Akciğer Adenokarsinomu ile İlişkili Primer Sjögren Sendromu: Potansiyel Ortak Patojenik Mekanizmaların Araştırılması ve Deneysel Doğrulama

Özet

Bu makale, biyoinformatik analiz ve deneysel doğrulama yoluyla primer Sjögren sendromu ve akciğer adenokarsinomunu birbirine bağlayan potansiyel yaygın patojenik mekanizmaları araştırmak için operasyonel prosedürleri ve önlemleri açıklamaktadır.

Özet

Bu çalışma, primer Sjögren sendromu (pSS) ve akciğer adenokarsinomunu (LUAD) birbirine bağlayan potansiyel yaygın patojenik mekanizmaları biyoinformatik analiz ve deneysel doğrulama yoluyla araştırmayı amaçladı. pSS ve LUAD ile ilişkili ilgili genler, Gene Expression Omnibus (GEO) veri tabanından ve Genecard veri tabanından alınmıştır. Daha sonra, pSS ve LUAD ile ilişkili diferansiyel olarak eksprese edilen genler (DEG'ler) pSS-LUAD-DEG'ler olarak tarandı. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) ve Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizleri, pSS-LUAD-DEG'lerin önemli biyolojik işlevlerini aydınlatmak için yapıldı. Temel hedefler, protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturularak belirlendi ve Alıcı Çalışma Karakteristiği (ROC) eğrisi analizleri yoluyla hub gen tanısal doğruluğu daha fazla değerlendirildi. Bu çalışmada, NOD / Ltj fareleri pSS hayvan modelleri olarak görev yaptı ve bir inflamatuar reaksiyon oluşturmak için partikül madde 2.5 (PM2.5) ile uyarıldı. İlgili moleküler biyoloji deney doğrulaması için kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ve western blotting kullanıldı. KEGG ve GO zenginleştirme analizleriyle ortaya çıkan sonuçlar, inflamasyonun pSS ve LUAD arasında bağlantı kurmada kritik bir rol oynadığını göstermektedir. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 ve CEP55, pSS-LUAD'ın anahtar hedefleri olarak belirlendi. BALB / c fareleri ve NOD / Ltj fareleri, PM2.5 ile 21 günlük stimülasyonun ardından akciğer dokularında inflamatuar sitokinler IL-6 ve IL-1β'nin gelişmiş ekspresyonunu sergiledi, JAK2 / STAT3 sinyal yolunu aktive etti ve tümörle ilişkili genler CCNA2, CCNB2 ve CEP55'in ekspresyonunu yukarı regüle etti ve NOD / Ltj fareleri BALB / c farelerinden daha belirgin değişiklikler gösterdi. Bu protokol, pulmoner inflamatuar mikroçevre tarafından indüklenen karsinogenezin, pSS hastalarında yüksek LUAD insidansının anahtar bir nedeni olabileceğini göstermektedir. Ek olarak, blokajla ilgili mekanizmalar, pSS hastalarında LUAD oluşumunu önlemeye yardımcı olabilir.

Giriş

Primer Sjögren sendromu (pSS), ekzokrin bezlerin lenfositik infiltrasyonu ile karakterize otoimmün bir hastalıktır ve kuru göz (kseroftalmi) ve ağız kuruluğu (kserostomi) klinik semptomlarına yol ^açar1,2. pSS'ye genellikle ana advers prognostik faktörleri oluşturan hiperglobulinemi³, interstisyel akciğer hastalığı⁴, renal tübüler asidoz⁵, nörolojik hasar⁶ ve trombositopeni⁷ dahil olmak üzere tutulumun ekstra glandüler bulguları eşlik eder. Son yıllarda, bir dizi çalışma, pSS'ye genellikle hematolojik maligniteler ve katı tümörler dahil olmak üzere artmış kanser prevalansının eşlik ettiğini göstermiştir ^8,9,10. Akciğer kanseri, özellikle akciğer adenokarsinomu (LUAD) olmak üzere pSS ile ilişkili en sık görülen kanserlerden ^biridir11.

