Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İnvaziv cephede glioma tümör mikroçevresini replike etmek için interstisyel sıvı akışını içeren bir yöntem sunuyoruz. Bu model, bir sıvı basınç başlığının uygulanabileceği bir doku kültürü ekinde bir hyaluronan-kollajen I hidrojeldir. İstila ölçülebilir ve hücreler izole edilebilir veya parçalanabilir.

Özet

Glioblastoma nüksü, tedavi başarısının önünde önemli bir engeldir ve glioma kök hücrelerinin (GSC'ler) cerrahi rezeksiyona erişilemeyen ve mevcut kemoterapilere dirençli sağlıklı dokuya invazyonu ile tetiklenir. Doku düzeyinde sıvı hareketi veya interstisyel sıvı akışı (IFF), GSC invazyonunu tümör mikroçevresine (TME) bağlı bir şekilde düzenler ve hem IFF hem de TME'yi içeren model sistemlere olan ihtiyacı vurgular. Glioblastomda invaziv TME'yi çoğaltmak için erişilebilir bir yöntem sunuyoruz: bir doku kültürü ekinde tohumlanmış insan GSC'leri, astrositler ve mikrogliadan oluşan bir hyaluronan-kollajen I hidrojel. Yükseltilmiş IFF, hidrojele bir sıvı basınç kafası uygulanarak temsil edilebilir. Ek olarak, bu model, hücresel oranlar, akış hızları veya matris sertliklerindeki hastalar arası veya hasta içi farklılıkları çoğaltmak için ayarlanabilir. İstinla ölçülebilirken, jeller GSC invazyonu, akış sitometrisi, protein veya RNA ekstraksiyonu veya görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli sonuçlar için hasat edilebilir.

Giriş

Glioblastoma, klinik olarak mevcut tedavilerle sadece orta derecede uzatılan kısa sağkalım1 ile işaretlenmiş yıkıcı bir hastalıktır 2,3. Etkili tedavinin önündeki bu engel, büyük ölçüde, rezeksiyon ve tohum tekrarlayan tümörler için erişilemeyen kemodirençli glioma kök hücrelerinin (GSC'ler) yüksek derecede infiltratif doğasından kaynaklanmaktadır4. Aynı zamanda, GSC'ler oldukça plastiktir ve hayatta kalmak veistila etmek için tümör mikro ortamındaki (TME) çeşitli uyaranlara yanıt verir 5,6

Protokol

Bu protokol, Virginia Tech Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak geliştirilmiştir.

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürleri bir BSL-2 hücre kültürü kabininde gerçekleştirin. İnsan hücrelerinin kullanımı konusunda rehberlik için lütfen kurumun biyogüvenlik komitesine danışın.

1. Jel hazırlama için hesaplamalar

  1. Deneme için gereken koşul sayısını hesaplayın.
    NOT: Bir "durum", bu örnekte kullanılan sıvı basınç kafası gibi harici olarak uygulanan değişkenlerle değil, çözeltinin içeriğiyle (örneğin, hücre konsantra....

Temsili Sonuçlar

İnvazyon (Şekil 3), canlılık ve akış sitometrisi yoluyla Ki67 ve CD71'in ekspresyonu (Şekil 4) için temsili veriler, daha önce bir tiyo-modifiye hyaluronan-kollajen hidrojel12 için yayınlandığı gibi GSC hatları için sağlanmıştır. TME modelinde astrositlerin ve mikrogliaların varlığı, hücre hattına bağlı olarak GSC invazyonu üzerinde farklı bir etkiye sahiptir (

Tartışmalar

TME modelinin montajı altı temel adımı içerir: 1) hücrelerin geçirilmesi ve hücrelerin benzer koşullar arasında ayrılması, 2) tüm koşullar için konsantre bir kollajen çözeltisinin birleştirilmesi, 3) jel bileşenlerinin birleştirilmesi (hücreler, kollajen, metakrillenmiş hyaluronik asit ve foto başlatıcı) her koşul için 4) kaplama jelleri, 5) UV maruziyeti ve ısı ile çapraz bağlama ve 6) sıvı basınç kafasının eklenmesi. 18 saat veya daha uzun bir süre.......

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma için finansman kaynaklarına teşekkür etmek isteriz: Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü (R37 CA222563 J.M.), Coulter Vakfı (J.M.) ve Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). Bu testte kullanılan GSC'ler Jakub Godlewski, Ph.D. (Harvard Tıp Okulu) tarafından türetilmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Tissue Culture Plate, SterileCelltreat Scientific Products 229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, SterileDOT Scientific667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA Thorlabs M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, SterileCelltreat Scientific Products229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm DiameterMillicellPI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT038181000CSEthanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)ScienCell Research Laboratories1801Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. 
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)Thermo Fisher Scientific12587010
BSA (MACS)Miltenyi Biotec 130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)Fisher Scientific 25-0719-41
Cell Counting Chambered SlidesNexcelom BioscienceCHT4-PD100-002
Cell ScrapersBiologix USA 70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)VWR NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-SpeedEppendorf 5702 RCentrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, CorningFisher Scientific07-200-108V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific50116047
Collagen I, High Concentration, Rat TailCorning354249
Collagen I, Rat TailCorning354236"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)United States BiologicalC7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nmThorlabsCOP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips AmazonB01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7) United States BiologicalD3760
DMEM, high glucose (Gibco)Thermo Fisher Scientific11330032
EVOS FLInvitrogenAMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)Thermo Fisher Scientific26140079For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaHT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)Thermo Fisher Scientific00-5523-00
Glioma stem cellsn/an/aCan be patient derived or commercial glioma stem cell lines. 
Guava easyCyte HT SystemMillipore Sigma0500-4008Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaH6648
HEPES (1 M) (Gibco)Thermo Fisher Scientific15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max ThorlabsDC2200Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific62249
Human AstrocytesScienCell Research Laboratories1800Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERTApplied Biological Materials T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 positionBenchmark Scientific H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibodyMiltenyi Biotec130-120-420
LED UV Curing MeterGigahertz-OptikX1-RCH-116Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Advanced Biomatrix5269-100MG Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificL24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)Advanced Biomatrix5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)Fisher Scientific75-997-203Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)Thermo Fisher Scientific17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)Thermo Fisher Scientific10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & MgQuality Biological119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)VWR 97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)Fisher Scientific SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)Thermo Fisher Scientific25200056
ViaStain AOPI Staining SolutionNexcelom BioscienceCS2-0106

Referanslar

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020. Neuro Oncol. 25, 1-99 (2023).
  2. Stupp, R., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır