Korunmuş Ejeksiyon Fraksiyonu ile Hiperlipidemiye Bağlı Kalp Yetmezliğinin Murin Modeli

Özet

Bu protokol, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile hiperlipidemiye bağlı kalp yetmezliğinin bir murin modelini çoğaltmak için ayrıntılı bir yaklaşım sunar. Tasarım, adeno ile ilişkili virüs 9-kardiyak troponin T-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü (AAV9-cTnT-LDLR) ve poloksamer-407'nin (P-407) uygulanmasını birleştirir.

Özet

Lipotoksisite tarafından yönlendirilen korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliğinin patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. Kardiyo-metabolik HFpEF'i doğru bir şekilde taklit eden hayvan modellerine olan acil ihtiyaç göz önüne alındığında, HFpEF hastalarında görülen tersine mühendislik fenotipleri ile hiperlipidemiye bağlı bir fare modeli geliştirilmiştir. Bu model, lipotoksisite ve metabolik sendrom arasındaki etkileşime odaklanarak HFpEF'i araştırmayı amaçladı. Hiperlipidemi, lipoprotein lipazı bloke eden bir blok kopolimer olan poloksamer-407'nin (P-407) iki haftalık intraperitoneal enjeksiyonları yoluyla 129J suş arka planında vahşi tip (WT) farelerde indüklendi, adeno-ilişkili virüs 9-kardiyak troponin T-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörünün (AAV9-cTnT-LDLR) tek bir intravenöz enjeksiyonu ile birleştirildi. Tedaviden 4 ila 8 hafta sonra ekokardiyografi, kan basıncı kaydı, tüm vücut pletismografisi, ekokardiyografi (EKG) telemetrisi, aktivite tekerleği izleme (AWM) ve biyokimyasal ve histolojik analizler dahil olmak üzere kapsamlı değerlendirmeler yapıldı. LDLR / P-407 fareleri, diyastolik disfonksiyon, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ve artmış sol ventrikül duvar kalınlığı dahil olmak üzere dört haftada ayırt edici özellikler sergiledi. Özellikle, kan basıncı ve böbrek fonksiyonu normal aralıklarda kaldı. Ek olarak, EKG ve AWM sırasıyla kalp blokları ve azalmış aktivite ortaya çıkardı. Diyastolik fonksiyon sekiz haftada kötüleşti ve solunum hızlarında önemli bir düşüş oldu. Çift tedavi modeliyle ilgili daha fazla araştırma, yüksek fibroz, ıslak / kuru akciğer oranları ve kalp ağırlığı / vücut ağırlığı oranlarını ortaya çıkardı. LDLR / P-407 fareleri ksantelazmalar, asitler ve kardiyak iskemi sergiledi. İlginç bir şekilde, ani ölümler tedaviden 6 ila 12 hafta sonra meydana geldi. Murin HFpEF modeli, lipotoksisite aracılı HFpEF bağlamında diyastolik disfonksiyona katkıda bulunan metabolik sendromun karmaşıklıklarını aydınlatmak için değerli ve umut verici bir deneysel kaynak sunmaktadır.

Giriş

Korunmuş ejeksiyon fraksiyonu (HFpEF) ile kalp yetmezliği, çoklu komorbiditelerin eşlik ettiği kardiyometabolik bir sendromu ifade eder ve tüm kalp yetmezliği vakalarının %50'sinden fazlasını oluşturur ^1,2. Ayrıca, HFpEF sıklığı son on yılda istikrarlı bir şekilde artmıştır³. Sınırlı tedavi seçenekleri ile HFpEF, çok yönlü patofizyolojisi göz önüne alındığında, kardiyovasküler hastalıkta karşılanmamış en önemli tıbbi gerekliliği temsil etmektedir4. Bu nedenle, etkili tedaviler geliştirmek için HFpEF'in altında yatan mekanizmaların ve patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için acil bir ihtiyaç vardır.

