Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu makalede, bir enzimin insan serumunda 37 °C'de inkübe edildiğinde işlevini sürdürme yeteneğini karakterize etmek için yöntemleri detaylandırıyoruz, bu da serum stabilitesi olarak adlandırılan farmakolojik bir özelliktir. Bu yetenek, bir enzimin farmakokinetik profilini ve terapötik kullanım için uygunluğunu tahmin etmede önemli bir faktör olabilir.

Özet

Enzim stabilitesi kavramı tipik olarak bir enzimin termostabilitesine atıfta bulunmak için kullanılır - sıcaklık arttıkça yapı ve aktiviteyi koruma yeteneği. Terapötik bir enzim için, diğer stabilite ölçümleri de, özellikle insan serumunda 37 ° C'de fonksiyonu koruma kabiliyeti de kritik olabilir, buna serum stabilitesi denir. Burada, absorbans bazlı bir mikroplaka prosedürü kullanarak vahşi tip Homo sapiens adenosin deaminaz I (HsADA1) enziminin serum stabilitesini değerlendirmek için bir in vitro testi tarif ediyoruz. Spesifik olarak, bu el yazması, tamponların ve reaktiflerin hazırlanmasını, HsADA1'in serumda çakıştırılmasını düzenleyen bir yöntemi, bir mikroplaka okuyucu kullanarak test numunelerini analiz etmek için bir yöntemi ve bir HsADA1 enziminin serumda zamanın bir fonksiyonu olarak tuttuğu aktivite fraksiyonunu belirlemek için eşlik eden bir analizi açıklar. Protokolün serum stabilitesinin önemli olduğu diğer enzimlere adaptasyonuna yardımcı olmak için bir Homo sapiens kinüreninaz enzimi örneği kullanarak bu protokolü diğer enzimlere uyarlamak için düşünceleri daha fazla tartışıyoruz.

Giriş

Aşağıdaki yöntem, bir kullanıcının, intravenöz enjeksiyondan sonra karşılaşacağı şeyi taklit eden koşullara maruz kaldığında bir enzimin aktivitesini koruma yeteneğini kantitatif olarak değerlendirmesine olanak tanır. İn vitro yöntem, bu tür in vivo koşulları taklit eder ve enzimin 37 ° C'de havuzlanmış insan serumunda inkübasyonundan ve enzim aktivitesinin tutulmasının zaman vadeli analizlerinden oluşur. Bir enzimin bu koşullarda aktiviteyi koruma kabiliyetine serum stabilitesi olarak atıfta bulunuruz ve enzim aktivitesi için analiz yöntemi, bir enzimin substratı ile elde edilen ürün arasındaki absorpsiyon farklılık....

Protokol

1. Serum inkübasyonu

  1. 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda 1x PBS pH 7.4'te (1x PBS) 10x HsADA1 stoğu hazırlayın. 15 mL'lik bir havuzlanmış insan serumu alikotunu çözün ve 37 ° C'ye ısıtın. 50 mL'lik 1x PBS'lik bir alikotu 37 °C'ye önceden ısıtın.
  2. Enzim + serum karışımı olarak adlandırılan düşük bağlı bir mikrosantrifüj tüpünde 900 μL havuzlanmış insan serumuna 10 μL 10x HsADA1 stoğu ekleyerek enzim-serum inkübasyon karışımlarını hazırlayın. Ayrı bir düşük bağlı mikrosantrifüj tüpünde, enzim + 1x PBS karışımı olarak adlandırılan serum olmayan bir kontrolle karşılaştırmak için 10 μL 10x HsADA1 stokun....

Temsili Sonuçlar

Şekiller, vahşi tip HsADA1 ile yapıldığında yapılan tahlil çalışmasının sonuçlarını göstermektedir. Şekil 3A,B, adenozin ilavesinden sonra vahşi tip HsADA1 için 1x PBS/serum-enzim karışımlarından kaynaklanan numunelerin 260 nm'deki absorbans düşüş eğrilerini göstermektedir. Zaman verilerinin bir fonksiyonu olarak bu azalan absorbans, kullanıcının mikroplaka bazlı testin başarılı bir şekilde tamamlanmasın.......

Tartışmalar

Bu protokol, bir enzimin aktivitesini ölçmek için substrat ürüne dönüştürülürken absorbans değişimini kullanır. Bu nedenle, substrat ve ürün farklı spektral profillere sahip olmalıdır. Bu, her ikisi de farklı spektral profillere ve 260-265 nm 6,8,12,13 arasında sönme katsayılarına sahip adenozin ve inosin için geçerlidir. Bu tahlil, ö.......

Açıklamalar

JB ve MRJ, adenozin deaminaz ve/veya kinüreninaz enzimleri ile ilgili patentler veya patent başvuruları konusunda mucitlerdir. Diğer tüm yazarların açıklanması gereken herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [1DP2CA280622-01] tarafından desteklenmiş ve Biolocity'den fon sağlanmıştır. Dr. Maria Jennings ve Andrea Fox'a HsADA1 ve HsKYNase ekspresyon vektörlerini sağladıkları için teşekkür ederiz.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine Sigma AldrichA9251-25G25 g
BioTek Synergy HT Microplate Reader
Eppendorf LoBind Microcentrifuge Tubes: Protein Fisher Scientific 13-698-7952 mL
GlycerolFisher Scientific G33-44 L
HsKYNase66-W102H-T333NIn-house
Human Serum, PooledMP Biomedicals92931149100 mL
Hydroxy-kynurenineCayman Chemicals27778
Inosine TCII003725 g
PBS, 1x  pH 7.4+/- 0.1Corning21-040-CM
Pyridoxal 5-phosphate monohydrate, 99% Thermo Scientifc2281700101 g
UV-STAR MICROPLATE, 96 WELL, COC, F-BOTTOMGreiner Bio 655801
Wildtype Human Adenosine Deaminase 1In-house

Referanslar

  1. Valero, J., et al. A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118 (2021).
  2. Iannuzo, N., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon