JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Sanleng Jiashen formülünün ortotopik hepatosellüler karsinomlu BALB/c-nu fareleri üzerindeki terapötik ve vasküler inhibitör etkilerini araştırmak için adım adım protokolü sunuyoruz.

Özet

Karaciğer kanserinin ölümcüllüğü ve kimyasal ilaçlara karşı direnç, karaciğer kanseri için geleneksel bitkilerin etkili reçetelerinin araştırılmasını zorunlu kılmıştır. Tekrarlanabilir, manipüle edilmesi kolay ve karaciğer kanserinin patofizyolojik süreçlerini yüksek oranda taklit eden hayvan modelleri, etkili ilaç adaylarının başarılı bir şekilde taranması için ön koşuldur. Bu arada, güvenilir ilaç etkinliği değerlendirme göstergeleri ve araçları da anti-karaciğer kanseri ilaç araştırma ve geliştirmesinin garantisidir.

Sanleng Jiashen formülü, Sparganium stoloni erum, Buch içeren geleneksel Çin tıbbının temsili bir reçetesi. -Jambon. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (ravent) ve Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), karaciğeri beslemek ve ısıyı temizlemek, toksinleri uzaklaştırmak ve karaciğer kanserini tedavi etmek için kan dolaşımını teşvik etmek için reçete edilir. Bu deneysel protokol, liyofilize Sanleng Jiashen formülünün hazırlanmasını ve BALB/c-nu farelerinde in-situ karaciğer kanserinin kuruluş sürecini açıklar. Histopatolojik boyama, kanser belirteçlerinin immünohistokimyasal tespiti, farelerin in vivo görüntülemesi ve civciv embriyosu koryoallantoik membran testi, Sanleng Jiashen formülünün karaciğer kanseri dokusunun malign proliferasyonu üzerindeki inhibisyonu ve anti-anjiyogenez etkisini araştırmak için kullanıldı. Veriler, Sanleng Jiashen formülünün, tümör kütlesi hacminin azalması, patolojik hasarın iyileşmesi ve kanser belirteci ki67'nin daha düşük seviyeleri ile kendini gösteren karaciğer kanseri dokusunun malign proliferasyonuna etkili bir şekilde direnebileceğini göstermektedir.

Anjiyogenezin üstün inhibisyonu ayrıca Sanleng Jiashen formülünün karaciğer kanserinin ilerlemesini ve bozulmasını tedavi etme ve önleme potansiyeline sahip olabileceğini düşündürmektedir. Tüm deney şeması, bir karaciğer kanseri modelinin kurulması ve optimizasyonu için bir referans sağlayan fare karaciğer kanserinin tedavisinde geleneksel Çin tıbbı bileşenlerinin kapsamlı bir sürecini ve ayrıca karaciğer kanserini önlemek ve tedavi etmek için ilaçların araştırılması ve geliştirilmesini göstermektedir.

Giriş

Karaciğer kanseri, karaciğerden kaynaklanan ölümcül bir kanserdir ve dünya çapında kansere bağlı ölümlerin en yaygın ikinci nedenidir1. Amerika Birleşik Devletleri'nde ve bazı gelişmekte olan ülkelerde karaciğer hastalığı oranları yüksek seviyeler göstermektedir ve 2030 yılına kadar dünya çapında 1 milyondan fazla karaciğer kanseri vakası olabilir2. Sigara, obezite ve alkol gibi sağlıksız yaşam alışkanlıkları ve hepatit B, hepatit C ve diğer virüslerin tahribatı nedeniyle, karaciğer kanserinin görülme sıklığı ve mortalitesiher geçen yıl önemli ölçüde artmıştır. Farklı histolojik özelliklere ve kötü prognoza sahip heterojen bir malign tümör olan karaciğer kanseri, hepatosellüler karsinom, intrahepatik kolanjiokarsinom ve fibrolameller karaciğer kanseri dahil olmak üzere çok geniş bir insidans aralığına sahiptir4. Karaciğer kanseri genellikle ileri bir aşamada teşhis edilir ve birçok ileri hasta radyasyon tedavisi için aday değildir5. Multikinaz inhibitörü sorafenib, ilerlemiş karaciğer kanseri olan hastalar için oldukça kabul gören bir ilaçtır, ancak hastalar genellikle kısa bir süre içinde önemli direnç geliştirir6. Şu anda, sorafenib ile birlikte bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri PD-1 ve PD-L1, karaciğer kanseri gelişimini kontrol etmede bir miktar ilerleme kaydetmiştir, ancak terapötik etki hala tartışmalıdır7.

Ortotopik karaciğer kanseri, karaciğer kanserinin erken bir türüdür: kanser hücreleri karaciğer dokusunun etrafına yayılmamıştır veya organlar arası metastaz meydana gelmez ve karaciğerin işlevi büyük ölçüde etkilenmez8. Ortotopik karaciğer kanseri genellikle belirgin rahatsızlık belirtileri göstermediğinden, bazı hastalarda hafif karaciğer ağrısı, yorgunluk ve diğer semptomlar olabilir9. Klinik pratikte, karaciğerin renkli Doppler ultrasonografisi ve gelişmiş bilgisayarlı tomografi incelemesi ile karaciğerde önemli yer kaplayan lezyonlar teşhis edilebilir10. Yayılmamış ve metastaz yapmamış lokal karaciğer kanseri ameliyatla çıkarılabilse de bazı cerrahi riskler ve hastalar için kaçınılmaz psikolojik yük vardır11. Kemoradyoterapi, karaciğer kanseri hücrelerinin tamamını veya bir kısmını öldürebilir ve ilaç kullanan hastalarda uzun süreli immünosupresyon tedavinin etkinliğini etkileyebilir ve diğer hastalıkların riskini artırabilir12. Bu nedenle, erken karaciğer kanserinin önlenmesi ve tedavisi için güvenli ve etkili ilaç tedavisi aramak, karaciğer kanserinin ilerlemesini ve bozulmasını engellemenin anahtarıdır.

Karaciğer kanserini tedavi eden Çin tıbbının prensibi, vücuttaki denge ve uyum kavramına dayanmaktadır. Çin tıbbı, karaciğer kanserini, karaciğeri etkileyen ve Qi olarak bilinen vücut enerjisindeki bir dengesizlik veya uyumsuzluk olarak görür13. Karaciğer kanseri için Çin tıbbı tedavisi, bitkisel ilaç, akupunktur, diyet tedavisi ve yaşam tarzı önerileri dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımları içerir. İlke, Qi'nin dengesini yeniden sağlamak, vücudun savunma mekanizmalarını güçlendirmek ve vücudun kendini iyileştirme yeteneğini teşvik etmektir14,15. Geleneksel Çin tıbbında karaciğer kanseri "timpanitler" ve "karaciğer birikimi" kategorisine aittir. "Huangdi'nin İç Kanonu" semptomlarının ayrıntılı bir kaydına sahip olduğu sürece, karaciğer kanserine kan stazı ve Zhengqi eksikliği neden olur ve kan stazının giderilmesi, timpanitlerin ortadan kaldırılması ve anayasanın sağlamlaştırılması için vücut direncinin güçlendirilmesi ile tedavi edilir13. Sanleng hapı, Yuan hanedanlığında ünlü bir doktor olan Luo Tianyi tarafından yazılan "Weisheng Baojian" kitabından kaynaklanmıştır. Üç çeşit ilaçtan oluşur: Sparganium stoloni erum, Buch. -Jambon. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) ve Rheum officinale Baill. (ravent). Bu üç tür ilaç karaciğer meridyenine girebilir ve karaciğer kanserinin tedavisi için terapötik değere sahip olabilir14. Sanleng Jiashen formülü 16 g Sanleng, 16 g Panax ginseng C.A.Mey'den oluşur. (ginseng), 8 g ravent ve 2 g Chuanxiong (Şekil 1), karaciğeri tonlamak, ısıyı temizlemek, toksinleri ortadan kaldırmak ve kan dolaşımını teşvik etmek için reçete edilir. Bu bitkilerin kanser önleyici özelliklere sahip olduğuna ve tümör büyümesini azaltmaya, semptomları hafifletmeye ve genel refahı iyileştirmeye yardımcı olduğuna inanılmaktadır. Önceki in vitro deneylerde, Sanleng Jiashen formülü karaciğer kanseri hücrelerininçoğalmasını engelleyebilir 15. Bununla birlikte, Çin bitkisel bileşiklerinin karaciğer kanseri üzerindeki inhibitör etkisi verimli ve makul bir şekilde nasıl değerlendirilir? Bir BALB/c-nu fare in situ karaciğer kanseri modeli oluşturularak, Sanleng Jiashen formülünün karaciğer kanseri ve anjiyogenez üzerindeki inhibitör etkisi esas olarak küçük hayvan canlı görüntüleme ve civciv embriyosu koryoallantoik membran testi ile araştırıldı.

Protokol

Spesifik patojen içermeyen, 5 haftalık ve 18-22 g ağırlığındaki BALB/c-nu erkek çıplak fareler, Jilin Üniversitesi Transformasyon Tıp Fakültesi Hayvan Deney Merkezi'nde beslendi; besleme koşulları 22 °C-24 °C ve %40-%60 bağıl nem idi. Deney hayvanı lisans numarası SYXK(Ji) 2018-0006'dır ve deney süreci Jilin Üniversitesi Etik Kurul kural ve düzenlemelerine uygundur ve hayvan etiği onay numarası 20221228-01'dir.

1. Dondurularak kurutulmuş Sanleng Jiashen formülü15'in hazırlanması

  1. 16 g Sanleng, 16 g ginseng, 8 g ravent ve 2 g Chuanxiong'u akıllı bir kaynatma kabına koyun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 294 mL deiyonize suda oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Isıttıktan ve kaynattıktan sonra 100 °C'de 30 dakika pişirmeye devam edin ve sıvıyı çift tıbbi gazlı bezden süzün (bkz. Kalıntıya 252 mL deiyonize su ekleyin, 100 °C'de 30 dakika pişirin ve sıvıyı çift gazlı bezle süzün.
  2. Adım 1.1'deki süzüntüyü temiz bir paslanmaz çelik tabakta toplayın ve -80 °C'de 12 saat dondurun (Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. Adım 1.2'deki Sanleng Jiashen formülünü bir vakumlu dondurarak kurutucuya yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) (soğuk tuzak sıcaklığı: -55 °C) ve Sanleng Jiashen formülünün dondurularak kurutulmuş tozunu elde etmek için 48 saat kurutun.

2. Lusiferazı stabil bir şekilde ifade eden HCCLM3 hücre hattının inşası16

  1. 5 × 105 hücreli 24 oyuklu plakaya (Malzeme Tablosuna bakınız) 1.0 mL HCCLM3 hücre süspansiyonu ekleyin ve tam bir ortamda kültür (% 10 fetal sığır serumu +% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi + DMEM) (bkz. Malzeme Tablosu) bir hücre inkübatöründe 72 saat boyunca 3 μg / mL puromisin içeren (37 ° C,% 5 CO2, Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Adım 2.1'de hücre süpernatantını atın ve hücreleri bir hücre inkübatöründe 1 dakika boyunca sindirmek için 100 μL% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 300 μL tam ortam ekleyin ve yapışan hücreleri serbest bırakmak ve sindirimi sonlandırmak için bir pipet kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını toplayın ve 5 dakika boyunca 1.000 × g'da oda sıcaklığında 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, 1 mL tam ortam ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
  3. Adım 2.2'den 4 × 103 HCCLM3 hücresi/oyuğundan 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakaya ekleyin ve 24 saat boyunca bir hücre inkübatörde kültürleyin (37 ° C,% 5 CO2, Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Adım 2.3'teki 96 oyuklu plakalara 0.27 μL GFP lentivirus ekleyin ve 15 saat boyunca bir hücre inkübatöründe kültürleyin (37 ° C,% 5 CO2, Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre süpernatantını atın, 100 μL tam kültür ortamı ekleyin ve 488 nm uyarma dalga boyunda ve 507 nm emisyon dalga boyunda bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  5. 2 mL GFP lentivirüsünü değiştirin ve 24 saat boyunca kültüre devam edin. 2 mL tam kültür ortamını GFP lentivirüsü olmadan 24 saat daha değiştirin.
    NOT: GFP lentivirüsünün HCCLM3 hücrelerine transfeksiyon verimliliği, ters floresan mikroskobu altında görüldüğü gibi %80 idi.
  6. Adım 2.1'den 5 mL 2 × 105 hücre süspansiyonunu 60 mm'lik bir Petri kabına ekleyin ve 24 saat boyunca bir hücre inkübatörde kültürleyin. 64.5 μL lusiferaz ekleyin ve 15 saat boyunca bir hücre inkübatörde kültüre devam edin (37 ° C,% 5 CO2, Malzeme Tablosuna bakınız).
  7. Süpernatanı atın ve hücreler Petri kabında% 90 birleşene kadar kültüre devam etmek için 5 mL tam ortam ekleyin. Hücre süpernatantını atın, 2 x 1 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri bir hücre inkübatöründe 1 dakika boyunca sindirmek için 1 mL% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 CO2, bkz . 3 mL tam ortam ekleyin ve yapışkan hücreleri serbest bırakmak ve sindirimi sonlandırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Sonraki fare enjeksiyonu için tüm hücre süspansiyonlarını toplayın.
    NOT: Yeterli sayıda hücre elde etmek için, hücreler sürekli olarak geçirildi ve kültürlendi.