Toplu olarak, daha fazla araştırma, LUAD ile pSS'nin altta yatan bazı ortak patogenezlere sahip olabileceğini düşündürmektedir. Mevcut bilgilerimize göre, iki hastalık arasındaki ortak mekanizmaları açıklayan özel bir çalışma henüz yoktur. Son zamanlarda, biyoinformatik analizler, türler arasında potansiyel olarak paylaşılan hastalık mekanizmalarını ortaya çıkarmamız için potansiyel bir olasılık sunmaktadır 12,13,14. Altta yatan mekanizmaları daha fazla ortaya çıkarmak için, pSS ve LUAD arasındaki ortak hedeflerin ve sinyal yollarının analizi için biyoinformatik analiz kullanılır ve daha sonra deneysel doğrulama için hayvan modelleri oluşturulur. Bu mekanizmaların ortaya çıkarılması, pSS hastalarında LUAD'ın klinik olarak önlenmesi için bir kanıt temeli sağlamaya yardımcı olabilir.

Bu çalışma, pSS ve LUAD ile ilişkili ilgili genleri almak için GEO ve Genecard veritabanlarını kullandı. Daha sonra, pSS ve LUAD ile ilişkili DEG'ler pSS-LUAD-DEG'ler olarak tarandı. pSS-LUAD-DEG'lerin önemli biyolojik fonksiyonlarını aydınlatmak için KEGG ve GO zenginleştirme analizleri gerçekleştirdik. Temel hedefleri belirlemek için PPI ağ yapısı kullanıldı ve ROC eğrisi analizleri yoluyla hub gen tanı doğruluğunu daha fazla değerlendirdik. Bir inflamatuar reaksiyon oluşturmak için partikül madde 2.5 (PM2.5) ile uyarılan pSS hayvan modelleri olarak NOD / Ltj fareleri kullandık. Çalışmayı deneysel olarak doğrulamak için QPCR, ELISA ve western blotlama yapıldı. Genel olarak, buradaki sonuçlar, pulmoner inflamatuar mikroçevre tarafından indüklenen karsinogenezin, pSS hastalarında yüksek LUAD insidansının kritik bir nedeni olabileceğini göstermektedir. Ayrıca, pSS hastalarında LUAD oluşumunun, blokaj ile ilgili mekanizmalarla önlenebileceğini düşündürmektedir.

Protokol

Deney hayvanları, Çin'in ulusal standardı olan Laboratuvar Hayvanları-Çevre ve Barınma Tesislerinin Gereksinimleri (GB14925-2010) ile uyumlu olarak barınma koşullarının hayvan besleme ortamını karşıladığı Çin-Japonya Dostluk Hastanesi'nin hayvan tesisine yerleştirildi. Tüm hayvan bakımı prosedürleri ve deneyleri, ARRIVE yönergelerine uygundur ve Çin Ulusal Hayvan Refahı Yasası'nın yönergelerine bağlı kalarak 3R ilkelerine (azaltma, değiştirme, iyileştirme) dayanıyordu. BALB/c fareleri SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.'den ve NOD/Ltj fareleri Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.'den satın alındı.

1. Biyoinformatik analiz

1. Veri setlerinin hazırlanması
   1. Gen Ekspresyon Omnibus (GEO) veritabanını (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)¹⁵ açın ve gen ekspresyon profillerini aramak için primer Sjögren sendromu ve akciğer adenokarsinomunu anahtar kelime olarak kullanın. Ardından GEO DataSets Veritabanındaki sonuçlara tıklayın ve En İyi Organizmalar bölümünde Homo sapiens'i seçin. İlgilendiğiniz veri kümesini ilgili platform bilgileriyle birlikte seçin ve indirin.
   2. Genecard veritabanını (https://www.genecards.org/)¹⁶ açın ve pSS ve LUAD genlerini elde etmek için primary Sjögren sendromu ve akciğer adenokarsinomunu anahtar kelime olarak kullanın. Hastalık genlerinin elektronik tablolarını indirin.
2. pSS ve LUAD arasında paylaşılan DEG'lerin tanımlanması
   1. R yazılımını indirin ve açın (https://cran.r-project.org/)¹⁷. GEOquery R paketini, stringr R paketini, ggplot2 R paketini, reshape2 R paketini ve limma R paketini R yazılımına yükleyin.
   2. R yazılımını kullanarak farklı GEO veri kümelerinde (GSE84844, GSE51092, GSE32863 ve GSE75037) diferansiyel olarak ifade edilen genleri (DEG'ler) tanımlayın ve görselleştirin, ardından bu veri kümeleri arasındaki gen ekspresyonunu karşılaştırın ve analiz edin. Ayarlanmış bir P değeri 0.05 < ve kat değişimi (FC) > 1.2 veya < 0.83 olan genleri DEG olarak düşünün.
   3. Genecard veritabanından pSS ve LUAD ile ilgili 20'ye eşit veya daha büyük bir ifade seviyesine sahip genleri seçin.
   4. pSS ile ilişkili DEG'leri ve LUAD ile ilişkili DEG'leri hem GEO veritabanından hem de Genecard veritabanından birleştirin.
   5. pSS ve LUAD (pSS-LUAD-DEG'ler) ile ilişkili DEG'leri elde etmek ve görselleştirmek için VennDiagram paketini R'ye kurun ve yükleyin.
3. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yolağı zenginleştirme analizi
   1. Metascape'e girin (https://metascape.org/)¹⁸. Dosya Seç'e tıklayın ve pSS-LUAD-DEGs'in .xlsx biçimindeki dosyasını yükleyin. Tür Olarak Giriş'te H. sapiens'i seçin. Benzer şekilde, Tür Olarak Analiz'de H. sapiens'i seçin.
   2. Özel Analiz'e tıklayın. Zenginleştirme'ye tıklayın ve KEGG Yolu'nu seçin. Zenginleştirme Analizi'ni tıklatın, ardından zenginleştirme analizi tamamlandığında Analiz Raporu Sayfası'nı tıklatın.
   3. Sonucu indirmek için Hepsi Bir Arada Zip Dosyası'na tıklayın. Sonucu görüntülemek için indirme Enrichment_GO klasöründeki _ FINAL_GO.csv dosyasına erişin.
   4. R'de KEGG görselleştirme programını gerçekleştirmek için ggplot2 paketini kullanın.
4. Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi
   1. R'de clusterProfiler ve enrichplot paketini yükleyin ve yükleyin.
   2. pSS-LUAD-DEG'lerin metin biçimindeki listesini R'ye aktarın.
   3. GO zenginleştirme analizi ve sonuç görselleştirmesi için clusterProfiler ve enrichplot paketlerini çalıştırın. Analizde 0,05'< ayarlanmış bir P değerinde istatistiksel anlamlılığı tanımlayın.
5. Protein-protein etkileşimi (PPI) ağının oluşturulması ve modül analizi
   1. Etkileşimli Genlerin Alınması (STRING) veritabanına (http://string-db.org/)¹⁹ girin. Gözat'a tıklayın ve pSS-LUAD-DEGs dosyasını yükleyin. Organizmalar'da Homo sapiens'i seçin ve Ara'yı tıklayın.
   2. Devam'ı tıklayın. Sonuçlar hazır olduğunda, Ayarlar'a tıklayın. Temel Ayarlar > Minimum Gerekli Etkileşim Puanı altında, Yüksek Güvenilirlik (0,700) öğesini seçin. Gelişmiş Ayarlar'da Ağdaki Bağlantısı Kesilen Düğümleri Gizle'yi işaretleyin ve ardından Güncelle'yi tıklayın.
   3. PPI ilişki metnini TSV formatında indirmek için başlık çubuğundaki Dışa Aktarmalar'a tıklayın.
   4. Cytoscape 3.7.1 yazılımını indirin ve açın (https://cytoscape.org/)²⁰. PPI ağını oluşturmak için TSV biçimindeki dosyayı içe aktarmak için Dosya >> Ağı Dosyadan İçe Aktar'a tıklayın.
   5. Ağdaki topolojik parametreleri analiz etmek için Ağ Çözümleyicisi aracını kullanın. Sol kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla düğüm boyutunu ve rengini optimize edin.
   6. Menü çubuğunda Araçlar > Ağı Analiz Et'i seçin. Tablo panelinde, bileşenleri dereceye göre azalan düzende sıralamak için Derece'ye tıklayın. Hub genleri olarak daha yüksek derecelere sahip ilk 20 geni alın.
   7. Hub genlerini dereceye göre görselleştirmek için igraph ve ggplot2 paketlerini R'ye kurun ve yükleyin.
6. Hub genlerinin tanımlanması ve doğrulanması
   1. pROC paketini R'ye kurun ve yükleyin.
   2. Hub genlerinin metin biçimindeki listesini R'ye aktarın.
   3. Hub genlerinin alıcı çalışma karakteristiği (ROC) eğrilerini çizin ve ROC eğrisi (AUC) değerlerinin altındaki alanı hesaplayın.
      NOT: DEG'leri filtrelemek için R kodu için Ek Kodlama Dosyası 1'e bakın.

2. Deneysel doğrulama

NOT: Bu protokolde kullanılan malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Hayvan hazırlama
   1. 12 dokuz haftalık dişi BALB/c faresini ve 12 dokuz haftalık dişi NOD/Ltj faresini 1 hafta boyunca adaptif olarak besleyin.
   2. 12 dokuz haftalık dişi BALB/c faresini boş kontrol grubuna ve PM2.5 grubuna eşit olarak tahsis etmek için rastgele bir sayı tablosu kullanın. Benzer şekilde, 12 dokuz haftalık dişi NOD / Ltj faresini pSS grubuna ve pSS-PM2.5 grubuna eşit olarak bölün.
2. Partikül madde 2.5 (PM2.5) süspansiyonunun hazırlanması
   NOT: PM2.5, fare modeli^21'de inflamasyonla ilişkili LUAD'ın oluşumunu ve gelişimini indükleyebilir. BALB / c fareleri ve NOD / Ltj fareleri, inflamasyonla ilgili değişiklikler geliştirmek için PM2.5 tarafından indüklendi. Piao ve ^ark.22 tarafından tarif edilen yönteme göre, PM2.5 süspansiyonunun konsantrasyonu 1 mg / mL'de hazırlandı.
   1. PM2.5 kuvars fiber membranları tartın, 2 cm × 2 cm'lik parçalar halinde kesin ve uygun miktarda deiyonize su içeren bir behere daldırın.
   2. Beheri kapatın ve her seferinde 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosu sonikatöründe sonikleştirin. Parçacıklar tamamen çözülene kadar bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
   3. Beherdeki sıvıyı 16 kat steril tıbbi gazlı bezden süzün, ardından gazlı bezden kalan nemi sıkın.
   4. Süzüntüyü düz bir tabağa koyun ve -20 °C dondurucuda buz blokları halinde dondurun. Ardından, süzüntüdeki buz bloklarını kurutmak ve toz haline getirilmiş parçacıkları toplamak için bir dondurarak kurutma aleti (-52 °C, 0,1 mbar, 48 saat) kullanın.
   5. 1 mg / mL konsantrasyonda bir PM2.5 süspansiyonu hazırlamak için toz haline getirilmiş parçacıkları tuzlu su içinde iyice çözün. PM2.5 süspansiyonunu bir cam şişeye dökün, yüksek basınçlı bir sterilizatöre koyun ve sterilizasyon için yüksek basınç ve sıcaklık (121°C'de 15 dakika, 15 psi) uygulayın.
   6. Ultrasonik çalkalama yapın (200 W, 10 s ajitasyon, 10 s dinlenme, 3 döngü için). İşlemden sonra, daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
3. PM2.5 fare modelinin kurulması
   NOT: PM2.5 grubu ve pSS-PM2.5 grubuna, her doz 0.1 mL olmak üzere 28 gün boyunca her 3 günde bir trakea damlası ile PM2.5 süspansiyonu uygulandı. Boş kontrol grubu ve pSS grubuna, her doz 0.1 mL olmak üzere, 28 gün boyunca her 3 günde bir trakea damlası ile fizyolojik salin uygulandı.
   1. Fareye bir Ketamin (100 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) karışımı enjekte edin. Bir ayak parmağı tutamına yanıt eksikliği olup olmadığını kontrol ederek ve tam kas gevşemesini sağlayarak cerrahi anestezi düzlemini onaylayın. Tüm adımlar tamamlanana kadar prosedür boyunca yeterli anestezinin sürdürülmesini sağlamak için refleksleri, solunumu ve genel yanıtı sürekli olarak izleyin.
   2. Fareyi, karnı yukarı bakacak, başı yukarıda ve kuyruğu 45°'lik bir açıyla indirecek şekilde küçük hayvan tutucunun üzerine yerleştirin. Farenin üst kesici dişlerinin etrafından dolaşmak, onları yukarı doğru çekmek için ince iplik kullanın ve ipliği hayvan tutucudaki bir vidaya sabitleyerek farenin ağız boşluğunun tam olarak açığa çıkmasını sağlayın.
   3. Soğuk ışık lambasını açın ve ışığı farenin boynunun derisine tutun. Farenin dilini çıkarmak için forseps kullanın ve glotis'i tamamen açığa çıkarın. Farenin ağız boşluğu içinde, farenin hava yolu açıklığının konumunu gösteren, tekrar eden bir açılma ve kapanma ışığı noktasını gözlemleyin.
   4. 18 G venöz kalıcı iğneyi fare trakeasına yerleştirin, iğne çekirdeğini dışarı çekin, pamuk ipliği venöz kalıcı iğnenin dış ucuna yerleştirin ve farenin göğüs hareketleriyle hareket eden pamuk ipliğini gözlemlerken başarıyı onaylayın.
   5. Önce 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 0.2 mL hava aspire edin, ardından 0.1 mL PM2.5 süspansiyonunu aspire edin, ardından 0.2 mL daha hava aspire edin. Karışımı 18 G venöz kalıcı iğneden trakeaya enjekte edin.
   6. 18 G venöz kalıcı iğneyi dışarı çekin. Hayvan tutucuyu dik olarak sabitleyin ve PM30 süspansiyonunu farenin ciğerlerine eşit olarak dağıtmak için saat yönünde ve saat yönünün tersine 2.5 kez çevirin. Ardından, farenin boynunu düz bir şekilde uzatın ve boğulmayı önlemek için yan yatırın.
4. Örneklerin toplanması
   NOT: Sonraki moleküler biyoloji analizleri için deneyin 29^{. gününde örnekleri} toplayın.
   1. Ötenazi sisteminin bağlantısını kontrol edin ve denetleyici gücünü açın. Karbondioksit (CO₂) tüp valfini açın.
      NOT: Hayvanları içine yerleştirmeden önce ötenazi odasını önceden doldurmayın.
   2. Fareleri hazneye yerleştirin ve CO_2'yi dakikada hazne hacminin %30-70'inde infüze edin. Fareleri 5 dakika boyunca CO_2'ye maruz bırakın, hareketsiz olduklarından, nefes almadıklarından ve genişlemiş göz bebeklerine sahip olduklarından emin olun. CO₂ silindir valfini kapatın ve ölümü doğrulamak için 5 dakika daha gözlemleyin.
   3. Ötenazi fareyi temiz bir diseksiyon tahtası üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Trakea, kalp ve akciğerleri açığa çıkarın.
   4. Ventral, torasik ve boyun bölgelerini kaplayan deri ve kasları çıkarmak için makas ve forseps kullanın. Kalbi ve akciğerleri içeren göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunun her iki yanındaki kaburgaların kenarları boyunca kesiler yapmak için makas ve forseps kullanın. Ardından, sol ve sağ akciğer loblarını iyice incelemek için yeterince geniş bir açıklık oluşturmak için köprücük kemiğini kesin.
   5. Sternum ve kaburgalardan çeneye uzanan boyun kaslarını çıkarın. Kaburgaların ön kenarının altına makas sokun ve trakeayı kaplayan kemikli kısmı çıkarmak için her iki tarafta kesiler yapın.
   6. Trakeayı çenenin yakınında forseps ile kavrayın ve forsepsin üzerine yerleştirilmiş makas kullanarak tam bir enine kesi yapın.
   7. Trakeayı forseps ile nazikçe yukarı çekin, tüm torasik doku vücuttan çıkarılana kadar ventral doku bağlantılarını makasla kesin.
   8. Akciğerleri tezgahın üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Akciğer dokusu yüzey kalıntısını tuzlu su ile durulayın, filtre kağıdı ile kurulayın, kriyotüplere alın ve -80 °C'de saklayın.
5. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)
   1. Sıvı nitrojen içeren bir harç kullanarak akciğer dokusunu toz haline getirin.
   2. Hassas bir terazi kullanarak 20 mg öğütülmüş dokuyu tartın, bir santrifüj tüpünde 750 μL Tampon RL ile birleştirin, bir vorteks karıştırıcı kullanarak iyice karıştırın ve 3 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin. Ardından, RT'de 5 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
   3. Genomik DNA (gDNA) filtre mini kolonunu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin. Süpernatanı gDNA filtre mini kolonuna aktarın ve RT'de 2 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
   4. gDNA filtresi mini sütununu atın. Süzüntüye eşit hacimde %70 etanol ekleyin ve 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   5. RNA mini kolonunu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin. Karışımın 750 μL'sini RNA mini kolonuna aktarın ve RT'de 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
   6. Süzüntüyü atın ve RNA mini kolonunu 2 mL toplama tüpüne geri yerleştirin. RNA mini kolonuna 500 μL Tampon RW1 ekleyin ve RT'de 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
   7. Süzüntüyü atın ve RNA mini kolonunu 2 mL toplama tüpüne geri yerleştirin. RNA mini kolonuna 500 μL Tampon RW2 ekleyin. RT'de 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   8. Süzüntüyü atın ve RNA mini kolonunu 2 mL toplama tüpüne geri yerleştirin. RT'de 2 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
   9. RNA mini kolonunu 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, kolon zarının merkezine 100 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve RT'de 2 dakika inkübe edin. Ardından, RT'de 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. RNA mini kolonunu atın ve RNA çözeltisini -80 °C'de saklayın.
   10. RNA çözeltisinden 2 μL alın ve konsantrasyonunu ve kalitesini belirlemek için ekipman kılavuzuna göre NanoDrop spektrofotometresini kullanarak ölçün.
       NOT: Çalışmada RNA kalite kontrolü için 260/280 ve 260/230 oranları seçilmiştir.
   11. Aşağıdaki bileşenleri bir mikrosantrifüj tüpüne sırayla ekleyerek RNA çözeltisini hazırlayın: 1 μg toplam RNA, 4 μL MgCl₂ (25 mM), 2 μL ters transkripsiyon 10x tampon, 2 μL dNTP karışımı (10 mM), 0.5 μL rekombinant ribonükleaz inhibitörü, 15 birim ters transkriptaz, 0.5 μg oligo(dT)₁₅ primer, ve 20 μL'ye Nükleaz İçermeyen Su ekleyin. Tüpün altındaki tüm sıvıyı toplamak için içeriği hafifçe karıştırın.
       NOT: Daha tutarlı cDNA sentezi ve RNA miktar tayini sağlamak için kokteyl çözeltileri hazırlanmalıdır.
   12. 20 μL RNA çözeltisini 42 °C'de 15 dakika inkübe ederek, 95 °C'de 5 dakika denatüre ederek ve ardından 4 °C'ye soğutarak ve ardından -20 °C'de depolayarak cDNA'ya ters transkribe edin.
   13. Reaksiyon sistemini hazırlamak için 6.4 μL damıtılmış su, 10 μL SYBR Green gerçek zamanlı PCR ana karışımı, 2 μL elde edilen cDNA çözeltisi, 0.8 μL ileri primer (10 μM) ve 0.8 μL ters primer (10 μM) birleştirin ve iyice karıştırın (Tablo 1).
   14. Hedef genler ve referans genler için döngü eşiği (CT) değerlerini elde etmek için reaksiyonu PCR cihazında çalıştırın.
       1. Her PCR döngüsünün başında ilk denatürasyonu 60 saniye boyunca 95 °C'ye ayarlayın.
       2. PCR döngüleri sırasında, 15 saniye boyunca 95 ° C'de denatürasyon, 15 saniye boyunca 60 ° C'de tavlama ve 45 saniye boyunca 72 ° C'de uzatma gerçekleştirin ve uzatma adımı sırasında veri toplayın. Toplam 40 PCR döngüsü gerçekleştirin.
       3. PCR döngülerini tamamladıktan sonra, PCR cihazını kullanarak erime eğrisi analizini otomatik olarak gerçekleştirin.
          NOT: Erime eğrisi çift tepe veya düzensiz tepe şekli gösteriyorsa, bu, deneyle ilgili bir sorun olabileceğini gösterir.
   15. ^2-ΔΔCT yöntemini kullanarak her bir hedef genin nispi ekspresyon seviyelerini belirleyin ve ardından daha fazla istatistiksel analiz yapın. ^2-ΔΔCT yöntemi için aşağıdaki formül listesini kullanın:
       ΔCT (test) = CT (hedef, test) - CT (referans, test)
       ΔCT (kalibratör) = CT (hedef, kalibratör) - CT (ref, kalibratör)
       ΔΔCT = ΔCT (test) -ΔCT (kalibratör)
       ^2-ΔΔCT = Gen ifadesindeki kat değişikliği

Gen adı	Sıra (5 ′ ila 3 ′)
Fare CCNA2 ileri	CCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Fare CCNA2 ters	TTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Fare ASPM ileri	CTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Fare ASPM ters	CCAGGCTTGAATCTTGCAG
Fare CCNB2 ileri	TTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Fare CCNB2 ters	CTGTTCAACATCAACCTCCC
Fare NUSAP1 ileri	CTCCCTCAAGTACAGTGACC
Fare NUSAP1 ters	TTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Fare CEP55 ileri	CCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
Fare CEP55 ters	AGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tablo 1: Kantitatif gerçek zamanlı PCR için asal diziler.

6. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)
   NOT: ELISA kitinin talimatlarına göre, ELISA kitini RT ile dengeleyin, bir yıkama tamponu hazırlayın ve standardı seyreltin. Önceden bir biyotinile antikor çalışma çözeltisi (1:100) hazırlamak için 90 μL konsantre biyotinile antikoru 8910 μL biyotinile antikor seyreltme tamponu ile seyreltin. Benzer şekilde, önceden bir enzim konjugat çalışma çözeltisi (1:100) hazırlamak için 90 μL konsantre enzim konjugatını 8910 μL enzim konjugat seyreltme tamponu ile seyreltin.
   1. Sıvı azot içeren bir harç kullanarak akciğer dokusunu toz haline getirin.
   2. Hassas bir terazi kullanarak 50 mg akciğer dokusunu tartın, bir öğütme tüpünde 1 mL PBS ile birleştirin ve buz üzerinde iyice öğütün.
   3. Karışımı 4 ° C'de, 3000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı bir örnek olarak toplayın.
   4. ELISA plakasının ilgili kuyucuklarına 100 μL numune/farklı konsantrasyonlarda standart yerleştirin, reaksiyon kuyularını yapışkan sızdırmazlık filmi ile örtün ve 37 °C'lik bir inkübatörde 90 dakika inkübe edin.
   5. ELISA plakasını 4 kez yıkamak için otomatik bir plaka yıkayıcı kullanın, her seferinde enjeksiyon ve aspirasyon arasında 30 sn aralıklarla 350 μL yıkama tamponu enjekte edin.
   6. Kuyucuk başına 100 μL biyotinile antikor çalışma solüsyonu ekleyin, kuyucukları yapışkan sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, daha önce açıklanan prosedürü izleyerek ELISA plakasını 4 kez yıkayın.
   7. Kuyucuk başına 100 μL enzim konjugat çalışma çözeltisi ekleyin, kuyucukları yapışkan sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, daha önce açıklanan prosedürü izleyerek ELISA plakasını 4 kez yıkayın.
   8. Oyuk başına 100 μL kromojenik ajan ekleyin, ışıktan koruyun ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 10-20 dakika inkübe edin. Ardından, oyuk başına 100 μL durdurma çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve optik yoğunluğu hemen 450 nm (OD₄₅₀) değerlerinde ölçün.
      NOT: Biyotinile antikor çalışma solüsyonunu, enzim konjugat çalışma solüsyonunu ve durdurma solüsyonunu eklemek için 8 kanallı bir pipet kullanılır, bu da eklemenin hızlı bir şekilde tamamlanmasını ve olası hataların önlenmesini sağlar.
   9. Her bir numune kuyucuğundaki hedef maddelerin konsantrasyonunu hesaplamak için CurveExpert yazılımını (http:// curveexpert.webhop.net/) kullanarak standart bir eğri oluşturun.
7. Batı lekeleme
   1. RIPA lizis tamponu, Fenilmetansülfonil florür (PMSF) ve fosfataz inhibitörünü 100:1:1 oranında karıştırarak radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) çözeltisini hazırlayın ve buzun üzerine yerleştirin.
   2. Sıvı azot içeren bir harç kullanarak akciğer dokularını toz haline getirin.
   3. Hassas bir terazi kullanarak 20 mg akciğer dokusunu doğru bir şekilde tartın ve 250 μL RIPA karışık çözeltisine ekleyin.
   4. Karışımı buz üzerinde 20 dakika inkübe edin, ardından 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı numune olarak toplayın.
   5. BCA kitinden Reaktif A ve Reaktif B'yi 50:1 oranında karıştırarak BCA çalışma çözeltisini hazırlayın.
      1. 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg / mL konsantrasyonlarda seyreltilmiş standart çözeltiler hazırlamak için standardı seyreltin. Her standart çözeltiden 20 μL ekleyin ve 96 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına numune alın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      2. Mikroplaka okuyucuyu kullanarak absorbansı 490 nm'de ölçün. Standart çözeltilerin konsantrasyonlarını ve absorbanslarını kullanarak standart eğriyi uygun hale getirin ve numune konsantrasyonunu²³ hesaplayın. RIPA karışık çözeltisini kullanarak numune konsantrasyonlarını aynı seviyeye ayarlayın.
   6. Protein süpernatanı bir santrifüj tüpünde 4: 1 oranında 5x yükleme tamponu ile karıştırın. Metal bir banyoda 5 dakika kaynatın, ardından 12.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
   7. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanarak protein ayrımı yapın ve proteinleri elektrikle bir poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın. PVDF membranını RT'de %5 yağsız sütle 1 saat bloke edin.
   8. PVDF membranını birincil antikor (1:1000 seyreltilmiş) ile 4 ° C'de 12 saat inkübe edin, ardından her biri 10 dakika boyunca TBST ile üç kez yıkayın ve daha sonra 2 saat boyunca RT'de ikincil antikor (1:5000 seyreltilmiş) ile inkübe edin.
   9. Tam otomatik bir elektrokemilüminesans immünoassay sistemi kullanarak hedef bantları tespit edin ve yerleşik yazılımı kullanarak kantitatif analiz gerçekleştirin.
8. İstatistiksel analiz
   1. İstatistiksel analiz için uygun yazılımları kullanın.
   2. Deneysel verileri ortalama ± standart sapma olarak sunun.
   3. Tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanarak anlamlılığı belirleyin.
   4. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Sonuçlar

GSE84884'daki 23348 genden (pSS) 2659 yukarı regüle gen ve 631 aşağı regüle gen dahil olmak üzere toplam 3290 DEG tanımlanmıştır (Şekil 1A). GSE51092 (pSS) için, 11409 genden, 667 yukarı regüle gen ve 587 aşağı regüle gen dahil olmak üzere toplam 3290 DEG tanımlanmıştır (Şekil 1B). GeneCards veritabanı, yumurtalık pSS ile ilgili 102 DEG elde etti ve tarama kriterlerinin korelasyon skoru ≥20 idi. GEO ...

Tartışmalar

pSS, esas olarak ekzokrin bezlerin invazyonu ile karakterize bir hastalık olarak kabul edilse de, ekstra bezlerin hasarı göz ardı edilemez²⁴. Akciğerler, pSS için bir hedef organı temsil eder ve akciğer tutulumu, tipik olarak bronşiyal mukozanın lenfositik infiltrasyonu ve pulmoner interstisyum^25'i içeren, pSS'nin yaygın bir salgı dışı belirtisidir. Araştırmalar, pSS hastalarının en az %20'sinin interstisyel akciğer has...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Color Prestained Protein Marker	Epizyme	WJ103	Western Blot
Antibody Dilution Buffer	Epizyme	PS119	Western Blot
BCA Protein Quantification Kit	Epizyme	ZJ101	Western Blot
Cytoscape 3.7.1 software	National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)	Version 3.7.1.	Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous Fluid	Epizyme	SQ203	Western Blot
Electrophoresis Buffer	Epizyme	PS105S	Western Blot
GraphPad Prism 10.0	GraphPad	Version 10.0	Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)	abclonal	AS014	Western Blot
JAK2 Antibody	Cell Signaling Technology	3230T	Western Blot
Mouse IL-1β ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0015	ELISA
Mouse IL-6 ELISA Kit	Beijing 4A Biotech Co., Ltd	CME0006	ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF102	Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) Antibody	Cell Signaling Technology	3776S	Western Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) Antibody	Cell Signaling Technology	9145S	Western Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)	Epizyme	GRF101	Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)	Epizyme	PS108	Western Blot
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Western Blot
R software	R Foundation for Statistical Computing	Not Applicable	Statistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation Assay	Epizyme	PC101	Western Blot
Reverse Transcription System	Promega	A3500	PCR
SDS-PAGE	Epizyme	LK303	Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)	Epizyme	LT103	Western Blot
STAT3 Antibody	Cell Signaling Technology	9139S	Western Blot
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	PCR
TBST (10×)	Epizyme	PS103	Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)	Epizyme	PS109	Western Blot
β-Actin Antibody	abclonal	AC026	Western Blot