Son yıllardaki önemli gelişmelere rağmen, lipotoksisiteye atfedilen HFpEF patofizyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır. HFpEF'li hastaların, azalmış ejeksiyon fraksiyonu (HFrEF) olan kalp yetmezliği olanlara ve sağlıklı kontrollere kıyasla kayda değer miyokardiyal lipid birikimi sergilediği tespit edilmiştir⁵. Kardiyak biyopsilerden elde edilen RNA dizileme verileri, HFpEF grubunda sağlıklı ve HFrEF hastalarına kıyasla lipoprotein lipaz (LPL) geninin aşağı regülasyonunu gösterdi⁶. Poloksamer-407 (P-407), LPL'yi bloke ederek ve ardından plazma trigliseritlerini ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterolü artırarak hiperlipidemiyi indükleyen bir blok kopolimerdir⁷. Önceki çalışmalar, HFpEF farelerinin kalplerinde yüksek LDL-Reseptör (LDLR) ekspresyonu göstermiştir⁸.

Bu bulgulara dayanarak ve kardiyo-metabolik HFpEF'i doğru bir şekilde taklit eden hayvan modellerine olan acil ihtiyacı kabul ederek, hiperlipidemiye bağlı bir murin modeli geliştirildi ve sunuldu. Bu model, açıkça metabolik sendromun yanı sıra lipotoksisitenin katılımına odaklanan HFpEF'i keşfetmek için uyarlanmıştır. Hiperlipidemi / LPL blokajı ve gelişmiş kardiyak LDLR ekspresyonu ile indüklenen bu model, WT-129 farelerinde, tek bir intravenöz (i.v.) adeno-ilişkili virüs 9-kardiyak troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR⁾ enjeksiyonu ile birlikte iki haftada bir intraperitoneal (ip) P-407 enjeksiyonları yoluyla kurulmuştur9.

Tedaviden 4 ila 8 hafta sonra, ekokardiyografi, kan basıncı kayıtları, tüm vücut pletismografisi (WBP), sürekli elektrokardiyografi (EKG) telemetrisi, aktivite tekerleği izleme (AWM) ve ayrıca biyokimyasal ve histolojik analizleri kapsayan kapsamlı bir dizi değerlendirme yapıldı⁹. Dört haftada, LDLR / P407 veya "çift tedavi" fareleri, diyastolik disfonksiyon, korunmuş ejeksiyon fraksiyonu ve artmış sol ventrikül duvar kalınlığı⁹ dahil olmak üzere farklı HFpEF özellikleri sergiledi. Ek olarak, EKG telemetrisi ve AWM sırasıyla kalp bloklarını ve azalmış aktiviteyi ortaya çıkardı. Özellikle, kan basıncı ve böbrek fonksiyonu normal kaldı⁹. Sekiz haftaya kadar, diyastolik fonksiyon kötüleşti ve WBP ölçümleri solunum hızlarının azaldığını ortaya çıkardı⁹.

Çift tedavi modelinin daha fazla araştırılması, fibrozis, yüksek ıslak / kuru akciğer oranları ve kalp ağırlığı / vücut ağırlığı oranlarını ortaya çıkardı⁹. Nekropsi asit, kardiyak iskemi ve ksantelazmayı ortaya çıkardı. Şaşırtıcı bir şekilde, tedaviden 6 ila 12 hafta sonra ani ölümler belgelenmiştir⁹. Bu murin hiperlipidemi güdümlü HFpEF modeli, lipotoksisite aracılı HFpEF ile diyastolik disfonksiyona katkıda bulunan metabolik sendromun karmaşıklıklarını çözmek için hızlı, değerli ve umut verici bir deneysel araç sağlar.

Protokol

Hayvan protokolü, Miami Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) yönergelerine (IACUC protokolü 23-103-ad03) uygun olarak onaylandı. Bu çalışma için, 129J arka planındaki vahşi tip (WT) fareler ticari bir kaynaktan elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve şirket içinde yetiştirildi. Tüm fareler 129J arka plan üzerinde littermat idi. Deneyler hem erkek hem de dişi fareleri içeriyordu. LDLR / P-407 HFpEF faresi, birinci haftada tek bir doz AAV9-cTnT-LDLR ve dört hafta boyunca iki haftada bir p407 uygulanarak oluşturulmuştur.

1. AAV9-cTnT-LDLR hazırlama ve uygulama

NOT: AAV9-cTNT-hLDLR plazmidi (Malzeme Tablosuna bakınız) tam insan LDLR proteinini (2664bp) kodlar (Şekil 1).

