Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

Özet

Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C'lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius'ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.

Özet

Arkeon Sulfolobus acidocaldarius , umut verici bir termofilik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Termofillerin değişen sıcaklıklara nasıl adapte olduklarını araştırmak, yalnızca temel evrimsel süreçleri anlamak için değil, aynı zamanda S. acidocaldarius'u biyomühendislik için bir şasi olarak geliştirmek için de önemli bir gerekliliktir. Termofillerle deneysel evrim yürütmenin önündeki en büyük engellerden biri, yüksek sıcaklıkta büyüme için geleneksel inkübatörlerin ekipman bakımı ve enerji kullanımı masraflarıdır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, S. acidocaldarius'ta deneysel evrim yürütmek için düşük maliyetli ve enerji açısından verimli tezgah üstü termomikserler kullanan kapsamlı bir deneysel protokol sunulmuştur. Protokol, nispeten küçük hacimli (1.5 mL) bir toplu kültür tekniğini içerir ve birden fazla bağımsız soyda adaptasyonun izlenmesini sağlar. Bu yöntem, ek termomikserler kullanılarak kolayca ölçeklenebilir. Böyle bir yaklaşım, hem ilk yatırımı hem de deneysel araştırmalarla ilişkili devam eden maliyetleri azaltarak S. acidocaldarius'un bir model sistem olarak erişilebilirliğini arttırır. Ayrıca, teknik, çeşitli çevresel koşullara adaptasyonu keşfetmek için diğer mikrobiyal sistemlere aktarılabilir.

Giriş

Dünyadaki erken yaşam, aşırı yüksek sıcaklıklar ve asitlik¹ ile karakterize edilen hidrotermal menfezler gibi aşırı ortamlarda ortaya çıkmış olabilir. Mikroplar, kaplıcalar ve volkanik solfatara da dahil olmak üzere aşırı ortamlarda yaşamaya devam ediyor. Bu aşırı koşullar altında meydana gelen evrimsel dinamikleri karakterize etmek, bu koşullar altında hayatta kalmayı sağlayan özel fizyolojik süreçlere ışık tutabilir. Bunun, biyolojik çeşitliliğin kökenlerini anlamamızdan, biyoteknolojik uygulamalarla yeni yüksek sıcaklık enzimlerinin geliştirilmesine kadar geniş kapsamlı etkileri olabilir.

Aşırı ortamlarda mikrobiyal evrimsel dinamiklerin anlaşılması, kritik önemine rağmen sınırlı kalmaktadır. Buna karşılık, mezofilik ortamlarda evrim hakkında önemli bir bilgi birikimi, deneysel evrim olarak bilinen bir tekniğin uygulanmasıyla elde edilmiştir. Deneysel evrim, laboratuvar koşulları^{altında evrimsel} değişimi gözlemlemeyi içerir 2,3,4,5. Genellikle bu, tanımlanmış bir değişim ortamını içerir (örneğin, sıcaklık, tuzluluk, bir toksinin veya rakip bir organizmanın eklenmesi)^7,8,9. Tüm genom dizilimi ile birleştirildiğinde, deneysel evrim, paralellik, tekrarlanabilirlik ve adaptasyon için genomik temel dahil olmak üzere evrimsel süreçlerin temel yönlerini test etmemizi sağlamıştır. Bununla birlikte, bugüne kadar, deneysel evrimin büyük kısmı mezofilik mikroplarla (bakteriler, mantarlar ve virüsler 2,3,4,5 dahil, ancak büyük ölçüde arkeler hariç) gerçekleştirilmiştir. Termofilik mikroplara uygulanabilen bir deneysel evrim yöntemi, onların nasıl evrimleştiklerini daha iyi anlamamızı sağlayacak ve daha kapsamlı bir evrim anlayışına katkıda bulunacaktır. Bunun, Dünya'daki termofilik yaşamın kökenlerini deşifre etmekten, yüksek sıcaklıktaki biyoproseslerde¹⁰ ve astrobiyolojik araştırmalarda¹¹ kullanılan 'ekstremozimleri' içeren biyoteknolojik uygulamalara kadar potansiyel olarak geniş kapsamlı etkileri vardır.

Archaeon Sulfolobus acidocaldarius, termofiller için deneysel evrim teknikleri geliştirmek için model organizma olarak ideal bir adaydır. S. acidocaldarius, 75 °C'de (aralık 55 °C ila 85 °C) optimum büyüme sıcaklığı ve yüksek asitlik (pH 2-3) ile aerobik olarak çoğalır4,6,12,13,14. Dikkat çekici bir şekilde, aşırı büyüme koşullarına rağmen, S. acidocaldarius, mezofiller ^{7,15,16,17,18} ile karşılaştırılabilir popülasyon yoğunluklarını ve mutasyon oranlarını korur. Ek olarak, nispeten küçük, iyi açıklamalı bir genoma sahiptir (DSM639 türü: 2.2 Mb, %36.7 GC, 2.347 gen)¹²; S. acidocaldarius ayrıca, hedeflenen gen nakavtları yoluyla evrimsel sürecin doğrudan değerlendirilmesine olanak tanıyan sağlam genom mühendisliği araçlarından da yararlanır¹⁹. Bunun dikkate değer bir örneği, seçilebilir belirteçler olarak işlev görebilen MW001¹⁹ ve SK-1^20'nin urasil oksotrofik suşları gibi genetik olarak değiştirilmiş S. acidocaldarius suşlarının mevcudiyetidir.

S. acidocaldarius gibi termofillerle deneysel evrim yürütmede önemli zorluklar vardır. Bu çalışmalar için gerekli olan yüksek sıcaklıklarda uzun süreli inkübasyon, hem sıvı hem de katı kültür teknikleri için önemli ölçüde buharlaşma gerektirir. Yüksek sıcaklıklarda uzun süreli çalışma, sıvı ortamda deneysel evrimde yaygın olarak kullanılan geleneksel çalkalama inkübatörlerine de zarar verebilir. Birden fazla sıcaklığı keşfetmek, birkaç inkübatörün satın alınması ve bakımı için önemli bir finansal yatırım gerektirir. Ayrıca, gereken yüksek enerji tüketimi, önemli çevresel ve finansal kaygıları da beraberinde getirmektedir.

Bu çalışma, S. acidocaldarius gibi termofillerle deneysel evrim gerçekleştirirken karşılaşılan zorlukları ele almak için bir yöntem sunmaktadır. Baes ve ark. ısı şoku tepkisi ^14,21'i araştırmak için, burada geliştirilen yöntem, tutarlı ve güvenilir yüksek sıcaklıkta inkübasyon için tezgah üstü termomikserleri kullanır. Ölçeklenebilirliği, ek inkübasyon ekipmanı edinme maliyetlerinin azalmasıyla birden fazla sıcaklık işleminin aynı anda değerlendirilmesine olanak tanır. Bu, termofillerde evrimsel dinamikleri etkileyen faktörlerin sağlam istatistiksel analizine ve kapsamlı bir şekilde araştırılmasına olanak tanıyarak deneysel verimliliği artırır²². Ayrıca bu yaklaşım, geleneksel kuluçka makinelerine kıyasla finansal ilk yatırımı ve enerji tüketimini önemli ölçüde azaltarak daha sürdürülebilir ve çevre dostu bir alternatif sunar.

Yöntemimiz, Dünya'daki yaşamın çeşitlenmesinin ilk aşamalarında kilit bir rol oynamış olabilecek aşırı sıcaklıklarla karakterize edilen ortamlarda evrimsel dinamikleri deneysel olarak araştırmak için zemin hazırlamaktadır. Termofilik organizmalar benzersiz özelliklere sahiptir, ancak aşırı büyüme koşulları ve özel gereksinimleri genellikle bir model sistem olarak erişilebilirliklerini sınırlamıştır. Bu engellerin üstesinden gelmek, yalnızca evrimsel dinamikleri araştırmak için araştırma fırsatlarını genişletmekle kalmaz, aynı zamanda termofillerin bilimsel araştırmalarda model sistemler olarak daha geniş kullanımını da artırır.

Protokol

1. S. acidocaldarius büyüme ortamının (BBM ⁺) hazırlanması

NOT: S. acidocaldarius'u yetiştirmek için bu protokol Bazal Brock Ortamı (BBM⁺)²³ kullanır. Bu, öncelikle önceden hazırlanabilecek BBM⁻ oluşturmak için aşağıda özetlenen inorganik stok çözeltilerinin birleştirilmesiyle hazırlanır. BBM⁺ daha sonra organik stok çözeltileri ^BBM'ye eklenerek gerektiği gibi hazırlanır. Stok çözelti tarifleri de Tablo 1'de sunulmuştur. Tüm medya ve stok çözeltileri çift damıtılmış H₂O (ddH₂O) olarak hazırlanmalıdır.

1. Büyüme ortamı için inorganik stok çözeltilerinin hazırlanması
   1. Eser element stok çözeltisini hazırlayın.
      1. ddH₂O'ya 9 g / L sodyum tetraborat dekahidrat (Na₂B₄O₇ · 10H₂O) ekleyerek ve ardından çözünene kadar damla damla 1: 1 H_2S04 ekleyerek İz Element Stok Çözeltisini hazırlayın.
      2. Sırayla 0.44 g / L çinko sülfat heptahidrat (ZnSO₄ · 7H₂O), 0.1 g / L bakır (II) klorür dihidrat (CuCl₂ · 2H₂O), 0.06 g / L sodyum molibdat dihidrat (Na₂MoO₄ · 2H₂O), 0.06 g / L vanadyum (IV) sülfat dihidrat (VOSO_{4.2H 2}O), 0.02 g / L kobalt (II) sülfat heptahidrat (CoSO₄ · 7H₂O), ve 3.6 g / L manganez (II) klorür tetrahidrat (MnCl₂ · 4H₂O). Solüsyonu otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
   2. 20 g / L ferrik klorür hekzahidrat (FeCl₃ · 6H₂O) ddH₂O içinde çözerek Fe Stok Çözeltisini (1000x) hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm filtreden süzülerek sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
   3. 70 g/L kalsiyum klorürü (CaCl₂·2H₂O) çift damıtılmış suda (ddH₂O) çözerek Brock Çözeltisi I'i (1000x) hazırlayın. Otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
      DİKKAT: CaCl₂·2H 2O'nunsuda çözülmesi ekzotermik bir işlemdir. Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Yaralanmalara karşı korunmak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin. Basınç oluşabileceğinden kabı sıkıca kapatmayın.
   4. 130 g / L amonyum sülfat ((NH₄) _2S04), 25 g / L magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO₄ · 7H₂O), 28 g / L potasyum dihidrojen fosfat (KH₂PO₄) ve 50 mL önceden hazırlanmış İz Element Stok Çözeltisi. 1:1 H_2S04 kullanarak, stok çözeltisinin pH'ını 2-3'e ayarlayın. Çözeltiyi otoklavlayın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
2. Büyüme ortamı için organik stok çözeltilerinin hazırlanması
   1. 300 g / L (% 30 w / v) D-glikozu ddH₂O'da çözerek D-Glikoz Stok Çözeltisini (100x) hazırlayın ve filtreyi sterilize edin (0.22 μm filtreden). 4 °C'de saklayın.
      NOT: Deneysel gereksinimlere göre D-glikoz yerine başka karbon kaynakları da kullanılabilir (örneğin, D-ksiloz).
   2. Stok çözeltisini RT'de sterilize etmek ve saklamak için otoklavda kazeinden peptonu kazeinden 100 g / L'de çözerek KazeinStok Çözeltisinden (100x) Pepton hazırlayın.
   3. 2 g/L urasili ddH₂O'da çözerek Urasil Stok Çözeltisini (100x) hazırlayın ve filtre sterilize edin (0,22 μm'lik bir filtreden); -20 °C'de saklayın.
3. 1x çalışma konsantrasyonunda BBM ⁺ büyüme ortamının hazırlanması
   1. İlk olarak, otoklavlama ile 988 mL steril ddH₂O hazırlayın.
   2. Daha önce otoklavlanmış 988 mL steril ddH₂O'ya 1 mL Brock Stok Çözeltisi I, 10 mL Brock Stok Çözeltisi II / III ve 1 mL Fe stok çözeltisi ekleyerek 1 L ^{BBM -} hazırlayın. Orta pH'ı 1:1 H₂SO₄ ile 2-3 aralığına ayarlayın.
      NOT: BBM⁻ önceden yapılabilir ve 1 aya kadar RT'de saklanabilir.
   3. Son olarak, 1 L BBM ⁺ üretmek için, 10 mL D-Glikoz Stok Çözeltisi, Kazein Stok Çözeltisinden Pepton ve Urasil Stok Çözeltisini 985 mL BBM^-'lik bir çözelti ile birleştirin. İyice karıştırın ve ortam pH'ını 1:1 H₂S2_S4 ile 2-3'e ayarlayın.
      NOT: BBM⁺ gerektiği gibi taze yapılmalıdır.
4. BBM ⁺ katı ortamın hazırlanması
   1. MgCl₂ ve CaCl_2'nin 1 M stok çözeltilerini hazırlayın; bunlar BBM katı ortamının katılaşmasına yardımcı olacaktır. 1 M MgCl₂ için, 100 mL ddH₂O 'ya 9.5 g ekleyin. 1 M CaCl₂ için, sterilize etmek için 100 mL ddH₂O'ya 11 g ekleyin.
      DİKKAT: CaCl₂·2H 2O'nunsuda çözülmesi ekzotermik bir işlemdir. Bu adımı dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Yaralanmalara karşı korunmak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin. Basınç oluşabileceğinden kabı sıkıca kapatmayın.
   2. %3 (a/h) gellan sakızı (örn., 30 g/L) ddH₂O içinde karıştırın ve sterilize etmek için otoklavlayın.
      NOT: Standart bakteriyolojik agar 75 °C'de katılaşamadığından, jelleştirici ajan olarak Gellan zamkı (örneğin Gelrite) kullanılır.
   3. Ayrı olarak, adım 1.4.1'de hazırlanan steril gellan sakızı ile 1:1 oranında karıştırılacak olan katı ortam için BBM⁺ 'yı hazırlayın.
      1. İlk olarak, adım 1.3.2'deki gibi 1 L BBM⁻ hazırlayın. 887 mL BBM^-' yi 1 mL Fe Stok Çözeltisi ve her biri 20 mL D-Glikoz Stok Çözeltisi, Kazein Stok Çözeltisinden Pepton ve Urasil Stok Çözeltisi ile birleştirin.
      2. 40 mL 1 M MgCl₂ ve 12 mL 1 M CaCl₂ ekleyin. İyice karıştırın ve ortam pH'ını 1:1 H₂S2_S4 ile 2-3'e ayarlayın.
         NOT: Buraya eklenen stok çözeltilerinin hacimleri, adım 1.3'teki sıvı BBM⁺ 'nın hazırlanmasından kasıtlı olarak daha büyüktür. Bu, bir sonraki adımda erimiş gellan sakızı ile 1:1 oranında karıştırmayı hesaba katmak içindir.
   4. BBM⁺ 'ı katı ortam için yaklaşık 75 °C'ye önceden ısıtın ve ddH₂O'da erimiş gellan sakızı ile 1:1 oranında karıştırın. İyice karıştırın ve ısıya dayanıklı plastiğe (örneğin polipropilen), cam Petrikaplarına veya S. acidocaldarius'un büyümesi için altı kuyulu plakalara dökün. Agarı karıştırıldıktan hemen sonra kullanın, çünkü hızlı bir şekilde sertleşecektir.
      NOT: Mikrobiyoloji için yaygın olarak kullanılan bazı polistiren 90 mm Petri kapları, yüksek sıcaklıklarda uzun süre inkübe edilirse deforme olur.
      DİKKAT: Sıcak sıvılarla uğraşırken uygun güvenlik önlemlerini alın; Yaralanmalara karşı korumak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin.

2. S. acidocaldarius'u bir dondurucu stok kültüründen canlandırmak

1. Yeterli havalandırma ve oksijen mevcudiyetini sağlamak için havalandırmalı büyüme tüplerinin hazırlanması.
   1. Önceden, Sulfolobus büyümesi için delinmiş 2 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Bir Bunsen brülör alevi kullanarak kör teli (>0,7 mm, düzleştirilmiş bir ataş gibi) dikkatlice ısıtın ve borunun kapağını delerek yaklaşık 1 mm'lik küçük bir delik oluşturun.
   2. Delinmiş tüpleri otoklavlanabilir bir kaba (örn. boş pipet ucu kutusu) yerleştirin ve sterilize etmek için otoklavlayın.
      DİKKAT: Isıtılmış metalden ellerin termal yaralanmasına karşı korunmak için EN407 dereceli termal tehlike eldivenleri giyin. Aşırı ısınmayı önlemek için teli yalnızca kısa bir süre (1-2 s) ısıtın. Sadece yüksek erime sıcaklığına sahip metaller (çelik) kullanılmalıdır.
2. S. acidocaldarius'un başlangıç kültürlerini aşılayın.
   1. Otoklavlanmış delinmiş 2 mL'lik tüpleri 1,5 mL önceden ısıtılmış BBM⁺ ile doldurun (bölüm 1'de hazırlandığı gibi, 75 °C'de en az 15 dakika önceden inkübe edilmiştir).
   2. BBM ⁺ dolgulu tüpleri bir gliserol stoğundan (% 25 v / v gliserol, -80 ° C'de saklanır) bir kazıma (50 - 60 mg'a eşdeğer) ile aşılayın. Burada S. acidocaldarius suşu DSM639 kullanılmaktadır. Negatif kontrol olarak ek bir tüpü 1,5 mL BBM+ ile doldurun.
3. Herhangi bir aerosolün delinmiş 2 mL tüp kapağından kaçmasını ve büyüme ortamını (ve diğer numuneleri) kirletmesini önlemek ve tüpler içindeki kültür buharlaşmasının değişkenliğini azaltmak için, kapağın üzerine yüksek sıcaklıklara (65-85 °C) dayanabilen ve mikrobiyal kaçışı/sızmayı engelleyebilen gaz geçirgen bir zar yerleştirin.
   NOT: Tüplerin sızdırmazlığı için gaz geçirgen membranların kullanılması buharlaşmayı önemli ölçüde azaltır. 75 ° C'de 48 saatlik bir süre boyunca, mühürsüz tüpler için% 25.05'in aksine (aralık: %3.29-16.45, n = 24 teknik tekrar, iki kez tekrarlanan) ortalama% 8.63'lük bir hacim kaybı sergiler (aralık: %11.92-62.91, n = 24 teknik tekrar, iki kez tekrarlanır).
4. Aşılanmış tüpleri 75 ° C'de bir termomikserde, dakikada 400 devirde (RPM) sürekli çalkalama ile 48-72 saat boyunca veya spektrofotometre ile ölçüldüğü gibi 0,3 - 0,8 OD_600nm'ye ulaşılana kadar inkübe edin.
   NOT: 2 mL'lik tüplerin delinmiş kapağı ve çalkalama, optimum büyüme için uygun havalandırmaya izin verir. Tutarlı bir sıcaklığın korunmasını sağlamak ve buharlaşmayı azaltmak için termomikserin kapağı yerinde olmalıdır.
5. Kuluçka döneminden sonra, canlanan kültürlere ikinci bir büyüme aşaması (ön koşullandırma) verin.
   1. Tüpleri RT'de 2 dakika boyunca 5000 x g'da döndürerek kültürleri peletleyin. Ardından, süpernatanı atın ve hücre peletini taze 1,5 mL ılık BBM ⁺ içinde yeniden süspanse edin.
      NOT: Bu deney, S. acidocaldarius vahşi tip suşu DSM639'u kullanır, ancak bu büyüme ve deneysel evrim yöntemleri, herhangi bir Sulfolobus suşuna ve potansiyel olarak diğer termofillere uygulanabilir.

3. S. acidocaldarius için popülasyon yoğunluğunun, iki katına çıkma süresinin ve üstel büyüme fazının belirlenmesi

1. Seçilen seçim koşulları için popülasyon yoğunluğunu ve üstel büyüme aşamasına kadar geçen süreyi belirleyin. Test edilecek her çevresel koşul için, 2.1-2.5 adımlarını izleyerek üç başlangıç kültürü hazırlayın.
2. BBM ⁺ 'daki üç kültürü 0.01'lik bir OD_600nm'ye seyreltin. Her kültürden en az 20 mL yapın. Bu üç kültür teknik kopyaları temsil eder.
3. Yıkıcı örnekleme kullanarak zaman içinde OD_600nm'nin büyüme eğrilerini çoğaltın.
   1. Adım 2.1'den itibaren 24 adet delinmiş 2 mL tüp hazırlayın, bunları sekizli üç sete ayırın ve bu teknik kopyaları 1, 2 ve 3 olarak etiketleyin (örneğin, kopya 1 vb. olarak etiketlenmiş sekiz tüp).
   2. Adım 3.2'deki üç seyreltilmiş kültürün her birinden, 1.5 mL'yi hazırlanmış yedi tüpe pipetleyin. Kalan tüpü negatif kontrol olarak 1,5 mL BBM+ ile doldurun.
4. 24 tüpün tümünü bir termomikserde 75 °C ve 400 RPM'de inkübe edin. Gaz geçirgen bir membran ile kapatın. Düzenli aralıklarla (0, 4, 8, 12, 24, 36, 48 saat gibi), üç kopyanın her birinden bir tüp çıkarın ve bir spektrofotometre kullanarak OD_600nm'yi ölçün, ardından tüpü atın. Bir tüpü çıkardıktan sonra gaz geçirgen zarı değiştirin.
5. Paralel olarak, OD_600nm ile nüfus yoğunluğu arasındaki ilişkiyi belirleyin. BBM⁺ ortamında en az üç zaman noktası (ideal olarak başlangıç, orta ve bitiş) için seri seyreltmeler (1 x ^10-1 ila 1 x ^10-6) gerçekleştirin. Her seyreltmenin 100 μL'sini katı BBM ⁺ ortamına aşılayın (adım 1.4'teki gibi hazırlanır).
   NOT: Tutarlı koloni büyümesi ve doğru sayımlar elde etmek için, seyreltik kültürü, L şeklinde bir yayıcı veya cam boncuklar kullanmak gibi mekanik yayma işlemi yapmadan bir noktada katı ortama pipetlemek en iyisidir. Mekanik yayılmanın koloni oluşumunu olumsuz etkilediği görülmektedir.
6. Plakaları statik bir inkübatörde 75 ° C'de koloniler görünene kadar (5-7 gün) inkübe edin.
   1. Bu süre zarfında, plakaların aşırı kurumasını önlemek için inkübatörü nemli tutun, aksi takdirde koloniler oluşmaz.
   2. Bunu, plakaları nemli bir bezle kaplı kapalı bir polipropilen kutuya yerleştirerek başarın. Havalandırmayı sağlamak için kutunun kapağını en az üç kez delin.
   3. Nemi artırmak için kuluçka makinesine kova kova su koyun. Kovaları her gün yeniden doldurun.
7. Tüm OD_600nm ölçümleri toplandıktan sonra, OD_600nm ile zaman arasındaki ilişkiye bir lojistik eğri uydurarak, örneğin R'deki growthcurver paketinden SummarizeGrowth'u kullanarak, üstel büyüme aşamasına ulaşmak için iki katına çıkma süresini ve süresini belirleyin.
8. Katı ortamda görünür koloniler oluştuktan sonra, seyreltme faktöründen saymayı hedefleyerek koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın ve en iyi doğruluk için 50-100 koloni üretin.
9. Aşağıdaki formülü kullanarak kültür ortamındaki hücre yoğunluğunu hesaplayın: CFU/mL = koloni sayısı/(seyreltme faktörü × hacim kaplaması).
10. log10(CFU) ve log10(OD_600nm) arasındaki ilişkiyi belirlemek için log-log doğrusal regresyon gerçekleştirin. Bu nedenle, regresyon modelinin eğiminden ve kesişim noktasından belirli bir OD için tahmin edilen CFU/mL'yi hesaplayın: tahmini CFU = 10^{[eğim × log10(OD600nm) + kesişme]}.
11. (İsteğe bağlı) Ayrıca, termomikserlerde karşılaştırılabilir bir büyümenin elde edilip edilmediğini belirlemek için çalkalama inkübatörde 3.1-3.10 adımlarını gerçekleştirin.

4. Deneysel evrim için bağımsız soyların başlatılması

1. 1. Gün: Tek koloniler oluşturmak için, önce bir başlangıç kültürü oluşturmak için yukarıdaki bölüm 2'deki tüm adımları gerçekleştirin.
2. 3. Gün: Üstel fazda yeterli yoğunluğa ulaştığından emin olmak için kültürün OD_600nm'sini ölçün (spektrofotometre ile OD_600nm 0.3-0.8).
3. 1 x ^10-1-1 x ^10-6'dan S. acidocaldarius DSM639 kültürünün seri dilüsyonlarını oluşturun ve her 1 x ^10-5 ve 1 x ^10-6 seyreltmeden 100 μL'yi birkaç kopyada katı BBM ⁺ ortamı (Bölüm 1 ve Tablo 1) içeren 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yayın. Plakaları 75 ° C'de statik bir inkübatörde adım 3.5'teki gibi 5-7 gün boyunca tek kolonilerin çıkması için inkübe edin.
4. 8-10. Gün (kuluçkadan 5-7 gün sonra):
   1. Tek kolonilerden gelişen soyların sayısını belirleyin. Her soy için, bir aşılama döngüsü kullanarak plakalardan rastgele bir koloni seçin. Koloniyi, 1.5 mL önceden ısıtılmış BBM ⁺ ortamı içeren delinmiş 2 mL'lik bir tüpte yeniden süspanse edin. Tüpü uygun şekilde etiketleyin.
   2. İstenilen soy sayısı için tekrarlayın; burada yedi soy kuruldu ve SA1-7 olarak etiketlendi. Negatif kontrol olarak ek bir tüpü 1,5 mL BBM+ ile doldurun.
   3. Tüplerin üst kısımlarını nefes alabilen bir zarla kapatın ve kültürler bulanıklaşana kadar (spektrofotometre ile OD_600nm 0.3-0.8'e eşdeğer) 75 ° C, 400 rpm'de 48-72 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin.
5. 10-12. gün (aşılamadan 7-9 gün sonra):
   1. Tezgah üstü bir santrifüjde, klonal kültürleri RT'de 1 dakika boyunca 5.000 x g'da döndürün. Süpernatanı atın ve peleti 200 μL sıvı BBM ⁺ ile yeniden süspanse edin.
   2. 200 μL hücre süspansiyonlarını 200 μL %50 gliserol (%25 h/v gliserol) ile karıştırarak yedi bağımsız soyun gliserol stoklarını oluşturun ve -80 °C'de saklayın. Bunlar evrim deneyleri için ataların popülasyonlarıdır.

5. Sıcaklık evrimi deneyinin gerçekleştirilmesi

NOT: Deney protokolünün ana yönlerini özetleyen kavramsal bir diyagram Şekil 1'de verilmiştir.

1. Evrim deneyi için bölüm 4'te oluşturulan yedi atasal popülasyonu kullanın.
   1. Tüm deneysel evrim tahlillerini, geçirgen bir zarla kapatılmış steril, delinmiş 2 mL'lik tüplerde gerçekleştirin (yukarıda açıklanmıştır, bölüm 2).
   2. Bu popülasyonların yanı sıra, (çapraz) kontaminasyonu izlemek ve kültür büyümesi olmadığını gösteren OD için bir eşik ayarlamak için kültürden arındırılmış negatif kontroller olarak 1.5 mL BBM ⁺ ile ayrı delinmiş 2 mL tüpleri koruyun.
2. Sıcaklık işlemleri oluşturun: Termomikserlerin kullanılması, birden fazla sıcaklık işleminin oluşturulmasına izin verir. Burada, aşağıdaki sıcaklık işlemlerini kullanın: sabit 75 °C, sabit 65 °C ve sıcaklığı her 4 günde bir 1 °C azaltarak 75-65 °C'den kademeli olarak düşme ('sıcaklık düşüşü tedavisi').
   NOT: Bu tedaviler belirli deneysel gereksinimlere göre uyarlanabilir. Her sıcaklık işlemi için ayrı bir termomikser gereklidir.
3. 1. Gün: Bölüm 2'de belirtilen adımları izleyerek ataların popülasyonlarını gliserol stoklarından (adım 4.5'te hazırlanmıştır) canlandırın.
4. 3. Gün:
   1. Bu kültürleri_600nm'lik bir OD 0.01'e (spektrofotometre ile ölçülür) en az 6 mL önceden ısıtılmış BBM ⁺ toplam hacmine seyreltin. Yedi seyreltik atasal popülasyon kültürünün her birinden 1.5 mL'yi, adım 5.2'de belirlenen her sıcaklık işlemi için bir tane olmak üzere üç ayrı delinmiş 2 mL tüpe alikot edin.
      NOT: Bu açıklama adımı, her bir atasal popülasyonda mevcut olan herhangi bir genetik varyasyonun, evrim deneyinin başlangıcındaki tüm sıcaklık işlemlerinde mevcut olmasını sağlar. Bu kültürler, sıcaklık evrimi deneyine başlamak için transfer 0 (Tx0) görevi görecektir.
   2. Tüpleri nefes alabilen zarla kapatın ve yedi atadan kalma popülasyonun her bir setini ayrı termomikserlere yerleştirin. Evrim deneyine başlamak için her bir termomikseri gerekli sıcaklığa ve 400 rpm'ye ayarlayın.
5. 5. Gün:
   1. 48 saat sonra, Tx0 kültürlerinin her birinden (1:100 seyreltme) 15 μL kültür ile delinmiş 2 mL'lik bir tüpte 1.5 mL ısıtılmış BBM ⁺ ortamını aşılayarak transfer 1'i (Tx1) gerçekleştirin. Hız için, tek bir deneyden birden fazla aktarımı birlikte tamamlamak için bu adımı değişken genişlikli çok kanallı bir pipetle gerçekleştirin ve kültürlerin termomikserden çıkma süresini azaltın.
   2. Daha önce olduğu gibi, tüpleri rastgele konumlara kendi termomikserlerine geri koymadan önce kapatın. Randomizasyonu manuel olarak veya iMetaLab 96 kuyu randomizörleri aracılığıyla gerçekleştirin.
6. Bağımsız soyların büyümesini izlemek için plaka bazlı bir spektrofotometrede (96 oyuklu plakada 200 μL; boşluk olarak aynı hacimde BBM⁺ kullanılır) Tx0'ın OD 600nm'sini ölçün.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için yeni bir ortama aktarım yapıldıktan sonra OD_600nm ölçülmelidir. Optik yoğunluk, standart bir spektrofotometre gibi başka yollarla da ölçülebilir. Plaka bazlı bir spektrofotometrenin kullanılması, birden fazla kültürün aynı anda ölçülmesini sağlayarak süreci kolaylaştırır.
7. 5.5 ve 5.6 adımlarını, Tx2, Tx3, Tx4 vb.'ye karşılık gelen 7, 9, 11 vb. günlerde tekrarlayın. 75 °C ve 65 °C tedavileri için sıcaklığı sabit tutun. Sıcaklık düşüşü işlemi için, sıcaklığı her saniye 1 °C azaltın (yani Tx2, Tx4, Tx6, vb.).
8. Her 10^{. transferden} sonra popülasyonların gliserol stoklarını (adım 3.2.3) hazırlayın (yani, Tx10, Tx20, vb.), Tüpü ataların popülasyon tanımlayıcısı ile etiketleyin (örneğin, 1^{. bağımsız popülasyon} için SA1) ve transfer numarası (örneğin, 10^{. transfer için} Tx10). Bu gliserol stoklarını daha sonra popülasyonları canlandırmak, popülasyonların zaman içinde nasıl değiştiğini incelemek veya gerekirse deneyi yeniden başlatmak için kullanın (örneğin, kültür kaybıyla sonuçlanan kontaminasyon veya beklenmedik olaylar nedeniyle).
9. Deneyin ya önceden belirlenmiş sayıda transfer için ya da önceden belirlenmiş sayıda nesil geçene kadar devam etmesine izin verin. Son transferde, tüm soy soylarının gliserol stoklarını hazırlayın.
   NOT: Burada deney, Tx22'de meydana gelen sıcaklık düşüşü işlemi 65 °C'ye ulaşana kadar devam etti. Bu, yaklaşık 150 üretime karşılık gelir (4,6'da 100'lük seyreltme faktörüne göre hesaplanır: günlük₂(100) = transfer başına 6,64 nesil). Evrim deneylerinin uzunluğu, deney gereksinimlerine göre ayarlanabilir.

6. Evrim sonrası deney büyüme tahlilleri: atalara karşı evrimleşmiş soylar

NOT: Büyüme/zindelik tahlil protokolünü özetleyen kavramsal bir diyagram Şekil 2'de verilmiştir.

1. 1,5 mL BBM⁺ ile delinmiş 2 mL'lik tüpler hazırlayın. Tüm soy soylarını ve ataların her bir suşunu büyütmek için yeterli tüp hazırlayın.
2. Adım 2.2-2.5'te özetlenen yöntemi kullanarak evrim deneyinin son transferinden sonra 5.9. adımda depolanan atasal popülasyonları ve her bir soy popülasyonunu canlandırın, ancak her popülasyonun evrim deneyinin son iki transferi için deneyimlediği sıcaklıkta inkübasyon ile, yani 75 °C sabit tedavi için 75 °C ve 65 °C sabit ve sıcaklık düşüşü deneyleri için 65 °C. Karşılaştırılabilir popülasyon yoğunlukları elde etmek için, 75 °C inkübasyonu 72 saat ve 65 °C inkübasyonu 120 saat boyunca gerçekleştirin.
3. Plaka bazlı bir spektrofotometre ile yetiştirilen kültürlerin OD_600nm'sini ölçün.
4. Her soydan gelen popülasyonun ve her atadan kalma suşun her iki sıcaklıkta (yani 75 ° C ve 65 ° C) üç kopyada büyüme tahlillerini gerçekleştirin. 1,5 mL BBM⁺ ile delinmiş 2 mL santrifüj tüplerini hazırlayın. Her evrimleşmiş soy ve her atadan kalma suş için altı tüp hazırlayın. Tüpleri köken adı (SA1-7 veya ata), büyüme sıcaklığı (75 °C veya 65 °C) ve çoğaltma kimliği (1, 2 veya 3) ile etiketleyin.
   NOT: Altıdan az termomikser mevcutsa, büyüme tahlili birkaç deney bloğunda birkaç gün boyunca tekrarlanabilir. Bu durumda, blok etkilerinin istatistiksel olarak tahmin edilebilmesi ve açıklanabilmesi için her deneysel bloktaki her soy ve atayı ölçmek önemlidir.
5. Hazırlanan altı tüpteki taze ortamı, her bir soy soyundan ve atalardan kalma suştan 15 μL kültür ile aşılayın.
6. Üç termomikseri 75 °C'ye ve üç termomikseri 65 °C'ye ayarlayın, her bir termomikseri bir kopya ID'ye atayın. Tüpleri sıcaklığa karşılık gelen termomiksere yerleştirin ve ID'yi çoğaltın. Her termomikser içinde, heterojenliği kontrol etmek için soyların ve ataların rastgele yerleştirildiğinden emin olun.
7. Her bir 24 tüp setini geçirgen bir zarla kapatın. 48 saat kuluçkaya yatırın.
8. Her kültürden 200 μL'yi 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Bir spektrofotometre kullanarak OD_600nm'yi ölçün.
   NOT: Mikrosantrifüj tüpleri ve 96 oyuklu plakalar arasında transferi kolaylaştırmak için değişken genişlikli çok kanallı bir pipet kullanılabilir.
9. İstatistiksel yazılım (örneğin, R) kullanarak verileri çizin ve analiz edin.

