Çizik Yara Migrasyon Testi ve Sferoid Filizlenme Testinden Yararlanarak Anjiyogenezin Fonksiyonel ve Moleküler Düzeyde İncelenmesi

Özet

Bu çalışma, iki boyutlu (2D) çizik yara migrasyon testini ve üç boyutlu (3D) küresel filizlenme testini, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya dahil olmak üzere ilgili aşağı akış analiz yöntemleriyle birlikte, in vitro anjiyogenezi incelemek için uygun testler olarak sunmaktadır.

Özet

Anjiyogenez, tümör büyümesi veya neovasküler göz hastalığı dahil olmak üzere vücuttaki hem fizyolojik hem de patolojik süreçlerde çok önemli bir rol oynar. Altta yatan moleküler mekanizmaların ve güvenilir tarama modellerinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, hastalıkların etkili bir şekilde hedeflenmesi ve yeni terapötik seçeneklerin geliştirilmesi için gereklidir. Anjiyogenezi modellemek için çeşitli in vitro testler geliştirilmiştir ve kontrollü bir ortamın anjiyojenik sürücüleri moleküler düzeyde aydınlatmak ve terapötik hedefleri taramak için sağladığı fırsatlardan yararlanılmıştır.

Bu çalışma, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler) kullanılarak in vitro anjiyogenezin araştırılması için iş akışlarını sunmaktadır. 2 boyutlu bir ortamda endotel hücre göçünü ölçen bir canlı hücre görüntüleme sistemi kullanan bir çizik yarası migrasyon testini ve bir kollajen matrisi tarafından sağlanan 3 boyutlu bir ortamda endotel hücresi filizlenmesini değerlendiren küresel filizlenme testini detaylandırıyoruz. Ek olarak, RNA ekstraksiyonu ve immünositokimya da dahil olmak üzere, özellikle 3D ortamda, transkriptomik gibi daha ileri moleküler analizleri mümkün kılmak için numune hazırlama stratejilerini özetliyoruz. Toplamda, bu çerçeve bilim insanlarına in vitro anjiyogenez tahlillerinde bilimsel araştırmalarını sürdürmeleri için güvenilir ve çok yönlü bir araç seti sunar.

Giriş

Önceden var olanlardan yeni kan damarlarının oluşumunu ifade eden^{anjiyogenez 1}, fizyolojik gelişim ve patolojik durumlar sırasında çok önemli bir süreçtir. Retina² veya gelişmekte olan merkezi sinir sistemi³ gibi metabolik olarak aktif dokulara enerji sağlamak ve hasarlı dokunun^{iyileşmesi sırasında 4} vazgeçilmezdir. Öte yandan, anormal anjiyogenez, çok sayıda hastalığın temelidir. Kolorektal kanser veya küçük hücreli dışı akciğer kanseri gibi katı tümörler, anjiyogenezi teşvik ederek büyümelerini ve gerekli enerji tedarikini kolaylaştırır⁵. Kanserin ....

Protokol

1. HUVEC hücre kültürü

NOT: Aşağıdaki tüm adımları steril çalışma koşullarında (steril çalışma tezgahı) gerçekleştirin.

1. HUVEC'leri genişletme
   1. Her iki anjiyogenez testi için, havuzlanmış insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) veya insan mikrovasküler endotel hücreleri (HMVEC'ler) kullanın.
   2. Hücreleri, bir bölme gerçekleştirmeden önce endotel hücre büyüme ortamı (EGM) ile kaplanmamış bir T75 şişesinde %90 birleşime ulaşana kadar yetiştirin. Haftada 3 kez orta değişim yapın.
      NOT: Büyümeyi hızlandırmak için ortam günlük olarak değiştirilebilir. HUVEC'leri altıncı pasajın ötesinde kullanma....

Tartışmalar

Bu yazıda, in vitro anjiyogenezi incelemek için fonksiyonel ve moleküler okumaları olan bir teknik spektrumu sunduk.

Migrasyon testi, ıslak laboratuvar çalışmasının tüm alanlarında kullanılan iyi bilinen bir tekniği temsil eder. Tarama ve doz-yanıt deneyleri için uygun 96 oyuklu formattan, WoundMaker aracı tarafından oluşturulan standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir yara boyutundan, 24 saate kadar hızlandırılmış görüntüleme yoluyla migrasyon kinetiğ.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
2-(4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl)-ethan-sulfonsäure	PAN-Biotec	P05-01100	HEPES
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493