Bakteriyel Glutamat Reseptör Kanalının, Hücresiz Bir Ekspresyon Sisteminin Kapsüllenmesi ile Sulandırılması

Özet

Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.

Özet

Hücresiz ekspresyon (CFE) sistemleri, sentetik biyolojide, sentetik hücrelerde biyoalgılama ve enerji rejenerasyonu gibi hücresel işlevlerin biyomimikrisine izin veren güçlü araçlardır. Bununla birlikte, çok çeşitli hücresel süreçlerin yeniden yapılandırılması, zar proteinlerinin sentetik hücrelerin zarına başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılmasını gerektirir. Çözünür proteinlerin ekspresyonu genellikle yaygın CFE sistemlerinde başarılı olsa da, sentetik hücrelerin lipid çift katmanlarında zar proteinlerinin yeniden yapılandırılmasının zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, bir model membran proteini olan bakteriyel glutamat reseptörünün (GluR0), dev unilamellar veziküllerde (GUV'ler) sentetik hücreler içinde CFE reaksiyonunun kapsüllenmesine ve inkübasyonuna dayalı olarak model sentetik hücreler olarak sulandırılması için bir yöntem gösterilmiştir. Bu platformu kullanarak, GluR0'ın N-terminal sinyal peptidinin proteorhodopsin sinyal peptidi ile ikame edilmesinin, GluR0'ın hibrit GUV'lerin membranlarına başarılı kotranslasyonel translokasyonu üzerindeki etkisi gösterilmiştir. Bu yöntem, sentetik hücrelerde çeşitli zar proteinlerinin hücresiz olarak yeniden yapılandırılmasına izin verecek sağlam bir prosedür sağlar.

Giriş

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji, biyomühendislik, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıpta çok sayıda potansiyel uygulamaya sahip gelişmekte olan bir alan olarak son on yılda artan bir ilgi kazanmıştır ^1,2. Özellikle aşağıdan yukarıya sentetik biyolojinin temel taşı olarak sentetik hücrelerin geliştirilmesi, sentetik hücrelerin umut verici uygulamalarının yanı sıra in vitro biyofiziksel çalışmaları kolaylaştıran hücre benzeri fiziksel ve biyokimyasal özellikleri nedeniyle çok çeşitli bilimsel toplulukları cezbetmiştir 3,4,5,6

Protokol

Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) varlığında toplu CFE reaksiyonları

1. SUV hazırlığı
   NOT: Bu adımın, kloroform ile çalışmaya ilişkin güvenlik talimatlarına uygun olarak çeker ocakta gerçekleştirilmesi gerekir.
   1. Kloroform içinde çözünmüş 76 μL 25 mg / mL POPC stok çözeltisini aktararak bir cam şişede 5 mM 1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC) SUV hazırlayın.
   2. Cam şişeyi nazikçe döndürürken, altta bir kuru lipit filmi oluşturmak için şişeye hafif bir argon akışı üfleyin. Daha sonra,....

Tartışmalar

Hücre sinyalizasyonu veya hücre uyarımı gibi moleküllerin veya bilgilerin hücre zarı boyunca transferine bağlı olan hemen hemen her hücresel süreç, zar proteinleri gerektirir. Bu nedenle, zar proteinlerinin sulandırılması, farklı uygulamalar için çeşitli sentetik hücre tasarımlarının gerçekleştirilmesinde ana darboğaz haline gelmiştir. Biyolojik membranlardaki membran proteinlerinin geleneksel deterjan aracılı sulandırılması, hafif şişme veya elektroformasyon gibi GUV üretim yöntemleri.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600