7. Evrimleşmiş soyların tüm genom dizilimi ve mutasyonların tanımlanması

1. Bölüm 2, adım 2.2-2.5'te olduğu gibi her donmuş popülasyondan bir buz sıyrığı BBM⁺'ya 48-72 saat arasında 75 °C'de önceden ısıtılmış BBM⁺'da adım 5.9'da depolanan soy soylarını canlandırın. Yeterli miktarda genomik DNA elde etmek için 1-10 mL kültür hacmi hazırlayın. Gereken tam hacim, adım 7.2 veya 7.3'te (aşağıda) sıralama için seçilen seçeneğe bağlıdır.
   NOT: Ataların popülasyonlarını başlatmak için kullanılan suşu da sıralamak iyi bir uygulamadır. Bu, soydan gelen soylarda tespit edilen herhangi bir mutasyonun daha önce değil, evrim deneyi sırasında ortaya çıkıp çıkmadığını doğru bir şekilde belirlemek içindir.
2. (Seçenek 1) Genomik DNA'yı çıkarın ve Illumina dizilimi için Illumina dizileme kitaplıklarını hazırlayın.
   1. Bakteriler için ticari bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak genomik DNA'yı ekstrakte edin ve saflaştırın.
   2. Ekstrakte edilen genomik DNA'nın, sağlayıcı tarafından önerilen ticari kitleri kullanarak dizileme sağlayıcısının miktar ve kalite gereksinimlerini karşıladığından emin olun.
   3. Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak genomik DNA kütüphanesi hazırlığı gerçekleştirin. 250 bp çift uçlu bir protokol önerilir. Ekstrakte edilen genomik DNA'yı, numuneleri dizileme sağlayıcısına göndermeye hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.
3. (Seçenek 2) Alternatif olarak, örnekleri DNA ekstraksiyonu, genomik DNA kalite kontrolleri, Illumina kütüphane hazırlığı ve Illumina dizilemesini birleşik bir hizmet olarak gerçekleştiren ticari bir sağlayıcıya gönderin.
4. Mutasyonları tanımlamak için dizilenmiş genomları analiz edin.
   1. FASTQ dosyalarını alın ve sıralama sağlayıcısı tarafından henüz gerçekleştirilmediyse, Q15'lik bir kayar pencere kalitesi kesme ile Trimmomatic kullanarak adaptör kırpma işlemini gerçekleştirin.
   2. Kırpılmış FASTQ dosyalarını kullanarak, mutasyonları tespit etmek için breseq ardışık düzenini (sürüm 0.38.1) çalıştırın ve genomik DNA okumalarını seçilen suş için referans dizisiyle karşılaştırın. S. acidocaldarius DSM639 için bu, RefSeq ID NC_007181'dir.

8. (İsteğe bağlı) Termomikser ve inkübatör enerji tüketiminin değerlendirilmesi

1. Bir inkübatör ile büyüme için bir termomikser kullanmanın enerji tüketimini karşılaştırmak için, bir enerji izleme fişi kullanarak her bir cihazın enerji tüketimini 24 saatin üzerinde ölçün.
2. Her iki cihazın enerji tüketimini aynı anda ölçmek için iki fiş kullanın. Alternatif olarak, birbirini izleyen günlerde enerji tüketimini ölçün.
3. İnkübatörü veya termomikseri elektrik prizinden çıkarın. Enerji izleme fişini prize takın ve izleme ve kontrol yazılımının kurulumu da dahil olmak üzere üreticinin talimatlarına göre başlatın.
4. Tipik enerji tüketiminin iyi bir tahminini elde etmek için inkübatörü veya termomikseri enerji izleme fişine takın ve en az 2 saat (ancak ideal olarak 24 saat veya daha uzun) çalışmasına izin verin. Her cihazın enerji tüketimini kaydedin.

Sonuçlar

Büyüme eğrisi ölçümleri
S. acidocaldarius DSM639 için büyüme eğrileri Şekil 3A'da gösterilmiştir. Termomikserler kullanılarak yapılan inkübasyon ile geleneksel inkübatörlerdeki inkübasyon karşılaştırıldığında büyümenin benzer olduğu bulundu. Ortalama büyüme hızı parametreleri, tekrarlanan her bir büyüme eğrisine bir lojistik eğri uydurularak ve ortalama ve standart hata hesaplanarak tahmin ed...

Tartışmalar

Bu çalışma, termofiller için deneysel bir evrim protokolü geliştirdi, burada archaeon S. acidocaldarius için uyarlanmış, ancak yüksek sıcaklıkta büyüme gereksinimleri olan diğer mikroplara uyarlanabilir. Bu protokol, başlangıçta mezofilik bakteriler için tasarlanmış teknikler üzerine kuruludur, ancak yüksek sıcaklıkta aerobik büyüme ile ilişkili teknik zorlukların üstesinden gelmek için özel olarak modifiye edilmiştir^...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe-driven membrane filters	StarLab	E4780-1226	For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loops	Greiner	731161, 731165, or 731101	For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tips	StarLab	S1111-6811	Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubes	StarLab	S1620-2700	For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tips	StarLab	S1111-0816	Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottom	Corning	430828 or 430829	Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using.
50 mL syringe	BD plastipak	300865	For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)	Nunc	260860	For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipette	Pipet-Lite	LA8-300XLS	Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	For Brock stock solution I.
Autoclave	Priorclave	B60-SMART or SV100-BASE	Other autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)	Greiner	M9062	Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)	Supelco	1025560100	For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)	Thermo Scientific Chemicals	11462858	Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishes	Brand	BR455742	Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
Incubator	New Brunswick	Innnova 42R	Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)	Supelco	103943	For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	230391	For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	For Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring	Tapo	Tapo P110	To monitor energy consumtion
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)	none	none	For piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	For Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)	Sigma-Aldrich	S9640	For Trace element stock solution.
Spectrophotometer	BMG	SPECTROstar OMEGA	For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)	Thermo Scientific Chemicals	11337588	Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)	Sigma-Aldrich	U0750	Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	221376	For Trace element stock solution.