3. Karaciğer kanserinin yerinde ve tedavisinde BALB/c-nu çıplak fare modelinin kurulması 15

  1. Adım 2.7'de lusiferaz ile transfekte edilmiş 100 μL 1 × 107 HCCLM3 hücresi ve 100 μL matris yapıştırıcısı (Malzeme Tablosuna bakınız) 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 mL'lik bir pipetle hafifçe karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Matris yapıştırıcısının kürlenmesini önlemek için tüm çözelti hazırlama işlemi buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.
  2. BALB/c-nu çıplak farelerin sol ve sağ koltuk altlarını iyodopin ile dezenfekte edin (bkz. Malzeme Tablosu) ve alkolle deiyodize edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Adım 3.1'den itibaren 100 μL HCCLM3 hücreleri ve matris yapıştırıcı karışımını 1 mL tek kullanımlık şırınga ile BALB / c-nu çıplak farelerin sol ve sağ koltuk altlarına yavaşça enjekte edin.
    NOT: Yaklaşık 10 gün sonra, BALB/c-nu çıplak fareler, bilateral koltuk altı enjeksiyon bölgesinde yaklaşık 0,5cm3'lük bir tümör kitlesi geliştirdi.
  4. Adım 3.3'te BALB / c-nu çıplak fareleri% 1, 50 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile anesteziye tabi tutun. Her iki koltuk altının derisini oftalmik bir makas ve cımbızla kesin (bkz. Malzeme Tablosu) ve deri altı tümör kitlesini nazikçe soyun ve önceden soğutulmuş PBS tamponu içeren bir hücre kültürü kabına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir neşter ile 1 mm3 parçaya kesin (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: BALB / C-NU çıplak farelerin koltuk altı tümör kütlesi, tümör hücresi aktivitesini sürdürmek ve modelin başarı oranını artırmak için 0,5 saat içinde buz üzerinde toplanmalıdır. Örneklemenin sonunda, fareler servikal vertebraların çıkarılmasıyla öldürüldü. Tümörün nekrotik bir kısmı varsa, ortotopik kanser nakli sırasında enfeksiyonu önlemek için sadece balık beyazı tümörü bırakarak çıkarılması gerekir.
  5. BALB/c-nu çıplak fareleri intraperitoneal olarak %1, 50 mg/kg sodyum pentobarbital ile anestezik hale getirin (bkz. Malzeme Tablosu), karnı iyotla dezenfekte edin (bkz. Malzeme Tablosu) ve alkolle deiyodize edin (bkz.
  6. Karaciğeri ortaya çıkarmak için ksifoid işleminin 0,5 cm altında yaklaşık 1 cm uzaklıkta 45°'lik bir cerrahi kesi kesmek için oftalmik bir makas ve cımbız kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız), karaciğer dokusunu sıkmak için karaciğere hafifçe bastırın ve karaciğeri tartı kağıdı ile sabitleyin.
    NOT: Karaciğeri etkili bir şekilde açığa çıkarmak için farelerin kaburgalarının altına pamuklu çubuklar veya çubuklar yerleştirilebilir.
  7. 10 mL'lik tek kullanımlık bir enjeksiyon iğnesi ile adım 3.4'te küçük bir tümör dokusu parçası alın ve tümör kitlesini karaciğer kapsülünün altına sabitlemek için karaciğere yaklaşık 0.5 cm paralel karaciğere implante edin ve iğneyi yavaşça çekin.
    NOT: Erimiş matris yapıştırıcısından 2 damla damlatmak için 1 mL tek kullanımlık bir şırınga kullanın, tümör kitlesini kazara kayma ve kanama olmadan gözlemleyin ve ardından cerrahi insizyonu dikin.
  8. Cerrahi kesiyi 12 cm'lik iğne tutma forseps ve 6-0 cerrahi dikişlerle kapatın (bkz. Malzeme Tablosu). Enfeksiyonu önlemek için cerrahi bölgeye eritromisin göz merhemi (Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Fareleri ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve uyandıktan sonra ayrı kafeslerde saklayın.
  9. Modellemeden sonraki ilk günden başlayarak, günde bir kez 14 gün boyunca 3.8. adımdan itibaren farelere gavaj yoluyla 7.5 mg / kg sorafenib ve Sanleng Jiashen formülünü (7.8 g / kg, 15.6 g / kg ve 31.2 g / kg) uygulayın. Model grubundaki farelere eşit miktarda normal salin uygulayın.

4. İn vivo görüntüleme değerlendirmesi

NOT: 14. günde, uygulamanın bitiminden 1 saat sonra canlı görüntüleme yapıldı.

