Süper Emici Polimer Bazlı Ototrofik Sistemlerde Arbusküler Mikorizal Kültürlerin Aşılanması ve Gözlemlenmesi

Özet

Burada, süper emici polimer bazlı ototrofik sistemlerde arbusküler mikorizal mantarları aşılamak ve gözlemlemek için basit ve ucuz bir tekniği açıklıyoruz.

Özet

Arbusküler mikorizal () mantarların, bitki kökleri ile kalıcı ilişkileri ve rizosferdeki çoğalmaları nedeniyle manipüle edilmesi ve gözlemlenmesi zordur. Tipik olarak, mantarları, bir ototrofik konakçı ile pot kültüründe in vivo koşullar altında veya bir Petri kabında Ri Transfer-DNA'ya dönüştürülmüş kökler (heterotrofik konak) ile in vitro koşullar altında kültürlenir. Ek olarak, saksı kültüründe mantarlarının yetiştirilmesi, opak ve steril olmayan bir ortamda gerçekleşir. Buna karşılık, in vitro kültür, mantarlarının steril, şeffaf bir ortamda çoğaltılmasını içerir. Süper emici polimer bazlı ototrofik sistem (SAP-AS) yakın zamanda geliştirilmiş ve her iki yöntemin avantajlarını kendi sınırlamalarından (opaklık ve heterotrofik konak, sterilite) kaçınarak birleştirdiği gösterilmiştir. Burada, SAP-AS'de kolay hazırlama, tek spor aşılaması ve mantarlarının gözlemlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Petri kaplarını değiştirerek, canlı örnekler üzerinde yüksek çözünürlüklü fotoğraf ve video gözlemleri mümkün oldu, bu da mevcut in vivo ve in vitro tekniklerle zor veya imkansız olurdu.

Giriş

Arbusküler mikorizal () mantarlar (Glomeromycotina), karasal toprakların trakeofitler tarafından kolonizasyonunda önemli bir rol oynamış olabilecek eski bitki kökü simbiyontlarıdır (~ 500 Ma ^1,2). mantarları ve trakeofitler arasındaki bu uzun birlikte evrim, arbusküler mikorizayı krallıklar arası karşılıklılığın bir başyapıtı olarak yerleştirir. mantar hifleri, mikorizal^ağlar 4 yoluyla yeni konakçılara besin taşınması da dahil olmak üzere, konakçının toprak besinlerini³ arama yeteneğini önemli ölçüde artırır. Hif ağı toprak yapısını iyileştirir ve glomalin üretimi toprak erozyonunu azaltabilir⁵. Atmosferik karbonun bir kısmının mantar kökü simbiyotuna aktarılması, toprak karbon tutumunu arttırır⁶. Genel olarak, mantarları hem abiyotik hem de biyotik streslere karşı bitki direncini artırır ve bu nedenle agroekolojide büyük ilgi görmüştür⁷. Nitekim, mantar dostu tarımsal yönetim uygulamaları, sürdürülebilir tarım uygulamalarına geçiş ve iklim değişikliğiyle mücadele ile ilgili ulusal ve uluslararası taahhütlere uymak için çiftçilerin yönetim uygulamalarına entegre etmeleri gereken önemli hedefler olan mahsul üretimi için kimyasal girdilerin kullanımını azaltma ve toprak organik karbon içeriğini iyileştirme potansiyeline sahiptir.

Bununla birlikte, mantarları toprak mikroskobik mantarlarıdır ve zorunlu biyotrofi ve rizosfer dağılımları nedeniyle çalışmaları zordur. Toprak, opaklığı, çok çeşitli nişler ve her ölçekte çoklu trofik etkileşimler nedeniyle incelenmesi en zor biyotoplardan biridir. mantarlarının izolasyonu, yayılması ve karakterizasyonu bu nedenle zordur. 20.^yüzyılın ortalarına kadar, sadece sporokarpları oluşturan mantar türleri karakterize edilmişti⁸. Bununla birlikte, mantar türlerinin çoğu, çapı ~ 20 μm ila ~ 500 μm arasında değişen sporokarpik olmayan sporlar üretir. Toprak ıslak eleme tekniğinin⁹ tanımı, bu mantar türlerini tanımlamanın yolunu açtı ve o zamandan beri tür tanımlama oranı arttı. Bununla birlikte, mantarları, Dikarya'ya kıyasla küçük bir tür grubunu temsil eder.

Tuzak kültürleri, yani sporlarla aşılama veya turface ve vermikülit gibi otoklavlanmış malzeme ile doldurulmuş bir tencerenin mantar sporlarını içeren bir çevresel toprak numunesi ve bir konakçının sterilize edilmiş bir tohumu (pırasa, muz), kontrollü koşullar altında mantarlarını çoğaltmanın bir yoludur¹⁰. Bununla birlikte, aşılamanın başarısı ancak boyamadan sonra kök parçalarında arbusküllerin varlığına bakılarak veya sporları izole etmek için bir alt numunenin veya tüm kabın ıslak elenmesiyle değerlendirilebilir. Genellikle saksı kültürünün analizinden önce en az 6-12 hafta boyunca sistemin rahatsız edilmemesi önerilir. Bu kültür tekniği, bilinen mantar türlerinin çoğunun çoğaltılması için uygundur, ancak mantar simbiyontunun canlı gözlemi mümkün değildir ve özellikle tek spor kültürleri denendiğinde aşılamanın başarısı belirsizdir.

Aksine, mantarlarının in vitro yayılımı, kültür ortamının¹¹ şeffaflığı sayesinde canlı olarak izlenebilir, ancak bu kültür tekniği, steril bir ortamda çalışmak için dönüştürülmüş köklerin mevcudiyetini ve kültür ortamında karbon varlığını gerektirir. Sporlar sterilize edilmelidir ve heterotrofik bir konakçı ile birlikte, bilinen mantar türlerinin çoğu bu teknik kullanılarak başarılı bir şekilde çoğaltılmaz.

Bu nedenle, mantarlarının mevcut teknikler kullanılarak çoğaltılması, çoğu laboratuvarda kurulmuş ve yaygın olarak kullanılmasına rağmen, mantarlarının incelenmesi için bazı sınırlamalara sahiptir. Paré ve ark. (2022)¹² , mantarlarını çoğaltmak için bütün bitkilerle kombinasyon halinde şeffaf bir süper emici polimer (SAP) kullanarak in vivo bir teknik geliştirdi. SAP tabanlı bir ototrofik sistem (SAP-AS) olarak tasarlanan teknik, basit ve ucuzdur ve pot kültürünün (ototrofik bir konakçı ile ilişkilendirme, steril olmayan koşullar) ve in vitro kültürlerin (şeffaf ortam, simbiyoz gelişiminin canlı izlenmesi) avantajlarını birleştirir. Burada, tek spor inokülasyonu ile kültürlerin nasıl kurulacağını ve ekstraradikal miselyumun yüksek büyütmeli gözlemi için SAP-AS'nin nasıl kullanılacağını açıklayan bir protokol sunuyoruz. Spesifik olarak, iki bölmeli Petri kaplarının nasıl değiştirileceğini, besin çözeltisinin nasıl hazırlanacağını, süper emici polimerin (SAP) nasıl hazırlanacağını, fidelerin nasıl hazırlanacağını, SAP-AS'nin nasıl birleştirileceğini ve tek bir sporla nasıl aşılanacağını, sporların nasıl önceden çimleneceğini ve simbiyozun gelişimini canlı olarak nasıl izleyeceğimizi açıklıyoruz.

Protokol

1. İki bölmeli Petri kaplarının modifikasyonu

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Petri kabı kapağını değiştirin.
   1. Döner aleti ve uygun oyma ucunu kullanarak, kapağın üst kısmına iki delik (~7 mm çapında) ve yanda 1 cm'lik bir açıklık açın. Bir delik kök (vermikülit) bölmesini sulamak için, diğeri ise hif (SAP) bölmesini sulamak için kullanılacaktır.
2. Petri kabının altını değiştirin.
   1. Elektrikli döner aleti kullanarak bitki gövdesi için Petri kabının tabanının yan tarafına bir çentik açın. Sıvının boşalmasını önlemek için çentiğin çok derin olmadığından emin olun. Bu çentik, kapaktaki 1 cm'lik açıklıkla hizalanacaktır (adım 1.1).
   2. Çift bölmeli Petri kabının plastik bariyerini naylon ağ filtre membranı ile değiştirmek için, Petri kabının altına kadar 30 mm'lik dikdörtgen bir çentik açmak için elektrikli döner aleti kullanın.
   3. Yüksek çözünürlüklü gözlem için, Petri kabının dibinde ~25 mm çapında dairesel delikler açın. Gereksinimlere bağlı olarak, SAP tarafında tek bir delik (veya birden fazla delik) veya her bölmede bir tane açın. Deliklerin doğrudan kapağın sulama deliklerinin altında delinmediğinden emin olun.
3. Naylon ağ filtre membranını takın.
   1. Naylon örgü filtre membranının parçasını yerine sıkıştırmak için metal kılavuzu ve ataşı kullanın ve plastik bariyere sıkıca bastırın. Membranın üst kısmını plastik bariyerin üst kısmıyla hizalayın. Membranın kılavuzun altından çıkıntı yaptığından emin olun.
   2. Pirografi kitini kullanarak, zarı Petri kabının dibine ve iki bölmeyi ayıran plastik bariyere kadar eritmek ve kapatmak için metal kılavuzun kenarı boyunca kesin.
   3. Metal kılavuz ve ataş hala yerindeyken, fazla naylon ağ filtre membranını cımbızla dikkatlice çıkarın.
   4. Diseksiyon mikroskobu altında, kök dokusunun hif (SAP) bölmesine kök girmesini önlemek için naylon ağ filtre membranının plastiğe düzgün şekilde kapatıldığını doğrulayın.
4. Lameli takın.
   NOT: Lamel, Petri kabının altına yerleştirilmiştir. Bu, daldırma yağının kullanılmasına ve lamellerin temizlenmesine izin verir.
   1. Silikon dolgu macununu dairesel deliklerin kenarı boyunca (Petri kabı tabanının dışına) yerleştirin.
   2. Lameli Petri kabının tabanının dışına yerleştirin ve mükemmel yapışmayı sağlamak için hafifçe bastırın.
   3. Kurumasını bekleyin ve fazla sızdırmazlık maddesini bir tıraş bıçağıyla çıkarın.
5. İnceleyin ve temizleyin.
   1. Petri kabına yapışmış olabilecek toz veya plastik parçalarını temizlemek için bir hava üfleme kullanın.
   2. Herhangi bir kusuru belirlemek ve düzeltmek için diseksiyon mikroskobu altında inceleyin.
      NOT: Petri kaplarında parmak izi kalmaması için eldiven giyin

2. 1 L besin çözeltisi mMS-1'in hazırlanması

1. Stok çözeltileri hazırlayın.
   1. Makro besinler: Aşağıdakileri 1 L damıtılmış suda tartın ve çözün:
      7.31 g MgSO_4·7 H₂O, 0.80 g KNO₃, 0.65 g KCl ve 0.048 g KH₂PO_{4 ,}.
   2. 2.88 g Ca (NO₃) _{ağırlığında2·}4H₂O ve 1 L damıtılmış su içinde çözülür.
   3. 0,80 g NaFeEDTA tartın ve 0,5 L damıtılmış suda çözün.
   4. 0.375 g KI ağırlığında ve 0.5 L damıtılmış suda çözülür.
   5. Mikro besinler
      1. 3 g MnCl_2·100 mL damıtılmış su içinde 4H₂O.
      2. 1.325 g ZnSO'yu_{çözün 4·}100 mL damıtılmış su içinde 7H₂O.
      3. 0.75 g H₃BO_3'ü 100 ml damıtılmış suda çözün.
      4. Çözündüğünde, 2.1.5.1-2.1.5.3 adımlarında hazırlanan çözeltileri karıştırın.
      5. 0.65 g CuSO_{4 ağırlığında·}5H₂O ve 50 mL damıtılmış su içinde çözülür.
      6. 0.12 g Na₂MoO_{4 ·}100 mL damıtılmış suda 2H₂O.
      7. Adım 2.1.5.5'ten 5 mL ve adım 2.1.5.6'dan 1 mL çözeltiyi adım 2.1.5.4'teki çözeltiye ekleyin.
      8. Adım 2.1.5.7'de elde edilen çözeltinin hacmini damıtılmış su ile 500 mL'ye ayarlayın.
2. 1 L mMS-1 ortamı hazırlayın.
   1. 2 L'lik bir cam şişeye 700 mL damıtılmış su ekleyin.
   2. Manyetik bir çubukla sürekli karıştırırken, 100 mL makro besin çözeltisi (adım 2.1.1), 100 mL kalsiyum nitrat çözeltisi (adım 2.1.2), 5 mL ferrik EDTA çözeltisi (adım 2.1.3), 1 mL KI çözeltisi (adım 2.1.4) ve 1 mL mikro besin çözeltisi (adım 2.1.5) ekleyin.
   3. Çözeltinin hacmini 1000 mL'ye ayarlayın.
      NOT: mMS-1, Bécard ve Fortin (1988)^14'ten uyarlanmıştır. SAP-AS steril olmadığı için 121 °C'de 15 dakika sterilizasyon isteğe bağlıdır. SAP'nin güçlü bir tamponlama etkisine sahip olması nedeniyle pH ayarlanmaz ve Paré ve ark. (2022)¹² , SAP üzerindeki koşulların nispeten nötr olduğunu gösterdi (6,7 ila 7,4).

3. SAP'nin Hazırlanması

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. SAP'yi hidrat: 5 g kuru SAP'yi 500 mL mMS-1 besin çözeltisi ile karıştırın (adım 2.2).
2. Oda sıcaklığında (RT) 12 saat (gece boyunca) nemlendirmeye bırakın.
3. Hidratlı SAP tanelerini boşaltın ve toplayın.
   1. 12 oyuklu plakayı (bölüm 7) doldurmak için hidratlı SAP kullanıldığında, hidratlı SAP'yi boşaltmayın ve hidratlı tahılı ve mMS-1 besin çözeltisinin kalanını karıştırmayın.
      NOT: Kuru SAP'nin üç granülometrisi mevcuttur: küçük, orta ve büyük. Orta granülometri (1-2 mm) en uygun olanıdır. Büyük granülometrinin SAP'si sulandırıldığında çok fazla yutar ve Petri kabı kapağı kapatılamazken, küçük granülometri SAP'si aralarında çok az boşluk bırakır, bu da taneler arasındaki mantar yapısının gözlemleri için bir sınırlamadır.

4. Fidelerin hazırlanması

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. P. lanceolata tohumlarını bir Petri kabında mMS-1 besin çözeltisi ile nemlendirilmiş kurutma kağıdına çimlendirin.
2. RT'de karanlıkta kuluçkaya yürün.
3. Kökler en az 2 cm uzunluğunda olana kadar gerektiği kadar rehidre edin.

5. SAP-AS'nin montajı ve yönetimi

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. SAP-AS'yi birleştirin (adım 1 + adım 2 + adım 3 + adım 4)
   1. Fide sapını, kökü içe bakacak ve kotiledonlar/yapraklar ve gövdeler dışa bakacak şekilde Petri kabının yan tarafındaki çentiğe yerleştirin.
   2. Kökleri yaklaşık 1.5-2 g vermikülit ile örtün.
   3. Kök bölmesini 8 mL mMS-1 besin çözeltisi ile nemlendirin. Bu, kökü ve vermiküliti stabilize etmeye yardımcı olacaktır.
   4. Kök bölmesinin yan tarafındaki naylon ağ filtre membranı boyunca 5 g hidratlı SAP ekleyin.
   5. Hif bölmesine 15 g hidratlı SAP ekleyin. Hif bölmesi, Petri kabının alt tarafında çentik olmayan bölmedir.
   6. Petri kabını kapakla kapatmadan önce, kapağın yan çentiklerinin ve Petri kabının alt kısmının, gövdeye zarar vermeyecek şekilde hizalandığından emin olun.
   7. Petri kabını, genç sapı ezmemeye dikkat ederek tabanı ve kapağı birleştiren bir parafin şeridi ile kapatın.
   8. SAP-AS'nin ne zaman yeniden sulandırılması gerektiğini belirlemek için Petri kabının ortalama ağırlığını tartın ve kaydedin.
   9. Alanı optimize etmek için Petri kaplarını istifleyin. Fideler için yan tarafında bir açıklık bulunan opak bir örtü kullanarak Petri kabını karanlıkta tutun.
2. SAP-AS'yi yönetin.
   1. Petri kaplarını sadece mMS-1 besin çözeltisi ile nemlendirin.
   2. Ortalama ağırlığı referans olarak kullanın. Petri kabı 5-6 g hafiflediğinde, orijinal ağırlığına geri getirmek için mMS-1 besin solüsyonu ekleyin. Vermikülit ve SAP'nin susuz kaldığından ancak su basmadığından emin olun. Köklerin oksijene erişimi olmalıdır.
   3. Fide ve mantar ortağı geliştikçe, onları daha sık sulayın. Her iki bölmeyi de aynı anda sulamak gerekli değildir. Sulama gereksinimleri, fide gelişimine göre değişmekle birlikte, aynı zamanda SAP-AS'nin kuluçkaya yatırıldığı çevre koşullarına göre de değişir.
   4. Bitkinin üçten fazla sağlıklı yaprağı varsa, eski yaprakları çıkararak sulama gereksinimlerini azaltın. Ölü yaprakları çıkarın.
      NOT: mMS-1 besin çözeltisinde K⁺, Mg²⁺ ve Ca²⁺ gibi katyonların varlığı, SAP ağının¹³ zaman içinde genişlemesini azaltma eğilimindedir.

6. SAP-AS'nin tek bir sporla aşılanması

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Tek bir sporla aşılayın.
   1. Cam pipeti bir alev mumu veya Bunsen brülörü ile ısıtın. Cam tüpü ayrılana kadar germek için cam eridikçe çekin.
   2. Stereomikroskop altında, iç çapı (tipik olarak 100-300 μm) azaltmak için cam pipetin ucunu kırın. Bu, bireysel sporların manipülasyonunu büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
   3. Petri kabını açın, sporun yerleştirileceği yeri bulun ve bir kökün bir bölümünü ortaya çıkarmak için naylon ağ filtre zarı boyunca 5 g hidratlı SAP arasında bir boşluk bırakın.
   4. Diseksiyon mikroskobu altında, ekstrüde pipet ile bir spor alın. Sporu pipetlemeden önce biraz sıvı pipetleyin. Sporu topladıktan sonra sıvı pipetlemekten kaçının.
   5. Diseksiyon mikroskobu altında, sporu kök üzerine dikkatlice yerleştirin. Sporu pipetlemeden önce pipetlenen sıvı, sporun dışarı atılmasına yardımcı olacaktır. Spor en uygun yerde bırakılmazsa, sporu kökle tekrar temas ettirmek için bir akupunktur iğnesi veya fırça kılı kullanın. Gerekirse, referans için kök üzerinde biriken sporun bir fotoğrafını çekin ve aşılama bölgesini bulmak için bir işaretleyici kullanın.
   6. Kök ve spor için nemli bir mikro ortam sağlamak için SAP'yi kök parçasının üzerine yerleştirin. Kök bölmesini sulamadan önce en az 24 saat bekleyin ve sporu kökten yıkamamaya dikkat edin.
   7. Petri kabını kapakla kapatmadan önce, kapağın yan çentiklerinin ve Petri kabının alt kısmının, fidanın sapına zarar vermeyecek şekilde hizalandığından emin olun.
      NOT: SAP-AS, kökler naylon ağ filtre membranına ulaştığında, ideal olarak sulamadan birkaç gün sonra aşılamaya hazırdır, bu nedenle serbest sıvı yoktur.

7. SAP'de spor çimlenmesi (isteğe bağlı)

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Sporların çimlenmesi.
   1. Pürüzsüz bir doku elde etmek için hidratlanmış SAP'yi karıştırın (bkz. adım 3.3.1). Hava kabarcıkları genellikle 24 saat içinde veya harmanlanmış SAP'nin otoklavlanmasıyla (isteğe bağlı) kaybolur.
   2. İğnesiz 20 mL'lik bir şırınga kullanarak, 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 2 g (2 mL'ye eşdeğer) harmanlanmış SAP pipetleyin.
   3. Diseksiyon mikroskobu altında bir spor seçin ve bölüm 6'da açıklandığı gibi ekstrüde pipeti kullanın.
   4. Diseksiyon mikroskobu altında, her kuyucuğun ortasına bir spor yerleştirin.
   5. 12 oyuklu plakayı karanlıkta RT'de inkübe edin ve çimlenmeyi periyodik olarak izleyin.
   6. Diseksiyon mikroskobu altında, büyüyen bir hifa (en az birkaç milimetre uzunluğunda) olan bir spor seçin.
   7. Kuyuya 1 mL mMS-1 besin çözeltisi ekleyin ve ortamın daha akışkan hale gelmesi için birkaç dakika bekleyin.
   8. Gerekirse, sporu ve hifleri alt tabakadan nazikçe çıkarmak için akupunktur iğnesini kullanın.
   9. Sporu ve hifleri köklere yapıştırmak için bir pipetle veya bir fidanın köklerini ortamın yüzeyine getirerek toplayın. Ardından, fideyi adım 5.1.3'te açıklandığı gibi Petri kabına yerleştirin.
      NOT: Spor çimlenmesini ve fide büyümesini koordine edin. Bu yöntem sadece R. irregularis sporları ile test edilmiştir.

8. Simbiyoz gelişiminin canlı izlenmesi

NOT: Bu adım için gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Rutin olarak diseksiyon, dik veya ters mikroskopla gözlemleyin.
   1. Beyaz aydınlatmalı ve karanlık alanlı bir diseksiyon mikroskobu kullanarak her bölmenin üstünü 20x – 40x'te gözlemleyin.
   2. Ters çevrilmiş bir mikroskop mevcut değilse, Petri kabını ters çevirerek her bölmenin altını diseksiyon veya dik mikroskopla gözlemleyin. Petri kabını ters çevirmeden önce, SAP-AS'ın Petri kabının dibine hafifçe yapışması için 2 gün kurumasını bekleyin.
   3. Petri kabının altından 40x'te ve lamel boyunca 100x'e kadar (yağa daldırma) ayrıntılı gözlemler yapın.
2. Sporları ve hif ağlarını gözlemleyin.
   NOT: SAP tanelerinin içinde gelişen mantar yapıları lekelenebilir.
   1. Vierheilig ve ark. (1998)¹⁵. Isıtmayın.
   2. Hif ve sporlar içeren bir SAP tanesini çıkarın ve RT'deki mürekkebe yerleştirin. Mürekkep SAP tanesine nüfuz edecek ve hifleri ve sporları birkaç dakika içinde lekeleyecektir.
   3. SAP tanesini çıkarın ve mMS-1 besin çözeltisine veya musluk suyuna koyun. Mürekkep 12 saat içinde tahıldan çıkacak, ancak sporlar ve hifler lekeli kalacaktır.
   4. Fotoğraf ve spor sayımı için düzleştirmek için SAP tanesini iki mikroskop lamı arasına bastırın.
3. Arbuscules'i gözlemleyin.
   1. Vierheilig ve ark. (1998)^15'e göre kök bölmesinden birkaç kök çıkarın ve mürekkep ve sirke protokolünü kullanarak boyayın. Kökleri 2-3 dakikadan fazla KOH çözeltisine batırmamaya dikkat edin; Aksi takdirde, kökler sonraki adımlar için çok kırılgan hale gelecek ve kullanılamaz döküntülere parçalanacaktır.
   2. Diseksiyon mikroskobu altında, arbuskül içerebilecek yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir kök parçası seçin ve bir damla su içinde bir slayt üzerine yerleştirin.
   3. Akupunktur iğneleri veya çok ince cımbız kullanarak, kökleri birkaç hücre kalınlığında katmanlar halinde yırtın.
   4. Suyu emdirin ve mikroskop altında arbusküllü segmentlerin hala mevcut ve tatmin edici kalitede olduğunu ve lam üzerine doğru şekilde yerleştirildiğini kontrol edin. Bu noktada, arbusküllerin kök hücre katmanları içinde kolayca görülebilmesi gerekir.
   5. Kök katmanlarının slayta yapışması için 2-3 dakika kurumaya bırakın. Bir damla polivinil alkol-laktik asitgliserol (PVLG) tamponu ekleyin ve lamel ekleyin. Standart mikroskopi yöntemleriyle gözlemleyin.

Tartışmalar

Aşılama, protokoldeki en kritik adımdır ve ekstrüde cam Pasteur pipetleri, bütünlüklerini korurken mantarlarının tek sporlarını doğru bir şekilde manipüle etmek için mükemmel bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Ekstrüde cam Pasteur pipetleri, bir mum veya Bunsen brülörünün alevi kullanılarak kolayca şekillendirilebilir ve açıklık, pipetlenen sporun boyutuna uyacak şekilde stereomikroskop altında ayarlanabilir. Sporları, mantar sporunun boyutuna uyarlanmış aletlerle manipüle etmek (Ek Şekil 1) ve konakçı bitki kökleri, sporun biriktiği Nitex zarına ulaşacak kadar uzun olduğunda SAP-AS'yi aşılamak önemlidir.

SAP-AS'nin deney gereksinimlerine uyarlanması kolaydır. Daha büyük Petri kapları, çok bölmeli, örneğin, yakın akraba suşlar arasındaki veya farklı AMF türleri arasındaki etkileşimi izlemek veya kimyasal (pH) veya biyolojik ortamı (nematodların, bakterilerin, mantarların eklenmesi) değiştirmek için kullanılabilir. mantarlarına fotosentezler sağlamak için çeşitli mikotrofik konakçı bitkiler de kullanılabilir. Besin çözeltisi mMS-1, Bécard ve Fortin (1988)¹⁵ tarafından açıklanan minimum (M) orta tariften türetilmiştir ve karbon kaynaklarını sınırlamak için sükroz, vitaminler ve bacto agar çıkarılmıştır. Bununla birlikte, SAP-AS, deney hedeflerine bağlı olarak çeşitli besin çözeltileri ile desteklenebilir.

mantarlarının SAP-AS'de çoğaltılması düzenli sulama gerektirir. Sınırlı miktarda vermikülit ve SAP, kökleri ve mantarını, özellikle standart iki bölmeli Petri kaplarında (10 cm çapında) nem dalgalanmalarına maruz bırakır. SAP tanelerinin genişleme yeteneği ve dolayısıyla şeffaflığı zamanla azalır. Aslında, besin çözeltisinden katyonların varlığı, akrilat ağının genişlemesini aşamalı olarak sınırlar ve aylar sonra SAP'nin değiştirilmesini gerektirir. Ek olarak, Petri kapları ışıktan veya aşırı sudan uygun şekilde korunmazsa yeşil algler ve küf zamanla büyüyebilir.

Bugüne kadar, saksı kültürlerinde çoğaltılabilen mantar türlerinin sayısının çok altında olan SAP-AS'de yedi mantar türü başarıyla yetiştirilmiştir. Bununla birlikte, SAP-AS'deki hem biyotik hem de abiyotik koşullar, saksı kültürlerindekilere çok benzer ve diğer mantar türlerinin SAP-AS'de çoğalabilmesi muhtemeldir. SAP-AS'de sporların doğrudan aşılanması, aşılama için steril olmayan sporlar/tohumlar kullanılıyorsa, kök eksüdalarının ve/veya bakterilerin varlığına bağlı olarak muhtemelen doğal bir toprakta rizosferinkine daha yakın çevresel koşullar sağlar. Bu, çimlenmiş sporlarla aşılamaya tercih edilmelidir. Ek olarak, AMF içinde spor çimlenmesini tetikleyen koşullar hala tam olarak anlaşılamamıştır, bu nedenle mMS-1 besin çözeltisi ile hidratlı SAP, diğer mantar türlerinin sporlarını çimlendirmek için uyarlanamayabilir. mMS-1 besin çözeltisi ile hidratlanmış SAP üzerindeki spor çimlenmesi, sadece R. irregularis inoculum kullanılarak aşılama adımı için canlı sporları spesifik olarak seçmek üzere test edildi.

simbiyozunun gelişiminin aşılanması ve izlenmesi SAP-AS'de kolayca gerçekleştirilir. Modifiye edilmiş iki bölmeli Petri kapları, farklı mantar türlerinin yetiştirilmesine izin verir. Paré ve ^ark.12 , altı cins ve üç aileden yedi farklı AMF türünü çoğaltmıştır. İki bölmeli Petri kaplarının modifikasyonu, ucuz aletlerle kolayca yapılır. SAP-AS'yi hazırlamak ve sürdürmek için gereken malzemelerin (vermikülit, SAP, Pasteur pipeti vb.) ve reaktiflerin (mMS-1) maliyeti ve miktarı sınırlıdır, bu da çok sayıda SAP-AS'nin minimum maliyetle yönetilmesine olanak tanır. SAP-AS'yi istifleme yeteneği, saksı kültürlerine kıyasla mantar kültürlerinin ayak izini de önemli ölçüde azaltır. Örneğin, 50 SAP-AS (onlu 5 yığın) 1 m uzunluğundaki bir rafa sığabilir (Ek Şekil 2). Bu özellikler, SAP-AS'ı lise laboratuvar derslerinde veya üniversitelerde lisans düzeyinde simbiyoz öğretimi ile uyumlu basit ve ucuz bir teknik haline getirir. Kolonize SAP taneleri, yeni SAP-AS veya saksı kültürlerini aşılamak için kullanılabilir.

Petri kabının tabanının arkasında bir lamel bulunması, ekstraradikal mantar yapılarının yüksek çözünürlüklü fotoğrafına ve videosuna izin verir. Sitoplazmik akış, doğal koşullara çok yakın yaşam koşullarında kolayca incelenebilir. Bu, mantarlarının miselleri (besinler, su taşımacılığı, toprak yapısı vb.) ile ilgili işlevleri ve hif morfogenezi çalışmaları için büyük önem taşımaktadır.

AMF biyolojik döngülerini bitki köklerinde ve rizosfer içinde tamamlar. Toprak mikroorganizmalarının incelenmesi, toprak ortamını gözlemlemenin doğasında var olan zorluk nedeniyle karmaşıktır. SAP-AS'ın temel amacı, mantarlarının gelişimini ayrıntılı olarak gözlemleme yeteneğini korurken, mantarlarının yayılması için rizosfere mümkün olduğunca benzer bir ortamı yeniden yaratmaktır. Bu, steril olmayan koşullar anlamına geldiğinden, saprotrofik mikroorganizmaların çoğalmasını önlemek için mevcut karbon miktarı sınırlandırılmalıdır. mantarlarının rizosferdeki davranışlarına ilişkin bilgi hala son derece sınırlıdır ve SAP-AS, türler arasında radikal dışı ortamda yiyecek arama yetenekleri, spor üretimleri ve kök kolonizasyonları ile ilgili ayrıntılı karşılaştırmalar yapma imkanı sunar. Bu, bakteriler, nematodlar, protistler ve kök mantar patojenleri gibi diğer toprak türleri ile etkileşimler eklenerek daha da karmaşık hale gelebilir ve SAP-AS sayesinde toprak mikrobiyota etkileşimleri bilgisi geliştirilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 x 15 mm Stackable Bi-Plate	Kord Valmark	1204U09	https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate	Greiner Bio-one	665180	https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm round glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL Syringe PP/PE without needle	Millipore Sigma	Z683620-100EA	https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium= cpc&utm_campaign=20674735406 &utm_content=157607444391&gc lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11 vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1 -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B oL7saAmFoEALw_wcB
Acupuncture needle	Lierre	A143-LP1-3075	https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad _source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4 g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB& utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_ 5213169090694_35001500991622 &utm_medium=cpc&utm_source= google&variant=35001500991622
Blotting paper	FLINN	FB0678	https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender	kitchenaid	KHBV53DG	https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html
Dremel 199 Carving Bit	Dremel	2615000199	https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm	HORTA-SORB MD	00810085242789	https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles	Fisher Scientific	08-916-5B	https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glass Pasteur pipettes 230 mm	Kimble	RK-25554-14	https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
Ink	Sheaffer	94321	https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in	Mastercraft	#049-7335-8	https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
Microscopy glass slide	Fisher Scientific	12-552-5	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon mesh filter screen	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX30-108	https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r& variant=6945749106731
Paper clip	Makanu	‎Clips-BK-41mm-24	https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
Parafilm	Avantor/vwr	470201-930	https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata seeds	ecoumene	NA	https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG).	NA	NA	https://invam.ku.edu/recipes
Pyrography kit with fine tip	Walnut Hollow	483103	https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Silicone sealant	Aqueon	100165003	https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Surgeon scalpel handle	Fisher Scientific	22-079657	https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Two Speed Rotary Tool Kit	Dremel	200-1/21	https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
Vermiculite	PRO-MIX	4981110	https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm)	Fisher Scientific	12164692	https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692