1. AAV-LDLR viral vektör hazırlama
   1. Hayvan sayısına bağlı olarak, AAV9 stok şişelerini 20 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün, ardından 100 μL'de 1 x^{10 12} vektör genomu/fare konsantrasyonu elde etmek için AAV parçacıklarını Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) seyreltin.
   2. Viral çözeltiyi 1 mL'lik bir şırınga üzerinde 28-30 G'lik bir iğneye yerleştirin. İğnenin içine hava kabarcıkları çekmemeye dikkat edin.
2. İntravenöz (i.v.) kuyruk ven enjeksiyon işlemleri
   1. Oksijeni 0,5 L/dk'ya kadar açın ve izofluran anestezi sistemini %4-%5'e ayarlayın. Fareyi, hayvan yanıt vermeyene kadar ~ 2 dakika boyunca indüksiyon odasına yerleştirin.
   2. Hayvanı bir fare kuyruğu aydınlatıcı tutucunun (örneğin, Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) üzerine yerleştirin ve hayvanı yan yatarak yerleştirin. Bakım için% 2 -% 3'e kadar izofluran anestezisi kullanın.
      NOT: Kısıtlayıcı cihaz tarafından ısıtılması, farelerin kuyruk damarının genişlemesine neden olacak ve bu nedenle enjekte edilmesini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.
   3. Yanal kuyruk damarını tanımlayın. Enjeksiyon alanını bir gazlı bez kullanarak antiseptik ile temizleyin.
   4. Uzatmak için kuyruğun ucunu tutun ve damar görüntülenene kadar fare kuyruğuna parmaklarınızla masaj yapın. İğneyi düşük bir açıyla (10-15 derecelik açı) yerleştirin ve kuyruk damarına 100 μL seyreltilmiş AAV enjekte edin (Şekil 2A).
   5. İğneyi geri çekin ve kanama durana kadar hemen parmağınızla baskı uygulayın. Fareyi orijinal kafesine geri koyun.

2. P-407 hazırlanması ve uygulanması

1. P-407 hazırlama
   1. P-407 ajanını (Malzeme Tablosuna bakınız) DPBS ile bir çeker ocak içinde 100 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek çözeltiyi hazırlayın. P-407^10'un çözülmesini kolaylaştırmak için çözeltiyi gece boyunca 4 °C'de bir döndürücü üzerinde soğutun.
2. İki haftada bir intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon prosedürü
   1. Her fareyi i.p. enjeksiyonlarının ilk gününde tartın. 1 g / kg formülünü kullanarak, ağırlıklara göre her fare için uygun dozu hesaplayın ve şırıngaları önceden doldurun.
   2. Çeker ocak altında, iç organları kafatası olarak yeniden konumlandırmak için fareyi baş ve gövde aşağı doğru eğik olacak şekilde manuel olarak tutun. Bu teknik, çevredeki hayati yapıların delinmesini önler.
   3. Karnın alt kadranında, orta hattın lateralinde sol periton boşluğunu tanımlayın. Bölgeyi antiseptik ile temizleyin.
   4. 45 derece veya daha az bir açıyla iğneyi periton boşluğuna yerleştirin (Şekil 2B). Yeterli yerleştirmeyi sağlamak için şırıngayı aspire edin.
   5. Aspirasyonda kan veya doku varsa, iğneyi geri çekin ve şırınga berraklaşana kadar 2.2.2 -2.2.4 adımlarını tekrarlayın. İğneyi uygun kesici alet kabına atın ve fareyi orijinal kafesine geri koyun.

3. Ekokardiyografi değerlendirmesi

1. Hazırlık
   1. Tüy dökücü kremi farenin göğsüne ve üst karnına görüntülemeden bir gün önce veya birkaç saat önce uygulayın. 2 dakika sonra kremayı ıslak gazlı bezle çıkarın.
   2. Fareyi 0.8 L / dak akış hızında% 2.5 -% 3.0 izofluran ile uyuşturun ve% 1 -% 1.5 izofluran ile koruyun. Ardından, fareyi sırtüstü pozisyonda uygun platforma, pençeleri iletken jel ile elektrot pedleri üzerinde olacak şekilde sabitleyin ve izofluran ile sürekli anestezi sağlamak için burnu ve ağzı bir burun konisi ile kapatın.
2. Parasternal uzun eksen görünümü
   1. Fare sırtüstü konumdayken, platformun sağ tarafını 45 derece eğin.
   2. Daha sonra, B modu görüntülerini elde etmek ve saklamak için sağ üst ekstremiteden sol karın bölgesine kadar saat yönünde 30-40 derece açı vererek dönüştürücü probunu ray sisteminde çapraz olarak hizalayın.
   3. Ejeksiyon fraksiyonunu elde etmek için ultrason analiz yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak B-modu görüntülerini analiz edin (Şekil 3A).
3. Parasternal kısa eksen görünümü
   1. B modu ve M modu görüntülerini elde etmek ve saklamak için ray sistemindeki dönüştürücü probunu saat yönünde 90 derece döndürün.
4. Apikal görünüm
   1. Platformun sol üst köşesini aşağı ve sağa doğru eğin. Dönüştürücüyü hayvanın sağ omzuna doğru yönlendirin.
   2. Mitral kapağı B modunda ve renkli Doppler modunda görselleştirin. Darbeli dalga (PW) Doppler ve doku Doppler görüntülerinin elde edilmesi ve saklanması⁵.
   3. IVRT, E/E' ve E/A'yı elde etmek için ultrason analiz yazılımını kullanarak PW Doppler ve doku Doppler görüntülerini analiz edin (Şekil 3B-E).

4. Basınç-hacim (PV) döngü veri kaydı

1. Çalışmanın sonunda, daha önce açıklanan prosedürü^11,12 izleyerek sol ventrikül (LV) sistolik ve diyastolik fonksiyonunu değerlendirmek için hemodinamik analizler yapın.
   1. Fareyi izofluran (% 3-5, indüksiyon odası) ile indükleyerek başlayın.
   2. Anestezik etki başladığında, hayvanı cerrahi tezgaha aktarın ve izofluran (% 1-3, yüz maskesi) ile anesteziyi sürdürün.
   3. Endotrakeal entübasyona (ağız yoluyla) izin vermek için boynun üzerindeki deride küçük bir kesi yapın.
   4. Hayvanı, ~ 0.15-0.2 mL hacme ve solunum hızı 120-170 nefes / dk'ya ayarlanmış bir kemirgen ventilatörü (örneğin, Mikro havalandırma modeli 848, Harvard Aparatı) kullanarak oksijen ve izofluran karışımı ile havalandırın.
   5. Sıcaklık kontrollü bir cerrahi masa kullanarak işlem boyunca vücut sıcaklığını ~ 37 ° C ± 1 ° C'de izleyin.
   6. Sıvı desteği uygulaması için sol iç juguler veni 30 G'lik bir iğne ile açığa çıkarın ve kanüle edin.
   7. Cildi medyan ventral boynun bölgesinden kesin ve karotis arteri ortaya çıkarın. Sağ karotis arterin distal kısmının tıkanmasından sonra, sol ventriküle mikro uçlu bir basınç-hacim (PV) kateterinin (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirilmesine izin vermek için arterde küçük bir kesi yapın (kapalı göğüs yaklaşımı).
   8. Kararlı durum ve inferior vena kava oklüzyonu sırasında PV döngülerini kaydedin.
   9. Deneyin sonunda, onaylanmış bir AVMA yöntemi (örneğin, İzofluran ve ardından servikal çıkık) kullanarak hayvanı (derin anestezi altında) insancıl olarak ötenazi yapın.
   10. LabChart yazılımını kullanarak PV verilerini analiz edin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ekokardiyografik ölçümleri kullanarak hacimleri kalibre edin.

Tartışmalar

Son on yılda HFpEF prevalansındaki istikrarlı artışa rağmen, altta yatan patofizyolojinin somut bir şekilde anlaşılması zor olmaya devam etmektedir¹³. Ayrıca, bugün itibariyle, sınırlı kanıta dayalı tedavi mevcuttur¹³. Kardiyo-metabolik HFpEF ile ilgili mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir. Daha önce, ne kronik böbrek hastalığı (KBH) ne de kardiyak LDLR OE ve p407 enjeksiyonlarının neden olduğu hipertansiyon ile HFpEF'i taklit eden bir hiperlipidemik fare modeli tanıtılmıştı⁹.

