Farelerden Vasküler Duvarda Yerleşik CD34+ Kök Hücrelerin İmmünomanyetik İzolasyonu

Özet

Bu çalışma, vasküler duvarda yerleşik CD34⁺ kök hücrelerin (CD34⁺ VW-SC'ler) izolasyonu, kültürü ve fonksiyonel tayini için stabil ve verimli bir yöntem oluşturmuştur. Bu takip etmesi kolay ve zaman açısından etkin izolasyon yöntemi, kardiyovasküler hastalıklarda yer alan potansiyel mekanizmaları incelemek için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir.

Özet

Yerleşik CD34⁺ vasküler duvarda yerleşik kök ve progenitör hücreler (VW-SC'ler), vasküler yaralanma ve onarımı düzenlemedeki önemli rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Fonksiyonel murin CD34⁺ VW-SC'leri kültürlemek için kararlı ve verimli bir yöntem oluşturmak, bu hücrelerin çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında çoğalması, göçü ve farklılaşmasında rol oynayan mekanizmaların daha fazla araştırılması için gereklidir. Açıklanan yöntem, birincil kültürlenmiş yerleşik CD34⁺ VW-SC'leri saflaştırmak için manyetik boncuk taramasını ve akış sitometrisini birleştirir. Saflaştırılmış hücreler daha sonra immünofloresan boyama ve Ca^{2 +} görüntüleme yoluyla fonksiyonel olarak tanımlanır. Kısaca, murin aort ve mezenterik arterin adventitisinden elde edilen vasküler hücreler, doku bloğu bağlanması yoluyla elde edilir, ardından en az 1 × 10^7'lik bir hücre sayısına ulaşana kadar subkültürasyona tabi tutulur. Daha sonra, CD34⁺ VW-SC'ler manyetik boncuk sıralama ve akış sitometrisi kullanılarak saflaştırılır. CD34⁺ VW-SC'lerin tanımlanması, hücresel immünofloresan boyamayı içerirken, fonksiyonel çok potansiyellilik, yönlendirilmiş farklılaşma için hücrelerin spesifik bir kültür ortamına maruz bırakılmasıyla belirlenir. Ayrıca, fonksiyonel dahili Ca^{2 +} salınımı ve harici Ca^{2 +} girişi, ATP, kafein veya tapsigargin (TG) 'ye maruz kalan Fura-2 / yüklü hücrelerde ticari olarak temin edilebilen bir görüntüleme iş istasyonu kullanılarak değerlendirilir. Bu yöntem, vasküler duvarda yerleşik CD34⁺ kök hücrelerin izole edilmesi, kültürlenmesi ve tanımlanması için stabil ve verimli bir teknik sunarak, VW-SC'lerin düzenleyici mekanizmaları ve hedefe yönelik ilaçların taranması üzerine in vitro çalışmalar için bir fırsat sağlar.

Giriş

Vasküler duvar, vasküler gelişimde, homeostatik regülasyonda ve vasküler hastalıkların ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, arterlerde çeşitli kök hücre soylarının varlığını ortaya koymuştur. 2004 yılında, Profesör Qingbo Xu'nun grubu ilk olarak yetişkin vasküler duvarın çevresinde CD34, Sca-1, c-kit ve Flk-1¹ eksprese eden vasküler kök / progenitör hücrelerin varlığını bildirdi. Bu vasküler kök hücreler çok yönlü farklılaşma ve çoğalma potansiyeli gösterirler. Normal koşullar altında, nispeten hareketsiz kalırlar; Bununla birlikte, belirli faktörler tarafından aktive edildiklerinde, düz kas hücrelerine, end....

Protokol

Bu çalışma onaylandı ve hayvanlar, Çin'deki Laboratuvar Hayvanlarının Yönetimi ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak ele alındı. Araştırma, Hayvan Etik Kurulu'nun onayı ile hayvan deneylerinin etik gerekliliklerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır (Onay No: SWMU2020664). Bu çalışma için her iki cinsiyetten 18-20 g ağırlığında sekiz haftalık sağlıklı C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar, Southwest Tıp Üniversitesi (SWMU) Laboratuvar Hayvanları Merkezi'ne yerleştirildi.

1. Aort ve mezenterik arterlerden adventiti doku blok kültürü

1. Yerleşik CD34⁺ VW-SC izolasyonu
   1. % 3 izofluran inhalasyonu ile iki fare....

Tartışmalar

Bu çalışma, farelerin aort ve mezenterik arterlerinden fonksiyonel CD34⁺ VW-SC'lerin elde edilmesi için hızlı ve uygun bir yöntem sağlar. Bu yöntemle elde edilen CD34⁺ VW-SC'ler, proliferatif aktivite ve çok yönlü farklılaşma özelliklerine sahiptir. Trifosfat inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörleri (IP₃Rs), riyanodin reseptörleri (RyR'ler) ve mağaza tarafından işletilen kalsiyum kanalları, CD34⁺ VW-SC'lerde Ca²⁺ salınımına ve girişine aracıl?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023