Viral Olmayan Uyuyan Güzel Transpozon Sistemini Kullanarak Mantar Enfeksiyonlarını Hedefleyen Mühendislik Kimerik Antijen Reseptörü-Doğal Öldürücü Hücreler

Özet

Viral olmayan Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak mantar patojenlerini hedef alan kimerik antijen reseptörü-doğal öldürücü (CAR-NK) hücreleri üretmek için bir transfeksiyon protokolünün ana hatlarını çiziyoruz. Antijene özgü aktivasyonu değerlendirmek için, tasarlanmış hücreleri Aspergillus fumigatus germ tüpleri ile birlikte kültürledik ve IFN-γ sekresyonunu ölçtük.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR) bazlı hücre tedavileri, hematolojik malignitelerin tedavisinde etkileyici etkinlik göstermiştir. Son zamanlarda, bu tedaviler bulaşıcı hastalıklar için geliştirilmektedir, ancak mantar enfeksiyonlarını hedef alan çalışmalar azdır. Optimal hedefleri belirlemek ve hücresel ürünleri optimize etmek için, kimerik antijen reseptörü-doğal öldürücü (CAR-NK) hücreleri tasarlamak için bir yöntem geliştirdik ve mantarlar tarafından stimülasyona tepkilerini değerlendirdik. Bu makale, viral olmayan Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak mantar hedeflerine göre uyarlanmış CAR-NK hücreleri üretmek için basit ve sağlam bir yöntemi açıklamaktadır. NK-92 hücreleri, plazmid kodlu bir CAR transpozonu ile birlikte mini daire DNA (MC) olarak vektörize edilmiş hiperaktif transpozaz SB100X ile transfekte edilir. Transfeksiyon etkinliği 1 hafta sonra akış sitometrik analizi kullanılarak değerlendirilir. Fonksiyonel testten önce, transgeni eksprese eden hücreler, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir ve 1 hafta daha kültürlenir. Antijene özgü aktivasyonu değerlendirmek için, tasarlanmış hücreler en az 6 saat boyunca Aspergillus fumigatus germ tüpleri ile birlikte kültürlenir. Daha sonra, salgılanan interferon-gama (IFN-γ) konsantrasyonu, enzime bağlı bir immünosorbent testi kullanılarak ölçülür.

Giriş

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) her yerde bulunan bir mantardır ve ortalama bir insan günlük olarak 100 ila 1.000 conidia solumaktadır¹. Kemoterapi gören veya lösemiden muzdarip olanlar gibi edinilmiş veya konjenital immün yetmezlikleri olan hastalarda, A. fumigatus ciddi invaziv apsergilloza neden olabilir. Her yıl dünya çapında 200.000'den fazla insan aspergilloza yakalanmaktadır. Azol türevleri ile korunma ve tedavi için antimikotik kullanımına rağmen, mortalite oranı %30 ile %95 arasında ^{kalmaktadır2,3}. Ek olarak, tedavinin önemli yan etkileri vardır ve A. fumigatus kültürlerinin %7'si zaten azole dirençlidir⁴.

Kimerik antijen reseptörü (CAR) ile tasarlanmış T hücreleri ile tedavi, malign hastalıkların tedavisinde klinik başarı göstermiştir ve invaziv aspergilloz 5,6,7,8 gibi bulaşıcı hastalıklarla mücadelede umut verici klinik öncesi sonuçlar elde etmiştir. A. fumigatus hyphae'nin hücre duvarındaki bir proteini hedef alan daha önce tarif edilen Af-CAR-T hücreleri, klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar göstermiştir⁶.

Graft versus host hastalığı, sitokin salınım sendromu ve nörotoksisite riskinin azalması, CAR-NK hücrelerini akut enfeksiyonlar için "kullanıma hazır" bir tedavi olarak CAR-T hücrelerine değerli bir alternatif haline getirir⁹. Ek olarak, NK hücrelerinin antifungal bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. A. fumigatus ile uyarıldığında, NK hücreleri IFN-ɣ gibi sitokinler ve CCL-3 ve CCL-4 gibi kemokinler salgılar ve sitotoksik granüller salgılar^10,11.

NK-92 hücre hattı, genetik mühendisliği için popüler bir NK hücresi kaynağıdır ve nispeten basit kültür koşullarında hızlı çoğalma ve genişleme avantajı sunar¹². Birkaç klinik öncesi çalışma, hem hematolojik hem de katı tümörlerin tedavisinde CAR ile dönüştürülmüş NK-92 hücrelerinin terapötik potansiyelini göstermiştir. Güvenliklerini, etkinliklerini ve "kullanıma hazır" hücresel tedavi olarak potansiyel kullanımlarını araştırmak için çok sayıda klinik çalışma devam etmektedir¹³.

NK hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği ve stabil transgen ekspresyonu elde etmek zordur. Viral yöntemler yüksek verimlilik vaat ederken, sonraki onkogenez ile birlikte yerleştirme mutasyonları riski taşırlar ^9,14. En yeni nesil Uyuyan Güzel (SB) transpozon vektörleri, viral ve geçici viral olmayan gen verme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelerek, kararlı gen transferi için güvenli, güçlü ve ekonomik olarak uygulanabilir bir sistem sunar¹⁵.

Bu nedenle, bu protokol, yaşamı tehdit eden invaziv aspergillozlu hastalar için potansiyel olarak "kullanıma hazır" bir terapötik seçenek olarak hizmet edebilecek Af-CAR-NK-92 hücrelerinin üretilmesi için yeni bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Bu yaklaşımın etkinliği, A. fumigatus hyphae ile stimülasyon üzerine IFN-ɣ üretiminin artmasıyla örneklenmiştir.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneyler steril koşullar altında yapılmalıdır. Bu protokolde iki koşul gösteriyoruz: (I) Kontrol görevi görecek DNA'sız sahte transfeksiyon ve (II) daha önce açıklanan Af-CAR⁶ kullanılarak CAR transfeksiyonu. Af-CAR plazmidi, bir transfeksiyon markörü olarak kullanılacak olan CAR'ın aşağı akışında kesilmiş bir epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFRt) dizisi içerir (Ek Şekil S1). Her koşul için 4 × 10⁶ NK-92 hücresi gereklidir.

1. NK-92 hücrelerinin kültürlenmesi

1. Transfeksiyondan bir veya iki gün önce, aşağıdaki bileşime sahip taze hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 75 (h / h) alfa-MEM Ortamı (nükleositlerle) +% 12.5 (h / h) ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) +% 12.5 (h / h) ısıyla inaktive edilmiş at serumu + 2 mM L-glutamin.
2. 5 × 10⁵ 5 hücre / mL hücre yoğunluğunda en az^{10 7} NK-92 hücresini yeniden askıya alın.
3. 150 UI / mL'lik bir konsantrasyonda hücre süspansiyonuna IL-2 ekleyin.
4. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültürleyin.
   NOT: IL-2, 5 ng/mL'lik bir nihai konsantrasyonda kullanılabilir.

2. Viral olmayan transfeksiyon

1. Mikroskop altında hücrelerin kalitesini kontrol edin. Hücre kümelerinin askıya alınması ve net bir arka plan, sağlıklı bir hücre kültürünü gösterir.
2. 6 oyuklu bir plakada, her koşul için oyuk başına 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Plakayı% 5 CO₂ ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin.
   NOT: Antibiyotikler, transfeksiyondan sonra hücre canlılığını azaltabilir. Ortamı antibiyotiksiz tutun.
3. Hücreleri sayın ve kullanarak hücre canlılığını kontrol edin (örneğin, Tripan Mavisi boyama).
4. 8 × 10⁶ NK-92 hücresini 15 mL konik tabanlı bir tüpe aktarın. 200 × g'da 5 dakika boyunca 3 hızlanma ve yavaşlama ile santrifüjleyin. Aşağıdaki tüm santrifüj adımları için bu programı kullanın.
5. Santrifüjleme sırasında iki adet 1.5 mL reaksiyon tüpü hazırlayın. Af-CAR için DNA'yı (8 μg Plazmid-DNA ve 4 μg SB100X Mini Daire, Tablo 1) tüplerden birine pipetleyin. İkincisini Mock kontrolü olması için DNA'sız tutun.
6. Santrifüj hazır olduğunda, süpernatanı nazikçe atın ve hücreleri içeren tüpü 15 mL'ye kadar önceden ısıtılmış Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile doldurun.
7. Santrifüj (aşama 2.4).
8. Santrifüjleme sırasında, her tüpe 3 mL elektrolitik tampon ekleyerek her koşul için bir transfeksiyon sistemi tüpü hazırlayın. İlk tüpü pipet istasyonuna yerleştirin.
9. Santrifüj hazır olduğunda, süpernatanı nazikçe atın ve hücre peletini 200 μL yeniden süspansiyon tamponunda (100 μL / 4 × 10⁶ hücre) yeniden süspanse edin.
   NOT: Hücreleri 15-30 dakikadan fazla yeniden süspansiyon tamponunda bırakmaktan kaçının, çünkü bu hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini düşürür.
10. İki reaksiyon tüpünün her birine 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Yavaşça karıştırın.
    NOT: Hava kabarcıkları hücre ölümüne yol açan ark oluşumuna neden olduğundan, pipetleme sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
11. İlk reaksiyon tüpünden gelen DNA hücresi karışımını transfeksiyon sistemi pipeti ile pipetleyin ve pipeti pipet istasyonuna yerleştirilen tüpe dikey olarak yerleştirin.
    NOT: Ucun düzgün şekilde oturduğundan emin olun.
12. İlk darbeyi 1.650 V'a ve darbe süresini 20 ms'ye ayarlayın ve Başlat'a basın.
13. Tamamlandıktan sonra, ikinci darbeyi 500 V'a ve darbe süresini 100 ms'ye ayarlayın. Başlat'a basın.
14. Tamamlandıktan sonra, pipeti pipet istasyonundan yavaşça çıkarın ve hücreleri hemen 2 mL önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı içeren hazırlanmış kültür plakasının bir kuyucuğuna aktarın (bkz. adım 2.2). Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için plakayı yavaşça dairesel olarak hareket ettirin.
15. Sahte numune için, DNA'sız reaksiyon tüpünden 100 μL hücre süspansiyonu alın (bkz. adım 2.9) ve yeni bir tüp ve yeni bir pipet ucu kullanarak aynı prosedürü adım 2.11'den adım 2.14'e kadar tekrarlayın.
16. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
17. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, 150 UI / mL'lik bir son konsantrasyonda IL-2 ekleyin.

3. Akış sitometrisi kullanarak transfeksiyon verimliliğinin kontrol edilmesi

1. Hücreleri her iki günde bir 1 hafta yetiştirdikten ve böldükten sonra, her koşuldan 1-5 × 10⁵ hücreyi polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe alın.
2. 1 mL tampon ekleyerek hücreleri yıkayın (PBS +% 0.5 (h / h) FBS + 2 mM EDTA); Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
3. Hücre peletini 50 μL tamponda yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri tespit etmek için 1 μL 7-AAD ekleyin.
4. Transfekte edilmiş hücreleri boyamak için 5 μL anti-tEGFR-Alexa fluor 647 antikoru ekleyin.
5. 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
6. Hücreleri yıkayın (bkz. adım 3.2).
7. Hücre peletini 200 μL tampon içinde yeniden süspanse edin.
8. Numuneleri bir akış sitometresinde ölçün.
   NOT: Transfeksiyon verimliliği tatmin edici değilse, transgen eksprese eden hücrelerin zenginleştirilmesine devam edin.

4. Manyetik ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) ile transgen eksprese eden hücrelerin zenginleştirilmesi

NOT: En iyi sonuçlar için protokolü 8-10 × 10⁶ hücre ile başlatın. Tüm santrifüjleme adımları 4 °C'de gerçekleştirilir.

1. Arabelleği adım 3.2'de açıklandığı gibi hazırlayın. Hücreleri 1-2 × 10⁶/100 μL konsantrasyonda 15 mL'lik konik bir alt tüpte tampon ile seyreltin.
2. 1-2 × 10⁶ hücre başına 1 μL anti-EGFRt-biyotin ekleyin ve eşit dağılmış bir çözelti sağlamak için tüpü hafifçe döndürün.
3. 4 ° C'de 25 dakika inkübe edin, ardından tüpü 10 mL'ye kadar tamponla doldurun.
4. Merkezkaç. Süpernatanı atın.
5. 8 μL/1 × 10⁶ hücreli soğuk tampon ekleyin.
6. 1 × 10⁶ hücre başına 2 μL anti-biyotin manyetik boncuk ekleyin.
7. 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
8. 10 mL'ye kadar tampon ile doldurarak yıkayın.
9. Merkezkaç. Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL tamponda yeniden süspanse edin.
10. MACS mıknatısına bir LS sütunu yerleştirin ve 3 mL tampon ile yıkayın.
11. Tampon sütundan tamamen geçer geçmez, hücre süspansiyonunu ekleyin.
12. Her biri 3 mL tampon ile sütunu 3x yıkayın.
13. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mL'lik temiz bir konik alt boruya yerleştirin.
14. Sütuna 5 mL tampon ekleyin. Pistonu kullanarak EGFR pozitif hücreleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın.
15. Hücreleri birkaç gün kültürleyin; Ardından, akış sitometrisi ile verimliliği kontrol edin.

5. Fonksiyonel test

NOT: Yaklaşan deney için aşağıdaki ortamı hazırlayın ve kullanın: RPMI + %20 FBS.

1. 1. Gün - Aspergillus fumigatus conidia'nın tohumlanması
   1. Ortamda 2.5 × 10⁵ conidium / mL konsantrasyonda bir A. fumigatus conidia süspansiyonu hazırlayın.
   2. 96 oyuklu bir kültür plakasında, oyuk başına 100 μL conidia süspansiyonu pipetleyin ve 25 ° C'de 16 saat inkübe edin.
      NOT: Kuluçka döneminden sonra conidia filizlenecektir (Şekil 1).
2. 2. Gün - CAR NK-92 hücreleri ile ko-kültür
   1. Mock ve Af-CAR NK-92 hücrelerini ortamla 2 kez yıkayın.
   2. Kuyucuk başına 100 μL ortama 5 × 10⁴ hücre ekleyerek 2: 1'lik bir efektör-hedef oranında mantar ile ko-kültür (Şekil 2).
   3. Pozitif kontrol için, 100 μL ortamda oyuk başına 1 ng PMA ve 100 ng iyonomisin ekleyin. Ortamdaki hücreleri yalnızca negatif kontrol olarak kullanın.
   4. Plakayı 37 ° C'de nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatörde en az 6 saat inkübe edin.
   5. Plakayı 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   6. Her kuyudan 100 μL hasat edin; Tabana dokunmaktan kaçının. Süpernatanları reaksiyon tüplerine aktarın.
      NOT: Yetişen mantarın değil, yalnızca süpernatantın pipetlendiğinden emin olun. Şüpheniz varsa, başka bir santrifüjleme adımı ekleyin.
   7. Üreticinin talimatlarına göre IFN-ɣ ELISA gerçekleştirin veya s'de saklayınamples kullanana kadar -80 °C'de.

Sonuçlar

Transfeksiyon, geri kazanım, zenginleştirme ve genişletme dahil olmak üzere Af-CAR NK-92 hücrelerinin üretilmesi sürecinin tamamı yaklaşık 14 gün sürer. Transfeksiyondan sonra, hücreler kültürlenir ve her iki günde bir bölünür. Transfeksiyondan iki gün sonraki ilk bölünme sırasında hücre canlılığı azalabilir. Tipik olarak, hücreler transfeksiyondan 4 gün sonra iyileşir ve 48 saatlik bir ikiye katlama süresiyle çoğalmaya başlar.

Tartışmalar

Sağlanan protokol, viral olmayan Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak mantar patojenlerini hedef alan CAR-NK hücreleri oluşturmak için basit ve güvenilir bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha ileri analizler için gerekli miktarları elde etmek için hücrelerin genişlemesini sağlayan büyük transgenlerin kararlı ve kalıcı olarak yerleştirilmesine izin verir^14,16.

Hücre sayısı ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ML conical bottom tubes	Greiner Bio-One	188271	PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE
50 ML conical bottom tubes	Greiner Bio-One	227270	PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE
6-and 96-Well- Cell culture plate	Corning Inc. LifeSciences	83-3736/ 83-3474	TC-treated Multiple Well Plates, Flat bottoms, Treated for optimal cell attachment, Sterilized by gamma irradiation, Nonpyrogenic
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559925	eady-to-use nucleic acid dye for the exclusion of nonviable cells in flow cytometric assays
Alexa Fluor 647 anti-human EGFR Antibody	Biolegend	352918	Clone AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure	Miltenyi Biotec	130-105-637	UltraPure MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies
Aspergillus fumigatus	ATCC	46645
Biosphere Filter Tips (20 and 100 μL)	Sarstedt	70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin, tested
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γ	Biolegend	430104
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	for molecular biology, 0.5 M in H2O, DNase, RNase, NICKase and protease, none detected, 0.2 μm filtered.
FACS clean	BD Biosciences	340345
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003
FACS Rinse Solution	BD Bioscience	340346
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	sterile-filtered, suitable for cell culture, heat inactivated before use
Gibco, MEM α, nucleosides	Thermofisher Scientific	22571020	Phenol Red, Ribonucleosides, Deoxyribonucleosides, Sodium Bicarbonate
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	16050122	Sterile-filtered, heat inactivated before use
Human IL-2 IS, research grade	Miltenyi Biotec	130-097-742	Research grade. The ED50 is ≤0.3 ng/mL, corresponding to an activity of ≥3 × 106 IU/mg.
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	from Streptomyces conglobatus, used as positive control for cytokine secretion
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	W368401	For cell culture
MACS LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401	Columns and plungers, sterile packed
NK-92	DSMZ	ACC 488
Neon Transfektionssystem 100 μL-Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Resuspension Buffer R, Electrolytic Buffer E2, 100 μL Neon Tips, Neon Electroporation Tubes
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	used as positive control for cytokine secretion
Polystyrene round-bottom tube, 5 mL	BD Bioscience	S-452400	used for flow cytometry
Reaction tube, 1.5 ML	Greiner Bio-One	7,26,90,001	PP, transparent, cap attached, with injected graduation. Sterilized before use.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	72400021	GlutaMax I,  Phenol Red, HEPES, Sterile-filtered
TipOne 1000 μL XL Graduated Filter Tip	StarLab	S1122-1730
Equipment
BD FACSCalibur	BD Bioscience
CO2 Incubator C60	Labotect
Heraeus Multifuge 3SR	Thermo Scientific
HydroFLEX microplate washer	Tecan
NanoQuant Infinite M200 Pro	Tecan
Neon Transfection System	Invitrogen
Pipettes	Eppendorf
Quadro MACS Separator	Miltenyi Biotec