Bulgular, kardiyak LDLR OE ve hiperlipidemi kombinasyonunun, daha önce yayınlandığı gibi, dört hafta sonra farelerde diyastolik disfonksiyon, aritmiler, sol ventrikül (LV) hipertrofisi, egzersiz intoleransı, kardiyak lipid birikimi ve fibroz ile sonuçlandığını ortaya koydu⁹. Bu farelerin kalplerinde, karaciğer ve iskelet kaslarında LDL-kolesterol alımında bir artış ve kalplerde ve karaciğerde trigliseritlerde azalma da gözlenmiştir⁹. Bu yöntemin avantajı, gelişmesi için 16 ve 20 haftaya kadar süren yüksek yağlı diyet (HFD) gibi diğer hiperlipidemik HFpEF fare modellerine kıyasla iyi anlaşılmayan kardiyo-metabolik sendrom yolaklarını araştırma hızındadır¹⁴. Bu modelin gelişmesi dört hafta sürer ve insanlarda metabolik anormallikleri taklit eder. Bu nedenle, bu modelin tekrarlanabilirliği esastır.

AAV9-cTnT-LDLR ve P-407'nin kapsamlı bir şekilde hazırlanmasını ve uygulanmasını sağlamak zorunludur. Bu modelin tekrarlanabilirliği, büyük ölçüde P-407 ve AAV9-cTnT-LDLR konsantrasyonlarının ve dozlarının doğru hesaplamalarına ve ayrıca ağırlık ölçümlerine bağlıdır. Aynı derecede önemli olan, çözelti preparatları ve uygun intravenöz ve intraperitoneal enjeksiyon teknikleridir. Bu tekniklerdeki sapmalar önemli değişikliklere ve istenmeyen sonuçlara neden olabilir.

Bu modelin etkinliğine ve verimliliğine rağmen, çeşitli sınırlamalar mevcuttur. İntravenöz ve intraperitoneal enjeksiyonları gerçekleştirmek için sıkı bir eğitim gereklidir. Ek olarak, intravenöz ve sık intraperitoneal enjeksiyonlarla ilişkili potansiyel bir morbidite ve mortalite riski vardır. İntravenöz enjeksiyonlar yapılırken fare kuyruğu yaralanmaları meydana gelebilirken, intraperitoneal enjeksiyonlarda çekum delinmesi meydana gelebilir ve bu da peritonite yol açabilir¹⁵. Bu yaralanmalar tipik olarak yanlış tekniklerden kaynaklanır ve deney deneklerinin ve tedavinin kaybedilmesine neden olabilir. Bu nedenle, bu prosedürleri gerçekleştirmeden önce kapsamlı bir eğitim gereklidir. Diğer bir sınırlama, bu modelin 129J gerilimine odaklanmasıdır. 129J suşunun seçiminin ardındaki mantık, başlangıçta yayınlanmamış araştırmalarda incelediğimiz C57BL / 6 farelerine kıyasla bu suşta daha hızlı diyastolik disfonksiyon ve HFpEF bulguları veren ön çalışmalardan kaynaklanmaktadır.

Bu sınırlamalardan bağımsız olarak, bu model HFpEF'de yer alan altta yatan mekanizmalar ve potansiyel etkili tedavi seçenekleri hakkında daha hızlı araştırmalara izin verecektir. Önceki çalışmalar, 5-15 hafta boyunca kardiyometabolik HFpEF ile indüklenen HFD ve N [w] -nitro-l-arginin metil ester (L-NAME) için patofizyolojik bir modelin geliştirilmesine yol açmıştır¹³. Bununla birlikte, HFpEF prevalansındaki sürekli artış nedeniyle, kardiyometabolik HFpEF'in patofizyolojisinin daha iyi anlaşılmasına ve etkili tedavinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır. Kardiyak LDLR OE ve p407 ile indüklenen hiperlipideminin bu fare modeli, gelecekteki araştırma çabaları için kardiyometabolik HFpEF'i indüklemenin hızlı ve uygulanabilir bir yöntemidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory