Taze Dondurulmuş İnsan Beyninin Bölümlerinden Salınan Küçük Hücre Dışı Veziküllerde MikroRNA Yüklerinin Gücünden Yararlanma

Özet

Burada, nörolojik bozukluklar için mikroRNA (miRNA) biyobelirteçleri için kaynak olarak küçük hücre dışı veziküller elde etmek için minimum miktarda taze donmuş beyin dokusu kesitleri ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte erişilebilir bir yüksek hızlı santrifüjleme yöntemi kullanan bir protokol oluşturuyoruz.

Özet

Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler), proteinler, lipitler ve nükleik asitler (mikroRNA, mRNA, DNA) gibi çeşitli yükleri taşıyan hücre-hücre iletişiminin çok önemli aracılarıdır. MikroRNA sEV kargosu, sEV'nin biyolojik engelleri (örneğin kan-beyin bariyeri) geçme ve çeşitli vücut sıvıları yoluyla erişilebilir hale gelme yeteneği nedeniyle güçlü bir non-invaziv hastalık biyobelirteç olarak potansiyel faydaya sahiptir. Vücut sıvılarındaki sEV biyobelirteçleri üzerine yapılan çok sayıda çalışmaya rağmen, doku veya hücreye özgü sEV alt popülasyonlarını, özellikle beyinden tanımlamak zor olmaya devam etmektedir. Çalışmamız, boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanarak sEV'leri minimum miktarda donmuş insan beyni bölümlerinden izole etmek için mevcut yöntemleri uyarlayarak bu zorluğu ele almaktadır.

Etik onaydan sonra, yaklaşık 250 μg taze dondurulmuş insan beyin dokusu (Manchester Beyin Bankası'ndan [İngiltere]'den elde edilen) 3 donör dokudan dilimlendi ve kollajenaz tip 3 / Hibernate-E solüsyonunda inkübe edildi, ara ajitasyon ile takip edildi, ardından seri santrifüjleme ve filtrasyon adımları izlendi. Daha sonra, sEV'ler SEC yöntemi kullanılarak izole edildi ve MISEV yönergeleri izlenerek karakterize edildi. Bu sEV'lerin içinden RNA'yı izole etmeden önce, çözelti, herhangi bir sEV olmayan hücre dışı RNA'yı çıkarmak için Proteinaz-K ve RNase-A ile muamele edildi. RNA miktarı ve kalitesi, qPCR ve küçük RNA dizileme deneyleri için kontrol edildi ve daha fazla işlendi.

sEV'lerin varlığı, floresan nanopartikül izleme analizi (fNTA) ve yüzey belirteçleri için western blot (CD9, CD63, CD81) ile doğrulandı. Boyut dağılımı (50-200 nm) NTA ve elektron mikroskobu ile doğrulandı. Parçalanmış sEV'ler içindeki toplam RNA konsantrasyonu 3-9 ng/μL arasında değişmekteydi ve seçilen aday mikroRNA'lar için qPCR ile başarılı bir miktar tayini için kullanıldı. MiSeq'teki küçük RNA dizilimi, numune başına 1,4-5 milyon okuma ile yüksek kaliteli veriler (Q >32) sağladı.

Bu yöntem, sEV'lerin minimal beyin dokusu hacimlerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve karakterizasyonunu sağlar, invaziv olmayan biyobelirteç araştırmalarını kolaylaştırır ve nörodejeneratif hastalıklar ve potansiyel olarak diğer bozukluklar hakkında içgörüler sunarak adil hastalık biyobelirteç çalışmaları için umut vaat eder.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm çok hücreli organizmalarda hücreler arası iletişimin kilit oyuncularından biridir¹. EV'ler, proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi çeşitli kargo yüklerinin alıcı hücrelere transferini kolaylaştırabilen, hücreden türetilmiş lipid çift katmanlı zar parçacıklarıdır. EV'ler, 30 nm ila 1 μM arasında değişen geniş bir boyut aralığına sahip olabilir. Ortalama çap boyutu <200 nm olan lipide bağlı veziküller olarak tanımlanan küçük EV'ler (sEV'ler), kan-beyin bariyerini geçme yeteneğine sahiptir; bu nedenle, nörodejeneratif hastalıkların ve Alzheimer hastalığı (AD), frontotemporal demans (FTD), Parkinson hastalığı (PD) ve kanserler gibi diğer durumların prion benzeri yayılması ve alevlenmesinde rol oynamışlardır ^2,3. Ayrıca, sEV'ler kan, beyin omurilik sıvısı (BOS), tükürük ve hatta idrar gibi bir dizi biyosıvıda bulunabileceğinden, faydalı kullanımları biyobelirteçler ve invaziv olmayan teşhis alanını kapsayabilir. Örneğin, AD araştırması, tau / Aβ ve hatta Aβ₄₂ / Aβ₄₀⁴ gibi biyoakışkan patojenik protein oranlarının kullanımına işaret edebilir.

Bilinen bir sEV kargosu, mRNA'nın 3'-UTR bölgelerine bağlanan ve genellikle protein ekspresyonunu negatif olarak düzenleyen, yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda küçük, kodlamayan bir RNA molekülleri grubu olan mikroRNA'dır (miRNA). Birçok hücresel rolde yer alan miRNA'lar, kanserler ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patogenezinde de rol oynamaktadır. Cheng ve ark. AD hastalarından^serumdan türetilen sEV miRNA ekspresyon imzalarının yüksek verimli bir dizileme analizini gerçekleştirdi 5. Nörogörüntüleme kayıtları ve yaş, cinsiyet ve APOE ε4 alel sunumunun bilinen risk faktörleri ile birleştirildiğinde, sonuçların AD'yi %87 duyarlılık ve %77 özgüllük ile öngördüğü bulundu. Ayrıca araştırmalar, erken evre PD^6'yı potansiyel olarak teşhis edebilen iki yukarı regüle edilmiş BOS miRNA'sı (miR-151a-3p, let-7f-5p) ve 3 aşağı regüle miRNA (miR-27a-3p, miR-125a-5p ve miR-423-5p) tanımlamıştır. Patolojik hastalıklarda, patolojik durum, hastalıkların belirli karakteristik semptomlarından önce gelebilirken, nörodejenerasyonda, patolojik işaretlerin birikimi bilişsel gerilemeden çok daha erken gerçekleşir.

MikroRNA'lar, çeşitli işlevleri ve daha yüksek dereceli epigenetik düzenlemeleri nedeniyle potansiyel olarak proteinlerden daha etkili bir biyobelirteçtir. Araştırmacılar, beyin dokusunu kullanarak, hastalıklar ve alt türleri için spesifik beyin kaynaklı sEV (BDsEV) miRNA imzalarını potansiyel olarak tanımlayabilirler. Örneğin, nöronal ve glial belirteçlere sahip sEV'ler farklı miRNA kargoları sunabilir ve analiz, hastalık tespiti için daha kesin yöntemlerle sonuçlanabilir. Ayrıca, BDsEV'lerin nöropatojenik proteinlerin transsinaptik yayılımında büyük bir rol oynadığı öne sürülmektedir⁷. Önceki raporlar, taze donmuş beyin dokusundan sEV'ler elde etmek için immünopresipitasyon ve yoğunluk gradyanı (sükroz gradyanı) ultrasantrifüj önermiştir ^8,9. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar, yüksek kaliteli sEV numuneleri elde etmek için ultrasantrifüj ve aşağı akış saflaştırma yöntemlerine sahip özel altyapı gerektirir¹⁰. Daha yeni raporlar, yaklaşımda çeşitli değişiklikler ve iyileştirmeler önermiştir 11,12,13; bununla birlikte, buna rağmen, insan dokularından sEV türevi mikroRNA'nın izolasyonu ve çalışması hala yaygın olarak uygulanmamaktadır. Bu protokolde açıklanan yaklaşım, bu tekniğe erişilebilirliği artırmak için beyin kaynaklı sEV çalışması için rafine, adım adım bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Minimum miktarda beyin dokusu kullanarak bir protokol oluşturduk, bu protokolden boyut dışlama kromatografisi kullanarak saf sEV'leri izole ettik ve bu sEV'lerin mikroRNA kargosundan yüksek kaliteli yeni nesil dizileme verilerini gösterdik.

Protokol

Çalışma, Manchester Beyin Bankası (REC referansı 09/H0906/52) ve Salford Üniversitesi'ndeki etik kurul (Başvuru Kimliği: 3408) tarafından etik olarak onaylanmıştır.

1. Donmuş beyin dokusu kesitlerinde kollajenaz kullanılarak hücre içi matriksin parçalanması

1. Soğuk bir plaka üzerinde sterilize edilmiş bir neşter kullanarak 250 mg donmuş beyin dokusunu (yaklaşık 0.4 mm kalınlığında parçalar) ince bir şekilde dilimleyin ve 2 mL 75 U / mL kollajenaz tip-III / Hibernate-E solüsyonu ekleyin.
2. Her numuneyi 37 °C'de bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin. 5 dakikalık noktada, karıştırmak için her numuneyi iki kez ters çevirin; 10 dakikalık noktada, 10 mL plastik tek kullanımlık şerit kullanarak her bir numuneyi üç kez nazikçe pipetleyin.
3. Her numuneyi buzun üzerine yerleştirin ve 1x Proteaz inhibitörü kokteyli ve 1x fosfataz inhibitörü ekleyin. Bu, enzim reaksiyonunu durdurur ve kollajenaz tip-III kullanılarak sindirimin son noktasıdır.
4. Her beyin dokusu örneğini 300x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir süpernatanı toplayın ve daha fazla santrifüjü 2000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca toplayın.
5. Her süpernatanı tekrar toplayın ve 0,22 μm'lik bir filtreden süzün. Her bir süzüntüyü 10 000 x g'da 4 ° C'de 48 dakika boyunca santrifüjleyin.
6. Süpernatanı toplayın ve her numuneye 2: 1 oranında yağış tamponu ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
7. Her bir numuneyi 10 000 x g'da 4 ° C'de 96 dakika boyunca santrifüjleyin ve peleti 100 μL hücre dışı vezikül (EV) içermeyen PBS'de yeniden süspanse edin.

2. Boyut dışlama kromatografi kolonlarının hazırlanması

1. Kullanmadan önce, önceden hazırlanmış SEC sütununu oda sıcaklığında (RT) 15 dakika dengeleyin.
   NOT: Vidalı kapaktan önce alt kapak çıkarılmalıdır.
2. Dengelemeden sonra, koruyucu tamponu kolonun üstünden çıkarın ve kolonu 250 μL EV içermeyen PBS kullanarak iki kez yıkayın. Her PBS yıkaması, yerçekimi yoluyla kolona girmek için bırakılır.

3. Boyut dışlama kromatografisi kullanılarak küçük hücre dışı veziküllerin izolasyonu

1. Yeniden askıya alınmış peleti SEC kolonunun üstüne ekleyin ve sütunu 30 saniye boyunca 50 x g'de santrifüjleyin. Akışı atın.
2. SEC kolonunun üstüne 180 μL EV içermeyen PBS ekleyin ve kolonu 1 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin, böylece beyinden türetilen sEV'lerin kolondan dışarı çıkmasına izin verin.
   NOT: Protokolün yukarıda ayrıntıları verilen kısmı Şekil 1'de özetlenmiştir.

4. Küçük hücre dışı vezikül belirteçlerinin batı lekeleme ile doğrulanması

1. Western blot analizinden önce sEV'leri parçalamak için (tüm membran ve sitozolik kargoların analiz edildiğinden emin olmak için), izole edilmiş sEV numunesini lizis ve ekstraksiyon tamponunda (1x proteaz inhibitörü ve 1x fosfataz inhibitörü) 1: 1 oranında seyreltin.
2. Numuneyi 4 °C'de 30 dakika çalkalayın.
3. Numuneyi 15 dakika boyunca 14 000 x g'da santrifüjleyin.
4. Protein süpernatanı toplayın ve bir protein tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün.
5. Numuneleri 4x Laemmli tamponu ile karıştırın ve önceden boyanmış bir protein merdivenine karşı her bir oyuğa 20 μg protein yükleyin.
6. Çözüldükten sonra, proteinleri 0.45 μm'lik bir nitroselüloz membrana aktarın. Transferden sonra, membranı% 5 BSA'da 2 saat boyunca bloke edin.
7. Membranları gece boyunca birincil antikorlarla (Tablo 1) inkübe edin.
8. Membranı yıkama tamponu ile üç kez yıkayın (PBS'de %1 Tween20) ve fare önleyici ikincil bir antikor kullanarak lekeleyin. Daha sonra, yıkama tamponu ile üç kez yıkayın (PBS'de %1 Tween20).
9. Lekeleri görüntülemeden önce el yazmasındaki yukarıdaki adımları izleyin.
10. Yaban turpu peroksidaz (HRP) Substratı kullanılarak görüntü.

5. Nanopartikül izleme analizi (NTA) ile küçük hücre dışı veziküllerin doğrulanması

1. Numunedeki tüm parçacıkların konsantrasyonunu ve boyutunu analiz etmek için NTA gerçekleştirin. Bunu, her bir numuneyi PBS'de 1:1000'lik bir seyreltme faktöründe seyrelterek gerçekleştirin.
2. Numuneyi NTA cihazına enjekte edin ve numuneyi 550 nm dalga boyunda okuyun. Bu aşamada, MISEV kılavuzlarında önerildiği gibi partikül başına protein miktarını (genellikle femtogram olarak ifade edilir) ölçmek için partikül miktarını kullanın.
3. Daha sonra, floresan NTA için, PBS'de 1:1000'lik bir seyreltme faktörü ile turuncu hücre maskesini (CMO) (bir numune içindeki tüm biyolojik parçacıkları boyar) seyreltin. Bundan sonra, sEV numunesi kullanarak CMO boyasını 1:10'luk bir seyreltme faktörü ile seyreltin - Bu seyreltme adımını karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
4. İkinci CMO seyreltmesini PBS kullanarak 1:1000'lik bir seyreltme faktörü ile seyreltin.
   NOT: CMO boyasının son seyreltilmesi 1:10 000 000 olmalıdır.
5. NTA cihazını kullanarak 550 nm dalga boyunda her bir sEV örneğinin CMO'sunu okuyun.
6. Tetraspanin floresan antikorları için (Malzeme Tablosuna bakınız), ilk olarak, PBS'deki her bir antikoru 1:10'luk bir seyreltme faktörü ile seyreltin. Bundan dolayı, boyaların her birini sEV numunesi kullanarak 1:10'luk bir seyreltme faktörü ile seyreltin - Seyreltme adımını karanlıkta 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
7. İkinci antikor seyreltmesini PBS kullanarak 1:1000'lik bir seyreltme faktörü ile seyreltin.
   NOT: Her tetraspanin antikorunun son seyreltilmesi 1:100 000 olmalıdır.
8. NTA cihazını kullanarak 550 nm dalga boyunda sEV örneğinin floresan antikor okumalarını okuyun.

6. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile küçük hücre dışı veziküllerin doğrulanması

NOT: Bu protokol Liverpool Üniversitesi Biyomedikal Mikroskopi Tesisi tarafından gerçekleştirilmiştir.

1. İlk olarak, sEV örneklerini glutaraldehit kullanarak sabitleyin ve uranil asetat kullanarak lekeleyin.
2. Derecelendirilmiş bir dizi alkol aracılığıyla, numuneyi TEM için hazır hale getirin.
3. Uygun bir Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanarak görüntü örnekleri.

7. Proteinaz K ve RNaz A tedavisi

1. 50 μL izole beyin türevlerine 1 μL 20 μg/μL proteinaz K ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
2. 1x proteinaz inhibitörü kokteyli ekleyerek her reaksiyonu durdurun ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, her numuneye 1 μL 10 μg/μL RNase A ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.
   NOT: Hemen 8. bölüme geçin.

8. Küçük hücre dışı veziküllerden toplam RNA izolasyonu

1. Toplam RNA'yı izole etmek için, 50 μL beyin kaynaklı EV (BDsEV) örneğine 700 μL yüksek kaliteli RNA geri kazanım lizis reaktifi ekleyin. Her numuneyi 1 saat çalkalayın.
2. 140 μL kloroform ekleyin, her numuneyi 20 saniye kuvvetlice çalkalayın ve RT'de 3 dakika inkübe etmeye bırakın.
3. Numuneyi 12 000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin ve interfazı numuneden toplayın. 1.5x hacimde %100 etanol ekleyin.
4. 700 μL interfaz/etanol karışımı RNA izolasyon kolonları ekleyin ve RT'de 15 saniye boyunca ≥8000 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Tüm interfaz/etanol örneklerini kullanarak bu adımı tekrarlayın.
5. Kolona 700 μL yıkama tamponu ekleyin ve 15 saniye boyunca ≥8000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
6. 500 μL tampon RPE ekleyin ve tekrar 15 saniye boyunca ≥8000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
7. 500 μL% 80 etanol ekleyin ve 2 dakika boyunca ≥8000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
8. Bu noktada, kolonları kapak açıkken 5 dakika boyunca tam hızda (>8000 x g) santrifüj ederek kolon membranını kurutun.
9. Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın, doğrudan kolon membranına 14 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve BDsEV'lerden toplam RNA'yı elde etmek için 1 dakika boyunca ≥8000 x g'da santrifüjleyin.
10. MiRNA tahlil tipini seçerek, numunelerin bir miktar tayini florometresinde ölçüldüğü bir miRNA kantitasyon tahlil kiti kullanarak numunelerle toplam mikroRNA'yı ölçün.

9. Küçük RNA dizilimi

1. Numune içinde miRNA'nın miktar tayini yapıldıktan sonra, Küçük RNA-Seq Kütüphanesi Hazırlık Kitini kullanarak bir cDNA kütüphanesi sentezleyin.
   NOT: Bu protokolü kullanarak, kütüphane oluşturma dört adım içeriyordu: 3' adaptör ligasyonu, saflaştırma, 5' adaptör ligasyonu ve ters transkripsiyon - sonunda bir RNA/cDNA kütüphanesi oluşturulur. Kütüphane oluşturulduktan sonra, uç nokta PCR amplifikasyonu, indeks primerleri eklenerek (çoğullama amacıyla kullanılır) gerçekleşir ve ardından numuneler saflaştırılır.
2. RNA kalitesini test etmek için, her bir preparatın boyutunu ve tepe yoğunluğunu detaylandıran bir kalite kontrol uygulama testi kullanın.
3. DNA konsantrasyonunu test etmek için, dsDNA tahlil tipini seçerek bir miktar belirleme florometresinde DNA miktar tayinini ölçün.
4. Reaktif kitini kullanarak numuneleri Küçük RNA Seq için hazırlayın, ardından numuneler akış hücresine yüklenir.

Sonuçlar

BDsEV'lerin varlığını doğrulamak için üç teknik kullanıldı: western blotting, NTA ve TEM (Şekil 3). Western blot sonuçları (Şekil 3A ve Ek Dosya 1), beş pozitif markörün tümünün (CD9, CD63, CD81, Flot-1 ve TSG101) varlığını ve sEV'lerde Calnexin yokluğunu (negatif kontrol olarak kullanılır) gösterir ve hücresel içerikle kontaminasyon olmadığını doğrular. Beklendiği gibi, beyin...

Tartışmalar

Beyin kaynaklı küçük hücre dışı vezikülleri ve bunların mikroRNA yüklerini izole etmek için bu değiştirilmiş ve geliştirilmiş protokol, sonraki ürünlerin kalitesinden ve miktarından ödün vermeden minimum doku kullanmanın fizibilitesini göstermektedir. Biyobelirteç keşfi alanında, hücre ve doku tiplerine özgü moleküler tanımlayıcıların belirlenmesi, vücut sıvılarını kullanan non-invaziv tanı testlerinin daha erişilebilir yollarına yol açabilir....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094