç kısmına doğru açılandırın.
6. Üstteki cildi çıkarın ve beyni açığa çıkarmak için kafatasını dikkatlice çıkarın.
7. Ağız / burun bölgesini tutmak için forseps kullanın ve kafatasını, beyin% 0.9 salin ile doldurulmuş bir Petri kabı üzerinde aşağı bakacak şekilde çevirin. Beyni kafatasından çıkarın ve beyni tuzlu suya bırakmak için sinirleri ve beyin sapını kesin.
8. Hipokampusun diseksiyonu için Petri kabını diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Makası beynin orta hattına yerleştirin, makası üst bıçak serebral hemisferlerden birini dışa doğru itecek şekilde eğin ve hemisferi subkortikal bölgelerden ayırmak için kesin.
9. Korteksten dikey bir kesim yapın, böylece frontal korteks kesilen bölgenin önünde ve hipokampus kesilen bölgenin arkasında olur. Makasın alt ucunu ortaya çıkan deliğe sokun ve arka uçta durarak korteksin tepesi boyunca dikkatlice kesin.
10. Forsepsleri kullanarak korteksi dikkatlice sallayın ve arka kesimi bitirin. Hipokampus hilal şekline benzemelidir. Kalan korteksi dikkatlice kesin, böylece hipokampus yuvarlak, hilal şeklini korur.
11. Forseps ve makas kullanarak, meninksleri hipokampustan nazikçe çıkarın.
    NOT: Hipokampal dokuya zarar vermekten veya yırtmaktan kaçınırken toplanan nöronal olmayan hücrelerin sayısını azaltmak için beyindeki tüm meninksleri çıkarmak önemlidir.
12. Hipokampusu dört eşit parçaya kesin ve dokuyu buz gibi soğuk kalsiyum ve magnezyum içermeyen tampon (CMF; Dulbecco'nun %0.1 glikoz, 2.5 μg/mL Amfoterisin B ve 50 μg/mL Gentamisin içeren PBS'si).
    NOT: En iyi sonuçlar için, hipokampusları ayrışma başına 5-10 yavrudan toplayın. Her hipokampus, fareler için yaklaşık 300.000 hücre ve sıçanlar için 500.000 hücre sağlamalıdır.

2. Primer hipokampal nöron ayrışması ve kaplaması

1. CMF'yi bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve dokuyu taze soğuk CMF 4x ile durulayın, durulamalar arasında hafifçe döndürün.
2. CMF'yi çıkarın ve 3 mL filtrelenmiş %0.125 tripsin çözeltisi ekleyin (önceden ısıtılmış [37 °C] CMF'de %2.5 tripsin seyreltin). Dokuyu 37 ° C'de tam olarak 15 dakika inkübe edin; Her 5 dakikada bir hafifçe döndürün.
   NOT: Kullanmadan hemen önce tripsin çözeltisini yapın.
3. 5 mL tripsin inaktivasyon çözeltisi (TIS; Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi, %20 yenidoğan buzağı serumu ve 1x DNaz I çözeltisi [10x stok: 5 mM sodyum asetat, 1 μM kalsiyum klorür, 0.5 mg/mL DNaz I]).
4. Tripsin çözeltisini çıkarın ve 2x'i soğuk CMF ile yıkayın. 3 mL soğuk TIS ekleyin.
5. Giderek daha küçük çaplı iğnelere sahip 3 mL'lik bir şırınga kullanarak hücreleri öğütme yoluyla ayırın: 14 G'lik bir iğne kullanarak 30x, 15 G'lik bir iğne kullanarak 30x, 16 G'lik bir iğne kullanarak 20x, 18 G'lik bir iğne kullanarak 20x ve 21 G'lik bir iğne kullanarak 15x. İlk dört iğne ile 2 sn çekme ve 21 G iğne ile 3 sn çekme kullanın.
   NOT: Diğer öğütme yöntemleri (örneğin, ateşle parlatılmış cam pipetler^14,15) de kullanılabilir. Standartlaştırılmış metal şırınga iğnelerinin kullanılmasının hücre topaklanması ve canlılığındaki değişkenliği önemli ölçüde azalttığını bulduk.
6. 21 G'lik iğneyi kullanarak, bir mikroskop lamına bir damla hücre süspansiyonu yerleştirin ve hücre kümeleri olup olmadığını kontrol edin. Birkaç topaklanma gözlenirse, 22 G'lik bir iğne ile üç kez daha ezin ve tekrar kontrol edin. Homojen bir tek hücreli süspansiyon elde edilene kadar bu işlemi tekrarlayın ve işlem boyunca hafifçe tritürasyon yapmaya dikkat edin.
7. 0.22 μm şırınga filtresi kullanarak 5 mL fetal sığır serumunu (FBS) filtreleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpte FBS'ye nazikçe katmanlayın. Hücreleri (4 ° C'de 200 × g ) 5 dakika santrifüjleyin.
8. Peleti bozmadan mümkün olduğunca fazla FBS'yi çıkarın. 1 mL ılık (37 ° C) antibiyotik içermeyen nörobazal ortamda (NBM; 1x glutamin ikamesi ve 1x B-27 ile desteklenmiş) tekrar süspanse edin.
9. Hücre süspansiyonunu Tripan mavisi (% 0.4) ile seyreltin ve bir hücre sayımı elde edin.
   NOT: 1:1 seyreltme, otomatik hücre sayacı için iyi çalışır ve hemasitometre ile manuel sayım için 1:60 seyreltme kullanır. Hücre kaplamasına devam etmek için, bu noktada nöron canlılığı %90'dan yüksek olmalıdır. Bu, ayrışmadan sonra sağlıklı bir nöron kültürü olasılığını önemli ölçüde artırır.
10. Hücreleri, 750 μL antibiyotik içermeyen NBM'de önceden ısıtılmış PDL kaplı dört oyuklu bir odacıkta 175.000 hücre / kuyu (70.000 hücre /^mm2) yoğunluğunda plakalayın. Ek olarak, bölüm 3'te açıklanan transfeksiyonda şartlandırılmış ortam olarak kullanılmak üzere 1.5 mL antibiyotik içermeyen NBM'de PDL kaplı 24 oyuklu bir plakanın dört oyuğunda 200.000 hücre / kuyu plakası. Hücreleri nem kontrollü, 37 °C ve% 5 CO₂ odasında inkübe edin.
    NOT: Hücrelerin yoğunluğu sonuçlara göre ayarlanabilir. Yüksek yoğunluklar nöronların görüntülenmesini zorlaştırabilirken, düşük yoğunluklar kültürün sağlığını ve nöronun hayatta kalmasını olumsuz etkileyebilir. Deneyimlerimize göre, sıçan nöronları, fare nöronlarına kıyasla daha düşük bir yoğunlukta kaplanabilir.

3. Nöron transfeksiyonu

NOT: Nöronlar, transfeksiyon verimliliğinde veya taşıma sonuçlarında kayda değer değişiklikler olmadan DIV 7 veya DIV 8'de transfekte edilebilir. Bu hacimler, 750 μL hacim/kuyuda dört kuyulu cam tabanlı bir oda sürgüsünün dört kuyusu içindir. Bu protokol, lipid transfeksiyon reaktifleri kullanılarak transfeksiyonu tanımlar. Kullanmadan önce ortam ve transfeksiyon reaktiflerinin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

1. 127.6 μL indirgenmiş serum ortamına 4.4 μL transfeksiyon reaktifi ekleyerek transfeksiyon stok reaktifi hazırlayın. Karıştırmak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek için elinizle hafifçe sallayın.
2. Lipid transfeksiyon inkübasyonu sırasında DNA stoklarını hazırlayın. İlgilenilen proteini ifade etmek için 200 ng floresan kargo DNA'sı (pFIN mApple-sinaptofenin; 12.112 baz çifti) ve 200 ng DNA ekleyin (kullanılan tau plazmitleri pCMV tau-Flag yapılarıydı; 5.036 baz çifti) 32 μL'lik bir nihai hacme indirgenmiş serum veya serumsuz ortama¹². 0.8 μL transfeksiyon arttırıcı reaktif ekleyin (μg DNA başına 2 μL). Elle iyice karıştırın.
   NOT: RFP'nin bir türevinin en iyi şekilde çalıştığını (mApple veya mCherry) bulduk, ancak GFP de kullanılabilir. Ek olarak, gen susturucu küçük bir firkete RNA'sını (shRNA) ifade etmek için bir DNA yapısı, ilgilenilen proteinin ekspresyonu ile gözlemlenen fenotiplerin mekanizmalarını test etmek için dahil edilebilir. Bunu yapmak için, DNA karışımındaki üç DNA yapısının her birinden 150 ng ekleyin ve transfeksiyon arttırıcı reaktif miktarını buna göre ayarlayın. DNA veya lipofeksiyon reaktifinin parametrelerinin değiştirilmesi, transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir ve daha fazla veya daha az verimli transfeksiyon ihtiyacına göre ayarlanabilir.
3. Her bir DNA tüpüne 32 μL lipid transfeksiyon karışımı ekleyin. Karıştırmak için elinizle hafifçe sallayın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Pipetin ucunu ortamın yüzeyinin hemen altına yerleştirerek ve kuyu boyunca serpantin hareketiyle hareket ettirerek hücrelere yavaşça 64 μL DNA/transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Daha fazla karıştırmak için tüm kuyucuklara ekledikten sonra hazne sürgüsünü 3 kez elle hafifçe sallayın ve hazne sürgüsünü inkübatöre yerleştirin. 37 ° C'de ve% 5 CO'da₂ saat inkübe edin.
   NOT: Nöronların inkübatörün dışında kalma süresini en aza indirin, çünkü hızlı bir şekilde meydana gelebilecek sıcaklık ve pH değişikliklerine karşı çok hassastırlar.
5. Şartlandırılmış ortam + Nörofasin antikoru ile transfeksiyondan 2 saat sonra yarım orta bir değişiklik yapın. Ortam değişiminden hemen önce, 24 oyuklu plaka üzerinde kültürlenen hücrelerden 1.5 mL şartlandırılmış antibiyotik içermeyen NBM havuzu. Şartlandırılmış ortama 0.75 μL Neurofascin 186 (NF-186) antikoru (500 ng / mL) ekleyin.
   NOT: NF-186 antikoru, görüntüleme için aksonu kesin olarak tanımlamak için akson başlangıç segmentinde (AIS) zenginleştirilmiş hücre dışı bir nörofasin alanını tespit eder.
6. İkincil antikoru içeren şartlandırılmış ortam ile transfeksiyondan 18 saat sonra tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin. AlexaFluor 647'ye konjuge edilmiş 1 μL keçi-tavşan önleyici ikincil antikoru, 24 oyuklu plakadan toplanan 3 mL koşullu NBM'ye (antibiyotik içermez) ekleyin. İyice karıştırın.

4. Nöron görüntüleme

1. Transfeksiyondan 2 gün sonra görüntüleme için hazırlanın. Konfokal mikroskop için canlı hücre odası ekini 37 °C'ye ısıtın (60x objektif ve lens yağı dahil) ve odayı %5 CO_2'ye dengeleyin.
2. Hücreleri görüntülemek için yüksek büyütme objektifi ve canlı hücre odası kullanın.
   NOT: Lazer taramalı konfokal mikroskopta 60x 1.40 NA objektif kullanıyoruz, ancak yüksek görüntüleme kare hızlarına ulaşabiliyorlarsa diğer konfokal (örn. eğirme diski) veya geniş alan floresan mikroskobu sistemleri de kullanılabilir.
3. Göz merceklerini kullanarak kargo proteinini içeren kanaldaki transfekte edilmiş nöronları görsel olarak tanımlayın. Ardından, Cy5 kanalındaki AIS'yi tanımlamak için nöronları görüntüleyin (Şekil 1).
4. Görüş alanını 32 piksele 128 piksellik dikdörtgen bir kutuya ayarlayın ve aksonun AIS'ye ~50-150 μm distal bir bölgesini gösterecek şekilde hareket ettirin. Kargo taşımacılığının yönünü ve yatırım getirisinin yönünü not edin ve kaydedin. Kutudaki noktalar, sonraki resimlerin ve filmlerin sırasıyla üst ve sağ kısımları olarak görünecektir. Görüntünün hangi tarafının hücre gövdesine en yakın olduğunu ve hangisinin akson terminaline en yakın olduğunu kaydedin, böylece adım 5.1'deki kymograph çoklu çizgisi doğru yönlendirme ile çizilebilir.
   NOT: İlgilenilen bölgeyi seçerken, izole edilmiş bir aksonun görüntülenen alanı nispeten düz olmalı ve görüş alanını her iki uçta kesmelidir. Tüm segment aynı odak düzlemi içinde olmalıdır. Alan, kargonun aktif olarak taşınmasını açıkça göstermelidir. Aşırı parlak nöronlar tipik olarak, nöron için toksik olması muhtemel ve kaçınılması gereken seviyelerde kargo proteinini ve ilgilenilen proteinleri ifade eder.
5. 561 lazer gücünü 1,40'a, iğne deliğini 7,8'e, Boyutu 128 piksel/^2'ye ve Hızı 32 kare/sn'ye ayarlayın. Tek tek kargo veziküllerinin taşınmasını arka plan sinyali tarafından engellenmeden görselleştirmek için kazancı ayarlayın (tipik olarak 10 ila 50 arasında, yüksek kaliteli kymograflarda sonuç verir).
   NOT: Son derece hassas GaAsP dedektörleri sayesinde son derece düşük lazer gücü elde edilebilir ve hareketli kargonun olası fototoksik etkilerini ve fotoağartmasını önler. İğne deliği boyutu, akson kızağın yüzeyinde tamamen düz durmayabileceğinden, tüm ROI'nin görüntülenmesini sağlamak için odak derinliğini artırmak için mümkün olduğunca geniş olarak ayarlanmıştır.
6. ROI açılır menüsünden Dikdörtgen ROI Çiz... seçeneğini belirleyerek ROI'yi ayarlayın. Yatırım getirisini tüm görüş alanını kaplayacak şekilde çizin. ROI'ye sağ tıklayın ve Stimülasyon ROI'si Olarak Kullan: S1'i seçin.
7. ND Kurulumu sekmesinde aşağıdaki adımları ekleyerek ND Kurulumunu hazırlayın.
   NOT: Bu, bir kez ayarlanan ve daha sonra filmler her toplandığında yazılım tarafından gerçekleştirilecek olan beş adımlı satın alma protokolüdür.
   1. Ön stimülasyon referans görüntüsünü toplamak için Görüntü Al.
   2. Uyarım; Yatırım Getirisi: S1; Aralık: NoDelay; Süre 1.64 sn, Döngüler: 7. Bu adım, lazerin birkaç darbesiyle arka plan floresansını ağartır.
   3. Görüntü Elde Edin. Bu adım, bir stimülasyon sonrası referans görüntüsü toplar.
   4. Beklemek; Eylem Yok; 2 dk. Bu adım, ağartılmış ROI'yi yeniden doldurmak için floresan kargo için bir geri kazanım süresi sağlar.
   5. Edinim; Aralık: NoDelay; Süre 5 dk, Döngüler: 8,615. Bu adım, görüntüleri 5 dakikalık görüntüleme periyodu için maksimum hızda toplar.
8. ND Setup (ND Kurulumu) protokolü ayarlandıktan sonra, ND Setup (ND Kurulumu) sekmesindeki Apply Stimulation Settings (Stimülasyon Ayarlarını Uygula) düğmesine tıklayın. Kargo taşımacılığını görüntülemeye hazır olduğunuzda Şimdi Çalıştır'a tıklayın. Bu, adım 4.7'den itibaren ND Edinme protokolünü başlatacaktır.
   NOT: Kare hızı 32 kare/sn olarak ayarlanmış olsa da, pratik kare hızı daha yavaş olabilir (~28,7 kare/sn). Bu değer, doğru kimograf analizi için bölüm 5'te kaydedilmelidir. İdeal olarak, canlı hücre taşıma görüntülemesi, kargo hareketlerini daha iyi deşifre etmek için mümkün olan en yüksek kare hızıyla (örneğin, >25 kare/sn) yapılır.
9. Görüş alanını görüntünün tamamına sıfırlayın; daha sonra, ROI kutusu dahil olmak üzere 561 ve 647 kanallarında tam nöronun bir görüntüsünü toplayın ve kaydedin. İlgilenilen proteinin ekspresyonunun postfiksasyon onayı için görüntünün çekildiği XY koordinatlarını kaydedin.
10. Analiz için en az iki nörondan taşıma videoları toplayın. Her bağımsız replikasyonun, bireysel bir birincil nöron hasadından ölçülen değişkenlerin ortalamasından geldiğinden emin olun (yani, tek tek nöronlar değil).
    NOT: Belirli bir birincil nöron hasadı için, koşul başına 2-4 nörondan video topluyoruz.
11. Ortamı çıkararak ve önceden ısıtılmış %4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin. Tamponu çıkarın ve hücreleri TBS'de her biri 3 x 5 dakika boyunca yıkayın.
    NOT: Paraformaldehit fiksasyonu için, hücre iskeleti yapısını koruyan yaygın bir tampon olan hücre iskeleti tamponu kullanıyoruz (10 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit [MES], 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂ ve 4 mM EGTA, pH 6.1). Sabitleme için diğer tamponlar (örneğin, TBS, PBS) de kullanılabilir.
12. Analiz edilen nöronların, immünositofloresan boyama yoluyla hem ilgilenilen proteini hem de floresan etiketli kargo proteinini ifade ettiğini doğrulayın. Ekzojen tau ekspresyonunu doğrulamak için insan tau (Tau12) ve nöronların görüntüleme işlemi boyunca sağlıklı kaldığını doğrulamak için β-III tubulin (Tuj1) için leke.
    NOT: Bu yöntemleri kullanarak hemen hemen tüm transfekte edilmiş hücrelerde her iki DNA yapısının birlikte ekspresyonunu gözlemliyoruz.

5. Kymograflar oluşturun ve analiz edin

NOT: Kymograph'lar çeşitli farklı programlar kullanılarak oluşturulabilir ve analiz edilebilir. Altı ImageJ (v. 1.51n) eklentisi¹⁶ kullanarak ücretsiz olarak kullanılabilen KymoAnalyzer (v. 1.01) yazılımını kısaca açıklıyoruz. Bu eklentiler, Encalada lab web sitesindeki (https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer) geliştiricilerden indirilebilir. Bu yazılımın kullanımıyla ilgili daha ayrıntılı talimatlar bu sitede bulunabilir.

1. Adım 4.9'da oluşturulan filmleri deneysel koşullara göre gruplandırın ve çoğaltın. BatchKymographGeneration makrosunu çalıştırın ve uygun klasörü seçin. Söz konusu görüntüde proksimal uçtan başlayan aksonu izlemek için bir kymograph çoklu çizgisi çizin. Elde edilen kymograflar seçilen klasörde saklanır (Şekil 2).
2. İzler makrosunu çalıştırarak, tek bir film klasörünü seçerek, iz eklemek için evet'i seçerek ve ardından her parçacığın yörüngesini izlemek için tıklatarak parçaları manuel olarak atayın. Parçanın üst kısmında ilk tıklamayı gerçekleştirin ve parçacığın hız veya yön değiştirdiği her noktada tekrar tıklayın, böylece çoklu çizgi parçacığın izini kimograf üzerinde kaplar. Çoklu çizgi tüm parçanın üzerine yerleştirildikten sonra Tamam'ı tıklatın. Tüm parçalar atanana kadar tekrarlayın.
3. Görüntüleme parametrelerine göre kare hızı ve piksel boyutu atayarak kalan makroları çalıştırın. Önce CargoPopulation'ı, ardından NetCargoPopulation'u ve ardından Segments'i çalıştırın. İstendiğinde filmlerin piksel boyutunu ve kare hızını girin (bu ayarlarla sırasıyla 0,22 μm ve 28,7 kare/sn). Son olarak, seçili klasördeki tüm kymograflardan aktarım parametresi verilerini hesaplamak ve havuzda toplamak için poolData makrosunu çalıştırın.
4. Veri dosyalarından elde edilen sonuçları çizin ve çeşitli koşulları, tek bir nöron hasadı için deneysel bir koşul içinde analiz edilen tüm nöronların ortalama değerleriyle temsil edilen bağımsız kopyalarla karşılaştırın.

Sonuçlar

Bu yöntemleri kullanarak, hastalıkta patolojik tau kaynaklı nörotoksisitenin potansiyel mekanizmalarını incelemek için tau proteininin vahşi tip veya hastalıkla ilişkili formlarının varlığında aksonal taşımayı karakterize ettik^12,13. KymoAnalyzer yazılımı, belirli bir klasördeki tüm kymograflardan çeşitli farklı parametreleri hesaplar ve bir araya getirir. Taşıma oranları, yalnızca kargo hareket hali...

Tartışmalar

Çeşitli nörodejeneratif bozukluklarla ilişkili çoklu patolojik proteinlerin nöronlarda hızlı aksonal transportu bozduğuna dair artan kanıtlar vardır. Bu, bu hastalıklar arasında potansiyel bir ortak nörotoksisite mekanizmasını temsil eder. Bu proteinlerin taşımayı bozma sürecini daha iyi anlamak için, belirli soruları ele almamıza izin veren araçlara ve modellere ihtiyacımız var. Burada tarif edilen yöntem, kemirgenlerden primer hipokampal nöronlarda kargo ta?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427