  1. Bilgisayarı ve in vivo görüntüleme cihazını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Programı başlatmak için masaüstündeki Living Image simgesine çift tıklayın. Tüm IVIS sistemini başlatmak için kontrol panelindeki IVIS sistemini başlat'a tıklayın.
    NOT: Makine kendi kendine testi tamamladıktan sonra, kontrol panelindeki sıcaklık durum ışığı kırmızıdır. Sıcaklık düştükten ve ışık yeşile döndükten sonra yaklaşık 5-10 dakika bekleyin, görüntü alımı gerçekleştirilebilir.
  2. Farelerin karnını alkolle dezenfekte edin ve tek kullanımlık bir şırınga ile vücut ağırlığının g'ı başına 10 μL D-lusiferin intraperitoneal olarak enjekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). % 1, 50 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile fareleri uyuşturun.
    NOT: D-lusiferin, steril PBS ile 15 mg / mL'ye seyreltildi.
  3. Adım 4.3'teki anestezi uygulanmış fareleri gözlem kutusuna koyun ve kapıyı kapatın, kontrol panelinde pozlama süresini 30 s olarak ayarlayın: Mod seçimi: örnek türüne göre parlaklığı seçin, varsayılan olarak otomatik programı seçin ve görüntüleri elde etmek için al'a basın.
  4. Canlı Görüntü Verilerini Kaydet'e tıklayın, Tüm Canlı Görüntü Veri Dosyalarını seçin ve bilgisayarın masaüstüne kaydedin.
  5. Ana ekrandaki Canlı görüntüde Çık'a tıklayın. Sırayla kamera gücünü, görüntüleme aracı gücünü ve bilgisayar gücünü kapatın.
  6. Görüntülemeden sonra, anestezi uygulanmış farelere servikal vertebra çıkığı ile ötenazi yapın (% 1 intraperitoneal enjeksiyon, 50 mg / kg sodyum pentobarbital).

5. Hematoksilen-eozin boyama17

  1. Farelerin taze karaciğer dokusunu 4.7. adımdan itibaren 48 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve ardından paraformaldehiti yıkamak için her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez akan su ile durulayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Adım 5.1'deki karaciğer dokularını sırayla %30 etanol, %50 etanol, %70 etanol, %95 etanol, %95 etanol figure-protocol-10985figure-protocol-11073ve susuz etanol içinde 1 saat boyunca dehidre edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Susuz kalmış karaciğer dokularını 1 saat boyunca şeffaf hale getirmek için sırayla 5.2 ila %50 etanol, %50 ksilen, ksilenfigure-protocol-11384, ksilen figure-protocol-11481ve ksilen figure-protocol-11579 adımına koyun (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Ksilen uçucu ve toksiktir, bu adım çeker ocakta gerçekleştirilir.
  4. Parafin mumunu eritin ve sıcaklığı yaklaşık 55 °C'de tutun. Adım 5.3'teki karaciğer dokusu bloklarını, gömme için balmumu çözeltisi ile doldurulmuş bir parafin gömme makinesine ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
  5. Adım 5.4'te farelerin karaciğer dokusunun gömülü balmumu bloğunu parafin dilimleme makinesinde sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), 5 μm kalınlığında dilimler halinde kesin, dilimleri 50 °C suda tamamen düz bir şekilde yerleştirin ve bir slaytla alın. Son olarak, 70 ° C'de 20 dakika kurutmak için biyolojik bir doku pişirme makinesine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. Adım 5.5'teki 5 μm'lik bölümleri art arda 10 dakika boyunca ksilenfigure-protocol-12538, ksilenfigure-protocol-12634, susuz etanol figure-protocol-12737ve susuz etanole figure-protocol-12842 batırın, ardından sırasıyla %95 etanol, %90 etanol, %80 etanol ve %70 etanol içinde 5 dakika bekletin ve son olarak mum alma işlemi için damıtılmış su ile yıkayın (bkz.
  7. Susuz, 5 μm kalınlığında, pararafin balmumu karaciğer dokusu bölümlerini 8 dakika hematoksilen ile boyayın ve ardından akan su ile durulayın.
  8. % 1 hidroklorik asit çözeltisinde 10 saniye boyunca farklılaştırın ve 30 dakika boyunca akan su ile durulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  9. % 0.5 eozin çözeltisi ile 1 dakika boya (Malzeme Tablosuna bakınız).
  10. Dilimleri kurutmak için her biri 5 dakika boyunca %95 alkol figure-protocol-13602, %95 alkol figure-protocol-13702, susuz etanol figure-protocol-13805, susuz etanol figure-protocol-13908, ksilen figure-protocol-14005ve ksilen figure-protocol-14103 içine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
  11. Nötr sakızla kapatın ve ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında fotoğraf çekin (bkz. Malzeme Tablosu).

6. İmmünohistokimyasal boyama18

  1. Adım 5.6'da fare karaciğerinin 5 μm'lik bölümlerine %1.5H2O2 damlatın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Dokuyu sitrik asit çözeltisi ile 5 dakika onarın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  3. % 0.2 triton X-100 ile oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin, daha sonra% 0.5 triton X-100 ile oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin ve PBS ile yıkayın.
  4. 15 dakika boyunca mühürlemek için keçi serumu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından gece boyunca 4 ° C'de inkübe etmek için PBS (1:300) ile seyreltilmiş ki67 birincil antikorunu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  5. PBS (1:200) ile seyreltilmiş ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın (bkz.
  6. Gelişmekte olan solüsyonla 5 dakika lekeleyin ve çift damıtılmış su ile durulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  7. Hematoksilen ile 2 dakika tekrar boyayın,% 1 hidroklorik asit çözeltisinde 10 saniye ayırt edin ve 30 dakika akan su ile durulayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
  8. Dilimleri kurutmak için her biri 5 dakika boyunca %95 alkol figure-protocol-15880, %95 alkol figure-protocol-15980, susuz etanol figure-protocol-16083, susuz etanol figure-protocol-16186, ksilen figure-protocol-16283ve ksilen figure-protocol-16381 içine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
  9. Nötr sakızla kapatın ve ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında fotoğraf çekin (bkz. Malzeme Tablosu).

7. Civciv embriyosu koryoallantoik membran testi19

  1. Beyaz tüylü tavuk yumurtalarını (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve dezenfekte etmek için alkol püskürtün. Kafatası matkabı ile hava haznesinde bir delik açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve yumurtaları hava haznesi yukarı bakacak şekilde 7 gün kuluçkaya yatırın (Kuluçka sıcaklığı 37.8-38.2 °C ve bağıl nem %65).
    NOT: Kuluçkanın ilk 3 günü boyunca, civciv embriyosu koryoallantoik zarının kabuğa yapışmasını ve sahte bir hava odası oluşturmasını önlemek için otomatik yumurta çevirme düğmesi açılır.
  2. Zayıf/döllenmemiş yumurtaları yumurta aydınlatıcıya atın (Malzeme Tablosuna bakın). Sahte hava odasında bir kafatası matkabıyla bir delik açtıktan sonra (bkz. Malzeme Tablosu) göz cımbızıyla 1 x 1 cm'lik bir pencereyi dikkatlice soyun (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Yumurta kabuğunun civciv embriyosu koryoallantoik zarına düşmemesi gerektiğini lütfen unutmayın.
  3. Kuluçka süresinin 8. gününde, kontrol grubu hariç sahte hava odasından her yumurtaya 100 μL tümör hücresi süspansiyonu (1 × 106 hücre) ekleyin. İlaç gruplarına 100 μL sorafenib çözeltisi ve Sanleng Jiashen formülü ekleyin. Kontrol ve model gruplarında 100 μL PBS ekleyin.
    NOT: Tümör hücresi süspansiyonu, eşit hacimde HCCLM3 hücreleri ve matris yapıştırıcısından oluşur. İlaç konsantrasyonu şu şekilde ayarlanır: 7.5 mg / kg sorafenib ve Sanleng Jiashen formülü (7.8 g / kg, 15.6 g / kg ve 31.2 g / kg).
  4. Pencereyi şeffaf pansumanla örtün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve alkol spreyi ile dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). 7 günlük inkübasyondan sonra, şeffaf pansumanı çıkarın ve 30 dakikalık bir sabitleme için sahte hava odasından 1 mL fiksatif (metanol: aseton = 1: 1) ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
  5. Sabitleyiciyi 1 mL'lik bir şırınga ile atın. Oftalmik makasla sahte hava odasında ~ 5 x 5 cm koryoallantoik membranı kesin ve 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Kanlı civciv embriyo koryoallantoik membran için PBS ile durulayın. Civciv embriyosu için dokuya bağlı koryoallantoik membran, oftalmik makasla ayırın.
  6. Adım 7.5'teki koryoallantoik membranı optik mikroskop altına koyun ve damarların fotoğrafını çekin (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, BALB / c-nu farelerinin yerinde karaciğer kanseri modelini oluşturduk ve Sanleng Jiashen formülünün antitümör etkisini değerlendirdik. Şekil 2B, Sanleng Jiashen formülünün karaciğer tümörlerinin büyümesini önemli ölçüde baskılayabildiğini göstermektedir. Patolojik sonuçlar, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki tümör odaklarının ç...

Tartışmalar

Sanleng Jiashen formülündeki Sanleng, ginseng, ravent ve Chuanxiong'un karaciğer kanseri tedavisi üzerinde farmakolojik etkileri olduğunu çok sayıda kanıt doğrulamıştır. Çalışmalar, Sanleng'in tümör hücresi istilasını ve metastazı önlemek, hücre apoptozunu indüklemek ve hücre döngüsünü ve tümör mikro çevresini düzenlemek için tümör hücrelerinin çoğalmasını ve büyümesini önemli ölçüde engelleyebileceğini göstermiştir20

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Felsefe ve Sosyal Bilimler Vakfı (20VYJ070), Jilin İl Eğitim Departmanı Projesi (JJKH20230963KJ) ve Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Xinglin Scholars Mühendislik Projesi'nin İkinci Partisi (QNKXJ2-2021+ZR25) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin solutionHyClone, AmericaSH30042.01B
1 mL disposable syringeMingankang Medical Equipment Co., Ltd., ChinaRWSB
1% Penicillin & streptomycin solutionHyclone, AmericaSV30010
1.5 mL centrifuge tubeCorning, AmericaMCT-150-C-S
12 cm needle forcepsHesdick, ChinaHKQS-211
6-0 surgical suturesShanghai Jinhuan Medical Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaCR631
75% alcoholSichuan Youbang Enterprise Co., Ltd., Sichuan, China1.00009E+11
96-well platesNEST, China701001
AcetoneTianjin Dingfu Chemical General Plant, Tianjin, ChinaGB686-89
BALB/c-nu male nude miceBeijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSYXK(Ji) 2018-0006
Biological tissue baking machineLeica, GermanyLeica HI1220
Cell culture dishNEST, ChinaNEST.706001
Citric acid solutionWuhan Canos Technology Co., Ltd., Wuhan, Chinasj1074
D-luciferinGold Biotechnology®, Inc., ChinaLUCK-100
DMEMHyclone, AmericaSH30243.01
Egg illuminatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, ChinaWZSDT
Eosin staining solutionHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, China110703061
Erythromycin eye ointment Cisen Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, ChinaH37022025
Fetal bovine serumClark, AmericaFB25015 
Fully automatic intelligent chick incubatorShandong Weizhen Incubation Equipment Company, Shandong, China29538
GFP lentivirus solutionSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaF22AZ
Goat serumShenyang Wanlei Biotechnology Co., Ltd., Shengyang, ChinaWLA067
Hand-held mouse skull drillSTRONGWT, China190
HCCLM3 cell lineWheLab, Shanghai, ChinaC1010
Heating padZhongke Life Technology Co., Ltd., Hangzhou, ChinaGEJRD-10W
HematoxylinHunan BKMAM Biotechnology Co., Ltd., Hunan, ChinaB-YH250-1
Intelligent decoction potHangzhou Jiuyang living Appliance Co., Ltd., Hangzhou, China3003BQ
 Inverted fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73
ki67 primary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB121141-100
Lodophor disinfectantCofoe Medical Technology Co.,Ltd., Hunan, China202110073
LuciferaseSuzhou GenePharma Co.,Ltd., Suzhou, ChinaE26JZ
Matrix glueCorning, America356234
Medical gauzeYunnan Chenye Biotechnology Co., Ltd., Yunnan, China71712049971
MethanolGuangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd., Guangdong, China1.17001.023
Ophthalmic scissorHesdick, ChinaHKQS-209
Ophthalmic tweezerHesdick, ChinaHKCL-20
Paraffin embedding machineLeica, Germany EG1150H
Paraffin slicing machineLeica, GermanyLeica CM1950
ParaformaldehydeBiosharp, ChinaBL539A
PBS bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaG2156-1L
PuromycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP8230
RefrigeratorThermo Scientific, AmericaTDE40086FV-ULTS
ScalpelHesdick, ChinaHKCL-93
Secondary antibodyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, ChinaGB23301
Small animal live imaging systemCaliper Life Sciences, AmericaIVIS Lumina XR
SorafenibShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China284461-73-0 
Transparent dressing3M, America9534HP
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT8200
Vacuum freeze dryer Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chinasz-10N
White feather chicken eggsShandong Haotai Experimental Animal Breeding Co., Ltd., Shandong, ChinaSCXK(Lu) 20180004
XyleneSigma-Aldrich, , America534056

Referanslar

  1. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  2. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics. CA-A Cancer J. Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
  4. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  5. Verslype, C., et al. The management of hepatocellular carcinoma. Current expert opinion and recommendations derived from the 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, 2008. Ann. Oncol. , (2009).
  6. Greten, T. F., et al. Biomarkers for immunotherapy of hepatocellular carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20 (11), 780-798 (2023).
  7. Rimassa, L., Finn, R. S., Sangro, B. Combination immunotherapy for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 79 (2), 506-515 (2023).
  8. Wu, Z. H., et al. A terrylene-anthraquinone dyad as a chromophore for photothermal therapy in the NIR-II window. J. Am. Chem. Soc. 145 (48), 26487-26493 (2023).
  9. Pawlik, T. M. Hepatocellular carcinoma. Sure. Oncol. Clin. N. Am. 33 (1), (2024).
  10. Schwarze, V., et al. Diagnostic value of contrast-enhanced ultrasound versus computed tomography for hepatocellular carcinoma: a retrospective, single-center evaluation of 234 patients. J. Int. Med. Res. 48 (6), 1-10 (2020).
  11. Maki, H., Hasegawa, K. Advances in the surgical treatment of liver cancer. Biosci. Trends. 16 (3), 178-188 (2022).
  12. Pepe, A., et al. Medical radiology: current progress. Diagnostics. 13 (14), 2439 (2023).
  13. Li, Y., Zhang, C. Significance of 'harmonious' thinking in Inner Canon of Huangdi on the prevention and treatment of primary liver cancer. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 28 (02), 305-308 (2013).
  14. Luo, T. . Wishing Baojian (M). , (2019).
  15. Li, Y. . Effect and mechanism of Sanlengjiashen Decoction on hepatocellular carcinoma by JAK2/STAT3 signaling pathway [D]. , (2022).
  16. Wang, P., et al. BTF3 promotes proliferation and glycolysis in hepatocellular carcinoma by regulating GLUT1. Cancer Biol. Ther. 24 (1), 2225884 (2023).
  17. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  18. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 241, 111801 (2019).
  19. Guerrieri, A. N., et al. A novel patient-derived immortalised cell line of myxofibrosarcoma: a tool for preclinical drugs testing and the generation of near-patient models. BMC Cancer. 23 (1), 1194 (2023).
  20. Li, Y., Zhao, J., Zhao, H., Yu, C. Research progress of Sparganium Stoloniferum. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 20 (09), 92-94 (2018).
  21. Kim, T. W., Lee, S. Y., Kim, M., Cheon, C., Ko, S. G. Kaempferol induces autophagic cell death via IRE1-JNK-CHOP pathway and inhibition of G9a in gastric cancer cells. Cell Death Dis. 9 (9), 875 (2018).
  22. Lee, M. J., et al. Kaempferol alleviates mitochondrial damage by reducing mitochondrial reactive oxygen species production in lipopolysaccharide-induced prostate organoids. Foods. 12 (20), 3836 (2023).
  23. Zhang, Q., et al. Molecular docking and in vitro experiments verified that kaempferol induced apoptosis and inhibited human HepG2 cell proliferation by targeting BAX, CDK1, and JUN. Mol. Cell. Biochem. 478 (4), 767-780 (2023).
  24. Kumar, S., et al. Myricetin: a potential plant-derived anticancer bioactive compound-an updated overview. N-S Arch. Pharmacol. 396 (10), 2179-2196 (2023).
  25. Wang, M., et al. Myricetin reverses epithelial-endothelial transition and inhibits vasculogenic mimicry and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by directly targeting PAR1. Phytother. Res. 36 (4), 1807-1821 (2022).
  26. Li, J., Li, F., Jin, D. Ginsenosides are promising medicine for tumor and inflammation: A review. Am. J. Chinese Med. 51 (4), 883-908 (2023).
  27. Guo, X., Hu, N., Sun, G., Li, M., Zhang, P. Shenyi capsule plus chemotherapy versus chemotherapy for non-small cell lung cancer:A systematic review of overlapping meta-analyses. Chinese Journal of Integrative Medicine. 24 (3), 227-231 (2018).
  28. Zhang, R., et al. Network Meta-analysis of oral Chinese patent medicine for adjuvant treatment of primary liver cancer. China Journal of Chinese Materia Medica. 46 (09), 2333-2343 (2021).
  29. Oh, H. M., Cho, C. K., Son, C. G. Experimental evidence for the anti-metastatic action of ginsenoside Rg3: A systematic review. Int. J. Mol. Sci. 23 (16), 9077 (2022).
  30. Nowak-Perlak, M., Ziółkowski, P., Woźniak, M. A promising natural anthraquinones mediated by photodynamic therapy for anti-cancer therapy. Phytomedicine. 119, 155035 (2023).
  31. Bai, J., et al. Emodin, a natural anthraquinone, suppresses liver cancer in vitro and in vivo by regulating VEGFR and miR-34a. Invest. New Drug. 38 (2), 229-245 (2020).
  32. Cheng, G., et al. Cell metabolomics reveals the potential mechanism of aloe emodin and emodin inhibiting breast cancer metastasis. Int. J. Mol. Sci. 23 (22), 13738 (2022).
  33. Wang, X., et al. Inhibition of tetramethylpyrazine on P-gp, MRP2, MRP3 and MRP5 in multidrug resistant human hepatocellular carcinoma cells. Oncol. Rep. 23 (1), 211-215 (2010).
  34. Hu, J., et al. Ultrasonic extraction, antioxidant and anticancer activities of novel polysaccharides from Chuanxiong rhizome. Int. J. Biol. Macromol. 85, 277-284 (2016).
  35. Zhong, C., et al. Physicochemical properties of polysaccharides from Ligusticum chuanxiong and analysis of their anti-tumor potential through immunoregulation. Food Funct. 12 (4), 1719-1731 (2021).
  36. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J. Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

HepatokarsinomBALB c nu FarelerSanleng Jiashen Form lGeleneksel in T bbKaraci er Kanserila Adaylarla Etkinlik De erlendirmesiHistopatolojik BoyamaKanser Belirte leriAnti anjiyogenezMalign ProliferasyonT m r Kitle HacmiKi67 BelirteciTerap tik PotansiyelKaraci er Kanseri Modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır