Sıçanlarda Femur Başının Steroid ile İndüklenen Osteonekrozunun Gerilimsiz Ağırlık Taşıma Modeli

Özet

Protokol, elastik terapötik bant kullanarak femur başının steroid kaynaklı osteonekrozu için basit ve uygun maliyetli bir sıçan ağırlık taşıma eğitim modeli oluşturmayı göstermektedir.

Özet

İnsanlardan farklı olarak, sıçanlar dört ayak üzerinde yürüyen hayvanlardır, insanlar ise ayakta duran iki ayaklı hayvanlardır ve yürürken ve ayakta dururken kalçalar muazzam bir baskıya maruz kalır. Sıçan steroidinin neden olduğu femur başı nekrozu modellerinde, daha yüksek basınç altında insan kalçasının biyomekanik özelliklerinin sıklıkla simüle edilmesi gerekir. Bazı bilim adamları, farelerin belirli bir ağırlık taşımasını sağlayarak insan kalça basıncının durumunu taklit etmeye çalışırlar, ancak ağırlık taşıyan nesneyi fareye sabitlemek zordur. Sıçanlar immobilizasyondan kolayca kurtulabilir ve ağırlığı sıçanların üzerine yapışkan bantla yapıştırmak, sıçanların bağırsak tıkanıklığından boğulmasına veya ölmesine neden olur. Araştırma grubumuz, sıçanlarda ağırlık taşıyan nesnelerin gerilimsiz immobilizasyonunu gerçekleştirmek için elastik terapötik bant kullandı, böylece sıçanlar serbestçe nefes alabilir ve ağırlık taşıma koşulları altında immobilizasyondan kopamazlar. Her zamanki steroid kaynaklı femur başı nekrozu sıçan modeliyle karşılaştırıldığında, bu ağırlık taşıyan müdahalenin sıçanlarda femur başı nekrozunun ilerlemesini şiddetlendirebileceğini bulduk.

Giriş

Glukokortikoidlerin uygulanması, femur başının travmatik olmayan osteonekrozu (ONFH) için en yaygın risk ^{faktörüdür1}. Çok sayıda kanıt, glukokortikoidlere ek olarak, hastalarda kalça eklemi üzerindeki basınç yükünün de ONFH oluşumu ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Vücut ağırlığı ve fiziksel doğum yoğunluğu gibi faktörler ONFH² için risk faktörleri olarak kabul edilmektedir. Çok sayıda klinik çalışma, kalça eklemi yükleme koşulları ile eklem replasmanının zamanlaması ve insidansı arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermiştir 3,4,5,6. Bu nedenle, yük taşıma ile femur başının steroide bağlı osteonekrozu (SONFH) arasındaki ilişkiyi yansıtan bir model oluşturmak, bu durumun kapsamlı bir şekilde araştırılması için önemlidir.

Devekuşları ve emus gibi büyük iki ayaklı kuşlar, insan bacak yüklerine benzeyen kalça eklemi stresini simüle etmek için iyi modeller olarak hizmet eder ^7,8. Bununla birlikte, büyük kuş türlerinin bakımı zordur ve ilgili araştırma maliyetleri yüksektir. Spontan hipertansif sıçan modelleri ^9,10 daha yüksek ONFH oranları sergileyebilir, ancak spontan hipertansiyon tarafından oluşturulan kemik iliğindeki kompartman basınç yükü mekanik basınçtan önemli ölçüde farklıdır ve mekanik basıncın SONFH üzerindeki etkisini incelemek için uygun değildir.

Küçük hayvan modelleri, SONFH ile ilgili araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, dört ayaklı sürüngenler daha düşük kalça eklemi stresine sahiptir ve kalça modelleri, iki ayaklı yürüyüş sırasında insan kalça eklemlerinin biyomekanik ortamını simüle edemez. Tek uzuv immobilizasyon modelleri¹¹ ve kısmi boşaltma modelleri¹² yaygındır, ancak her ikisi de uzuv yükünü azaltır. İnsanlar ayakta dururken ve yürürken önemli alt ekstremite yüklerine sahip iki ayaklı organizmalar olduğundan, bu modellerdeki yükün azaltılması, hayvan modelleri ile insan hastalıkları arasındaki bağlantıyı azaltır.

Bu çalışma, sıçanlarda ağırlık taşıma eğitiminin femur başının steroid ile indüklenen osteonekrozu üzerindeki etkisini araştırmak için ağırlık taşıma eğitimi için basit ve maliyet etkin bir model oluşturmayı amaçlamaktadır. Şu anda, femur başının steroid kaynaklı osteonekrozunu incelemek için sıçan modelleri kullanılmıştır^13,14, ancak yine de nispeten basit ve ucuz olan, harekette minimum bozulma ile uzun süreli, güvenli fiksasyon sağlayabilen bir model yoktur. Bu çalışmada, sıçanların hareketliliğini koruyan ve yanlış fiksasyonun neden olduğu ıstırabı ve hatta ölümü azaltan, gerilimsiz fiksasyonu benimseyen yüksek yapışkanlı bir fiksasyon materyali uygulanmıştır.

Protokol

Protokol, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen etik yönergelere, Protokol numarası BUCM-4-2022062001-2109'a uygundur. Protokol, 8-10 haftalık ve 200 g-250 g ağırlığındaki Sprague Dawley (SD) sıçanlarını (SCXK(Jing)2019-0008) kullanır.

1. Adaptasyon eğitimi

1. Albino sıçanlar genellikle 60 cm'den daha az bir görüş aralığına sahiptir¹⁵. Modelleme işlemi sırasında, sıçanları opak kafeslere yerleştirin ve travmatik stres yaşamalarını önlemek için modellenmemiş sıçanlardan mümkün olduğunca uzak tutun (en azından, diğer sıçanlar modellenen sıçanların maksimum görüş aralığının dışında olmalıdır).
2. Gücü açın ve koşu bandını 10° eğimle 0 m/dk'ya ayarlayın. Fareleri koşu bandına yerleştirin ve stresi önlemek için hareketlerin mümkün olduğunca yumuşak olduğundan emin olun. Ek stimülasyon kullanmayın; Sıçanlar, çevreye aşina olmadıkları için doğal olarak ileri doğru sürünürler.
3. Eğitim 15 dk sürmektedir. Eğitimden sonra, farelerin bıraktığı dışkı ve idrarı temizleyin ve hayvan kokusunu gidermek için alkol püskürtün. Ardından, bir sonraki fareyi eğitim için hazırlayın.
   NOT: Bir sıçan koşu bandında 5 dakika yürümeyi reddederse, onu çalışmadan çıkarın.
4. 1^{. haftanın sonuna} kadar adaptif eğitime devam edin.

2. Sıçanlarda maksimum ağırlık taşıma kapasitesinin ölçülmesi

1. Yaklaşık 80 cm uzunluğunda iki test tüpü, bir kanca ve bir halka tutturucu hazırlayın. Test tüplerinin, kancanın ve halka tutturucunun ilk toplam ağırlığının 150 g olduğundan emin olarak çelik bilyeleri test tüplerine yerleştirin. Maksimum ağırlığı 350 g olacak şekilde 10 g'lık artışlarla farklı toplam ağırlıklara sahip test tüpleri hazırlayın.
2. Bir araştırmacı, fareleri eldiven kullanarak sabitlemek için iki elini de kullanır (Şekil 1). Başka bir araştırmacı, test tüpünü farenin sırtına, sırtın orta hattından yaklaşık 1 cm uzağa yerleştirir. Bu adım sıçanın hareketini gerektirmediğinden, tüpü sabitlemek için ek önlemler kullanmadan cırt cırtlı tutturucuyu sıçanın etrafına sararak sabitleme işlemini gerçekleştirin.
3. Sıçanın maksimum ağırlığına ulaşılana kadar tüpü değiştirin. Sıçan maksimum ağırlık taşıma kapasitesine ulaştığında, dürtüldüğünde veya deneyci ayrıldığında ayakta duramaz. Sıçanın ayakta durmasını sağlamak için ağırlığı 10 g azaltın. Bu ağırlık, sıçanın maksimum ağırlık taşıma kapasitesini temsil eder.

3. Ağırlık yükünün hazırlanması

1. Eğitim sırasında güvenli fiksasyon gerektiğinden, nesneleri sıçan boyutuna göre güçlü yapışma özelliğine sahip 1-1,5 m elastik terapötik bant kullanarak sabitleyin. Yükün sallanmasını azaltmak için test tüplerinin ağırlığını ayarlamak için kil kullanın.
2. Test tüplerinin ve sabitleme nesnelerinin ağırlığını tarttıktan sonra, hedef ağırlığa ayarlamak için test tüplerine uygun miktarda kil ekleyin. Kili test tüplerinin içine eşit şekilde yaymak için bir cam karıştırma çubuğu kullanın. Test tüpünün bir ucunda yoğunlaşan kil, antrenman sırasında kolayca ayrılmasına neden olabilir.
3. Ayarlanan test tüplerinin ve kilin toplam ağırlığını, farenin maksimum ağırlık taşıma kapasitesinin %50'sine ayarlayın (Şekil 1A). Bu ağırlığın aşılması, farenin eğitimi tamamlamasını zorlaştıracaktır. Deneyin sonuna kadar yükün ağırlığını tekrar ayarlamayın.

4. Femur başı modelinin steroid kaynaklı osteonekrozunun kurulması

1. SONFH model kurulumu için lipopolisakkarit (LPS+MPS) yöntemi ile kombine metilprednizolon kullanın^16,17. Toplam 2 enjeksiyon için her 24 saatte bir sıçanın karnının orta hattında standart bir iğne kullanarak LPS'nin (20 μg / kg) intraperitoneal enjeksiyonunu gerçekleştirin.
2. Son LPS enjeksiyonundan sonra, düzenli beslenmeden 24 saat sonra tek taraflı gluteal kas içine MPS (40 mg / kg) enjekte edin ve toplam üç enjeksiyon için iki gluteal alan arasında dönüşümlü olarak her 24 saatte bir enjeksiyonlara devam edin.

5. Elastik terapötik bant ve koşu bandı eğitimi kullanarak gerilimsiz ağırlık taşıyan immobilizasyon

1. Sıçanın sırt orta hattını her iki tarafta 1-2 cm'de işaretleyin; Bu, ağırlık yükü için referans noktasıdır. Koşu bandı antrenmanı sırasında farenin devrilmesini veya hareketini engellemesini önlemek için işaretlerin uygun şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
2. Bir araştırmacı fareyi eldiven kullanarak sabitlerken, ön ayağı ve çeneyi sabitlemek için bir elinizi farenin koltuk altına yerleştirin, diğer eliniz ise arka bacakları ve kuyruğu sabitler. Stresi veya boğulmayı önlemek için aşırı kuvvetten kaçının (Şekil 1B).
3. Elastik terapötik bandı, farenin sırtındaki yükü sabitlemek için gerginlik uygulamadan test tüpüne yapıştırın. Sarma sürecinde, gerilimsiz sabitleme elde etmek için elastik terapötik bandı germeyin.
   NOT: Bu modelde kullanılan elastik terapötik bant, yoğun fiziksel aktiviteler sırasında bantlama için tasarlanmıştır ve yüksek yapışma ve elastikiyet^{sağlar 18}. Yüksek elastikiyeti nedeniyle, sürünürken farenin hareketi üzerindeki etkiyi büyük ölçüde azaltır.
4. İkinci araştırmacıdan, test tüpünü farenin sırtına, farenin omurgasına paralel olarak, yapılan işaretlere dayanarak, yani farenin sırtının her iki tarafında orta hattan 1-2 cm uzakta olacak şekilde sabitlemesini isteyin.
5. Sıçanın acısını en aza indirmek, sıçanın hareketi üzerindeki etkiyi azaltmak ve fiksasyondan kaynaklanan mortaliteyi azaltmak için, gerginlik uygulamadan fiksasyon yapın. Test tüpünü ayarlanmış ağırlıkla elastik terapötik bant üzerine yapıştırın, ardından test tüpünü gerilimsiz bir teknik kullanarak farenin vücudunun etrafına sarın.
6. Sıçan solunumu ve hareketi üzerinde herhangi bir olumsuz etkiyi önlemek için gerilimsiz immobilizasyonu sağlayın ve elastik terapötik bandın orijinal uzunluğunu gerilmeden koruyun (Şekil 1C).
7. Test tüpünü farenin vücudunun etrafına sardıktan sonra, fareyi açık bir alana veya tek bir kafese yerleştirin, solunumunu ve yönünü izleyin. Hızlı nefes alma veya ağız açma belirtileri ortaya çıkarsa, boğulmayı önlemek için fareyi derhal serbest bırakın.
   1. İdeal immobilizasyon, sıçanın serbestçe hareket etmesine ve içme, ön ayakları kaldırma ve beslenme gibi aktiviteleri gerçekleştirmesine izin verir (Şekil 1D). İmmobilizasyon tatmin edici değilse, tekrarlanan immobilizasyon uyaranları nedeniyle sıçan üzerindeki stresi en aza indirmek için geçici olarak serbest bırakın ve 20 dakika sonra tekrar immobilize edin.
8. Gücü açın ve koşu bandını 1° eğimle 0 m/dk'ya ayarlayın. Koşu bandı antrenman süresi 30 dakikadır. Fareyi yavaşça koşu bandına aktarın ve zamanlayıcıyı başlatın.
9. Sıçana ek stimülasyon sağlamayın. Sıçan 30 dakikalık eğitimi tamamlayamazsa, fiksasyonu çıkarmadan 10 dakikalık bir dinlenme için bir kafese koyun.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan elastik terapötik bant mükemmel gerilebilirliğe ve yapışkanlığa sahiptir. Gerginlik olmadan düzgün bir şekilde sabitlendiğinde, uzun süreli fiksasyon, test tüpünün ayrılmasına veya farenin boğulmasına ve ölümüne neden olmaz.
10. Eğitimden sonra, farelerin bıraktığı dışkı ve idrarı temizleyin ve hayvan kokusunu gidermek için alkol püskürtün.
11. Yukarıdaki adımların diğer fareler tarafından görülmesini önleyin ve hayvanların ses çıkarmasını önlemek için hayvanları mümkün olduğunca nazikçe tutun, böylece diğer farelerde travmatik strese neden olun.
12. Eğitimi tamamladıktan sonra fareyi hemen fiksasyondan serbest bırakın (Şekil 1E). Serbest bırakma sırasında, farenin kürkünü korumak için parmaklarınızı kullanarak kürkü koruyun ve serbest bırakma sırasında kürk kaybını en aza indirin (Şekil 1F).

6. Hayvan gruplaması

1. Ağırlık taşıma eğitiminin SONFH üzerindeki etkisini incelemek için, 60 sıçanı rastgele dört gruba ayırın.
2. Kontrol grubunda, femur başı (SONFH) modelinin ortak steroid kaynaklı osteonekrozunu belirlemeyin veya ağırlık taşıma eğitimi yapmayın. Kontrol + Yük grubunda, femur başı modelinin steroid kaynaklı osteonekrozunu oluşturmadan sadece ağırlık taşıma eğitimi yapın. Model grubunda, sadece femur başı modelinin steroid kaynaklı osteonekrozunu oluşturun. Model+Yük grubunda, femur başı modelinin steroide bağlı osteonekrozunu belirledikten sonra ağırlık taşıma eğitimi yapın.

7. Ötenazi ve örnek toplama

1. Fareleri küçük bir hayvan ötenazi odasına yerleştirin ve% 5'ten daha yüksek bir konsantrasyon elde etmek için yeterli miktarda karbondioksit enjekte edin. Sıçanlar bilincini kaybettikten sonra, intrakardiyak enjeksiyon yoluyla toplam 20 mL'lik bir potasyum klorür çözeltisinin% 20'lik vücut ağırlığının 0.3 mL / kg'lık bir dozunu uygulayın.
2. Ötenazi sırasında herhangi bir ağrı veya rahatsızlık yaşamadıklarından emin olmak için farelerin solunumunu ve kalp atışını izleyin. Solunum ve kalp atışı olmadığını kontrol ederek ölümü onaylayın. Herhangi bir kokuyu temizlemek için alkol püskürtün.
3. Ötenazi sonrası, farenin kalça bölgesini inceleyin ve uyluk kemiğini sağlam tutarken femur başını çıkarın. Ön tedaviyi takiben bir mikroCT taraması yapın, ardından Hematoksilen-Eozin (HE) boyaması yapın.

8. Hematoksilen-Eozin boyama

1. Modelleme tamamlandıktan sonra, farelere ötenazi yapın. HE boyama için femurları çıkarın.
2. Biyolojik dokuları örnek olarak korumak için sıçan uyluk kemiğini 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde bekletin. Sıçan uyluk kemiği örneklerini 5 gün boyunca dekalsifikasyon için% 5 formik asit içinde bekletin.
3. HE boyama için numuneleri 5 μm'lik dilimlere ayırın.
   NOT: Boş lakunalar, normalde osteosit içermesi gereken lakunaların bu hücrelerden yoksun olduğu kemik dokusu^19'daki durumu ifade eder. Kemik dokusunun sağlığını değerlendirmek için önemli bir göstergedir. Kemik nekrozunun patolojik sürecinde, yetersiz kan temini osteosit ölümüne neden olarak boş lakunalara yol açabilir. Kemik nekrozunun tanı ve değerlendirilmesinde, boş lakunaların sayısı ve dağılımı hastalığın şiddetini ölçmek için önemli parametrelerdir^20,21.
   1. Sıçan femoral örneklerini erimiş parafine (56-60 ° C) yerleştirin, önce gerekirse düşük erime noktalı parafine batırın, daha sonra dokunun parafin ile tamamen sızmasını sağlamak için her seferinde yaklaşık 1 saat boyunca kademeli olarak daha yüksek erime noktalı parafine aktarın.
   2. Gömme kalıplarını hazırlayın ve eritilmiş parafini kalıplara uygun derinliğe kadar dökün. Islattıktan sonra forseps kullanarak parafinden doku örneklerini alın, fazla parafini çıkarın ve kalıplara yerleştirin. Parafini katılaştırmak ve parafin blokları oluşturmak için oda sıcaklığına soğutun.
   3. Bir parafin mikrotomu kullanarak, gömülü parafin bloklarını 5 μm kalınlığında bölümler halinde kesin.
4. Dilimler ve lamel arasındaki yapışmayı arttırmak ve sonraki boyama işlemleri sırasında yüzmeyi azaltmak için sıçan femur örneklerini ekli dilimlerle birlikte bir slayt ısıtıcısında 1 saat pişirin.
5. Parafini çıkarmak için pişmiş dilimleri sırayla saf ksilene batırın, ardından mutlak etanol, gradyan etanol (%100, %95, %80, %70) ve su yoluyla her biri 2 dakika boyunca bir dizi dehidrasyon gerçekleştirin, deparafinizasyon ve rehidrasyon işlemini tamamlayın.
6. Deparafinleştirilmiş dilimleri bir hematoksilen boyama solüsyonuna batırın ve 10 dakika boyunca boyayın. Bağlanmamış hematoksileni çıkarmak için akan su ile durulayın.
7. Hematoksilen ile boyanmış bölümleri eozin boyama solüsyonuna daldırın ve sitoplazmayı ve bağ dokusunu renklendirmek için 2 dakika boyayın. Lekelenme etkisini düzeltmek için% 1 asetik asit çözeltisi ile durulanır.
8. Sıçan femur kemiği örneği dilimlerini sırayla %70, %80, %90, %95 ve %100 etanole daldırın, her gradyanda 2 dakika boyunca nemi kademeli olarak giderin.
9. Sıçan femur kemiği örnek dilimlerini şeffaflık için saf ksilene batırın, ardından ksileni çıkarmak için akan su ile durulayın. Nötr montaj reçinesi uygulayın, kızakları kaplayın, hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe vurun ve montaj işlemini tamamlamak için montaj ortamının katılaşmasına izin verin.
10. R'deki randomizr paketini kullanarak, her grup için 30 HE lekeli slayt seçin ve her biri iki araştırmacıya 15 slayt ayırın. Gruplamalar hakkında bilgi vermeden, araştırmacılardan slaytların boş lakuna oranını hesaplamalarını ve istatistiksel analiz için sonuçları toplamalarını isteyin.

9. MikroCT analizi

1. Modelleme tamamlandıktan sonra, farelere ötenazi yapın. Hematoksilen-Eozin boyaması için femurları çıkarın.
2. Biyolojik dokuları örnek olarak korumak için sıçan uyluk kemiğini 24 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde bekletin. Sıçan uyluk kemiğini hayvana özgü küçük mikroCT cihazına yerleştirin.
3. MikroCT tarama koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: X-ışını voltajı: 80 kV, Akım: 100 μA, Tek pozlama süresi: 50 ms, tarama çözünürlüğü: 25 μm. 0,5 ° 'lik aralıklarla taramalar yapın, kıkırdağın altından ilgilenilen bölge olarak epifizin üst kısmına kadar trabeküler kemiğe odaklanın.
4. Sıçan femur boynunun üzerindeki alanı ilgilenilen bölge olarak tanımlayın.
5. MikroCT cihazını kullanarak tarama sonuçlarının koronal düzlem rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin ve mikroCT cihazının yerleşik yazılımı tarafından oluşturulan kemik morfometrik ölçümlerini toplayın. Aşağıdaki gözlemlenen indeksleri kaydedin: Toplam Hacim (TV), Yüzde Kemik Hacmi (BV / TV), Kemik Yüzeyi / Hacim Oranı (BS / BV), Yapı Kalınlığı (Tb.Th), Yapı Ayrılması (Tb.Sp), Kemik Sayısı (Tb.N), Kemik Yoğunluğu (BD).

10. İstatistiksel analiz

1. Verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. Bağımsız örneklem t-testini kullanarak mikro-BT ve kantitatif histolojik değerlendirmeler için istatistiksel analizler yapın. 0,05 < bir p değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Sonuçlar

Histopatoloji analizi
Hematoksilen ve eozin boyamaları, Kontrol grubu ve Kontrol+Yük grubunda kemik trabeküllerinin sağlam ve düzenli olarak düzenlendiğini ortaya koydu. Kan damarı endotel hücreleri kemik çukurlarında mevcuttu ve hücre morfolojisi dolgun görünüyordu. Buna karşılık, Model grubu ve Model + Yük grubu, önemli ölçüde daha yüksek sayıda boş lakuna ile birlikte kırık ve düzensiz kemik trabekülleri sergiledi. Model+Load grubu, Mo...

Tartışmalar

Şu anda, tavşan²⁵, sıçan²⁶, fareler²⁷, domuzlar²⁸, piliçler²⁹, devekuşları⁸ ve emus³⁰ gibi çeşitli hayvanlar femur başı nekrozu modelleri oluşturmak için kullanılabilir. Bunlar arasında sıçanlar, fareler ve tavşanlar en yaygın kullanılan türlerdir. Femur başı nekrozu için bir model olarak sıçan, s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7