FLICK Testi Kullanılarak İlaç Yanıtının Kapsamlı Analizi

Özet

Bu protokol, ilaca bağlı büyüme oranlarını ve ölüm oranlarını hesaplamak ve ilaca bağlı hücre ölümü mekanizmasını değerlendirmek için bu testin kullanımına ilişkin ayrıntılı talimatlar da dahil olmak üzere, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için FLICK testinin nasıl kullanılacağını açıklar.

Özet

İlaç etkinliğini anlamak için, ilaca bağlı hücre ölümünün derecesini karakterize etmek kritik bir ihtiyaçtır. İlaca bağlı hücre ölümünün seviyesini ölçme çabaları, her biri kendi aktivasyon zamanlaması ve biyokimyasal ayırt edici özelliklere sahip, moleküler olarak farklı düzenlenmiş ölüm formlarının varlığıyla karşı karşıyadır. Ayrıca, bazı nekrotik ölüm alt tipleri için, ayırt edici özellikler sadece geçici olarak gözlenir ve hücre yırtılması nedeniyle hızla kaybolur. Bu nedenle, ölüm yoluna özgü tahlillerin bir kombinasyonunu kullanırken bile, toplam hücre ölümü miktarını veya her bir ölüm alt tipinin nispi katkılarını doğru bir şekilde ölçmek zordur. Diğer bir konu, ölüme özgü birçok tahlilin, ilaçların hücre çoğalmasını nasıl etkilediğini göz ardı etmesi ve ilaçla tedavi edilen bir popülasyonun genişleyip genişlemediğini yorumlamayı zorlaştırmasıdır. FLICK testi, stimülasyonu takiben toplam hücre ölümü seviyesinin, ölüme özgü bir şekilde ölçülmesine izin verir, ancak aynı zamanda aktive edilen ölüm tür(ler)ine büyük ölçüde agnostiktir. Ek olarak, FLICK testi, toplam popülasyon büyüklüğü ve hücre çoğalma hızı hakkındaki bilgileri tutar. Bu yazıda, FLICK testinin temel kullanımını, farklı biyolojik materyal türleri kullanılırken bu testin nasıl giderileceğini ve her bir hücre ölümü tipinin gözlemlenen bir ilaç tepkisine katkılarını ölçmek için FLICK testinin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Giriş

Anti-kanser ilaçları için, ilaç duyarlılığının klinik öncesi değerlendirmesi genellikle ilaçların kültür^1'deki hücrelerin canlılığını nasıl etkilediğinin test edilmesini içerir. İlaca maruz kalmayı takiben hücre canlılığı, en az iki ayrı etkinin bir ürünüdür: hücre proliferasyonunun ilaca bağlı inhibisyonu ve hücre ölümünün aktivasyonu². Ne yazık ki, hücre ölümü kalıcı ilaç yanıtları için gerekli olan kritik bir özellik olmasına rağmen, standart yaklaşımlar bir ilacın hücre ölümünü ne derece aktive ettiğini netleştirmekte başarısız olmaktadır³.

Yaygın ilaç yanıtı tahlilleri, hücreleri doğrudan sayanları (örneğin, Coulter Counter, akış sitometrisi veya mikroskopinin bazı kullanımları), hücrelerin çoğalma yeteneğini ölçenleri (örneğin, koloni oluşumu deneyi) veya bir metabolik aktiviteyi ölçenleri (örneğin, CellTiter-Glo, tetrazolyum bazlı MTT veya MTS tahlilleri). Bu tahlillerin ortak bir özelliği, üretilen verilerin canlı hücre sayısı ile orantılı olmasıdır. İlaçlar, büyüme inhibisyonunu ve hücre ölümünü nasıl koordine ettikleri konusunda önemli ölçüde farklılık gösterdiğinden, ilaca maruz kalmayı takiben canlı hücrelerin sayısı, ilaca bağlı hücre ölümünün seviyesi hakkında güvenilmez bir fikir verir³. Ayrıca, kanser hücreleri genellikle hücre kültüründe hızla çoğaldığından, canlı hücrelerin sayısı, herhangi bir^{hücre ölümüne} neden olmadan tedavi edilmeyen popülasyona göre önemli ölçüde azaltılabilir4. Bu nedenle, merkezi bir kusur, hücre ölümünün derecesinin hem canlı hem de ölü hücrelerin sayısını ölçmeden ölçülememesidir.

İlaca maruz kaldıktan sonra ölü hücrelerin sayısını ölçmek, birkaç nedenden dolayı doğru bir şekilde yapmak zordur². İlk olarak, bir düzineden fazla düzenlenmiş hücre ölüm yolu mevcuttur 5,6,7,8. Her bir düzenlenmiş hücre ölümü tipini tanımlamak için genellikle biyokimyasal belirteçler mevcut olsa da, bu belirteçler özgüllüklerine göre değişir ve tüm ölüm alt tiplerini aynı anda ölçmek için tek bir test kullanılamaz. İkinci olarak, her bir hücre ölümü formu için aktivasyon zamanlaması, bağlama bağlı olarak oldukça dramatik bir şekilde değişebilir, bu nedenle ölüm zaman içinde nicelleştirilmedikçe tam bir resim ortaya çıkamaz ^9,10. Hücre ölümünü ölçmek için yapılan birçok biyokimyasal tahlil, bir son nokta ölçümü üretir, bu nedenle kinetik veri üretmek zor olabilir ve maliyetle sınırlı olabilir. Üçüncü bir komplikasyon, ölü hücrenin kendisinin, canlı hücre durumu ile ayrışmış hücre kalıntıları arasında geçici bir ara durum olmasıdır. Ölü hücrelerin stabilitesi, ölüm alt tipine bağlı olarak değişir, apoptoz gibi bazı türler nispeten kararlı cesetler oluştururken, diğer ölüm türleri hızlı parçalanmaya neden olur. Bu nedenle, ölü hücrelerin toplanmasını ve sayılmasını gerektiren ölümü ölçme yöntemleri de hücre ölümünün önyargılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. Son olarak, dördüncü bir sınırlama, hücre ölümünün derecesini ölçen biyokimyasal tahlillerin tipik olarak bir ilacın proliferasyonu nasıl değiştirdiğine dair herhangi bir içgörü sağlayamamasıdır. Bu nedenle, genel nüfus büyüklüğü - ve daha da önemlisi, nüfusun genişleyip genişlemediği - yorumlanamaz.

STACK ve SPARKL gibi bazı mikroskopi tabanlı tahliller, zaman içinde canlı ve ölü hücreleri ölçmede etkilidir ve bu tahliller, ilaca bağlı hücre ölümü hakkında kapsamlı bilgiler üretebilir^10,11. Bununla birlikte, bu tahliller, Incucyte mikroskobu gibi özel araçlar gerektirir ve bu da verimde ve bu yaklaşımlara erişimde sınırlamalar yaratır. Ek olarak, mikroskopi tabanlı teknikler, ölü hücrelerin deney süresi boyunca mikroskobun odak düzleminde kalmasını gerektirir, bu da ölü hücrelerin plakadan yapışkanlığını kaybettiğinde veya ölü hücreler çürüdükçe zamanla nicelleştirilmesini sağlama yeteneğini tehlikeye atar. Benzer şekilde, mikroskopi bazlı tahliller, hücreler belirli bir odak düzleminin içine ve dışına sürüklendikçe, süspansiyon kültürleri bağlamında uygulandığında zorluklarla karşı karşıyadır.

Yukarıda vurgulanan sorunları ele almak için, FLICK (Hücre Ölümü Kinetiğinin Floresan Tabanlı ve Lizise Bağlı Çıkarımı)^12,13 adlı bir test oluşturduk. FLICK testinin amacı, hücrelerin nasıl öldüğüne bakılmaksızın, ilaca bağlı hücre ölümünün seviyesini belirlemektir. FLICK yöntemi, floresansı DNA bağlanmasına bağlı olan hücre geçirimsiz boyalar kullanır. FLICK'in önemli bir özelliği, erişilebilir DNA'ları sayesinde zaman içinde ölü hücre birikimini etiketlemek için bu floroforların kullanılması ve ardından testin sonunda herhangi bir canlı hücreye nüfuz etmek için mekanik deterjan bazlı bir lizisin kullanılmasıdır. Bu veriler, matematiksel modelleme ile birleştirildiğinde, hem canlı hem de ölü hücre popülasyonlarının sürekli zamansal çözünürlükle ve ölü hücrelerin toplanmasını veya işlenmesini gerektirmeden nicelleştirilmesini sağlar. Ayrıca, ölü hücre floresansını değerlendirmek için bir plaka okuyucunun kullanılması, ölü hücrelerin bozulmadan kalmasına gerek kalmadan ölü hücrelerin değerlendirilmesine izin verir, böylece hücre yırtılması ile sonuçlanan nekrotik ölüm biçimlerine karşı bir önyargıyı hafifletir. Son olarak, FLICK testi minimum plaka kullanımı gerektirir ve hızlı bir şekilde kinetik ölçümler üreterek yüksek verimli ilaç taramasına olanak tanır. Bu protokolde, ilaca bağlı büyüme oranını, ölüm oranını ve/veya hücre ölümü mekanizmalarını çıkarmak için FLICK'in nasıl kullanılacağı da dahil olmak üzere FLICK testinin kullanımına odaklanıyoruz.

Protokol

1. İlgilenilen her hücre hattı için geçirgenlik süresinin optimizasyonu

NOT: Açıklanan hacimler ve miktarlar bir hücre satırını optimize etmek içindir. Bu değerler, test edilecek hücre satırlarının sayısına göre ölçeklendirilmelidir.

1. 96 oyuklu, optik tabanlı, siyah duvarlı bir plakanın her bir oyuğuna istenen sayıda hücre yerleştirin. 100 μL tam ortam ekleyin ve hücrelerin gece boyunca plakaya yapışmasına izin verin.
   NOT: Kaplanmış hücre sayısı, hücrelerin büyüme hızı, optimal yoğunluklar ve testin uzunluğu dikkate alınarak optimize edilmelidir. 72 saat boyunca ölçülen yapışık kanser hücre hatları için tipik başlangıç hücre sayıları, kuyu başına 1500 - 5000 hücredir. Örneğin, U2OS hücreleri, %10 FBS, 2 mM glutamin ve %1 Pen-Strep ile DMEM'de oyuk başına 2000 hücrede kaplanabilir ve standart koşullarda (%5 CO₂, 37 ° C, nem ile) gece boyunca kültürlenebilir.
2. 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1,5 mL'lik %1,5'lik bir Triton-X çözeltisi hazırlayın. %1,5 Triton-X solüsyonunu maksimum hızda 5 saniye boyunca vorteksleyin. En az 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
3. Triton-X'in birkaç saniye girdaplama yoluyla tamamen çözündüğünden emin olmak için çözeltiyi görsel olarak inceleyin. Çözeltinin homojen olduğundan emin olun.
4. Kaplanmış hücrelerin her bir oyuğuna 10 μL% 1.5 Triton-X çözeltisi ekleyin. Karıştırmayın.
   NOT: Bu aşamada, kabarcık oluşumu nedeniyle tekrarlanan pipetleme kullanılarak karıştırılması istenmez.
5. Hücreleri en az 1 saat boyunca nem hücre kültürü inkübatörü ile% 5 CO₂, 37 ° C'ye geri döndürün.
   NOT: Triton-X çözeltisinin uygulanmasından sonra, çoğu hücre hattı 2-3 saat içinde tamamen parçalanır. SYTOX Green gibi boyalar kullanıldığında 24 saate kadar beklemenin floresan sinyali üzerinde minimum etkisi vardır. Triton-X yüzdesinin arttırılması, parçalanması zor hücre hatları için inkübasyon süresini kısaltabilir.
6. 10x objektif kullanarak bir ışık mikroskobunda hücre morfolojilerini gözlemleyin. Hücre gövdeleri artık görünmeyene kadar hücreleri saatte bir inceleyin. Hücre geçirgenliği için gereken süreyi kaydedin.
   NOT: Bir floresan mikroskobu mevcutsa, lizis, SYTOX Green gibi hücre geçirimsiz bir DNA boyası kullanılarak görüntülenebilir. Boya, Triton-X çözeltisine 10x nihai konsantrasyonda eklenebilir ve geçirgenlik, floresan mikroskobu ile doğrulanabilir.

2. DNA boyasının seçimi ve kalibrasyonu

NOT: FLICK testi için bir gereklilik, DNA bağlanmasına bağlı bir şekilde bir sinyal yayan, hücre canlılığını etkilemeyen ve hücre sayısı ile doğrusal olarak ölçeklenen bir sinyal üreten hücre tarafından zorunlu kılınmış bir floroforun kullanılmasıdır. Bu protokol SYTOX Green kullanır. Benzer özelliklere sahip diğer boyalar da FLICK testi için uygun olabilir, ancak bunların her biri değerlendirilmeli ve kalibre edilmelidir. Örnekler için Tablo 1'e bakın.

1. Seçilen DNA boyası için, üreticinin tavsiyesine göre test edilecek konsantrasyon aralığını belirleyin.
2. Test edilecek her konsantrasyon için, 180 μL hücre kültürü ortamında 40.000 hücreyi, 96 oyuklu, optik altlı, siyah duvarlı bir plakanın en sol sütunu boyunca üç kopya halinde plakalayın. Kalan kuyucuklara 90 μL ortam ekleyin.
   NOT: Bu, plakanın sıraları boyunca doğrusal bir hücre titrasyonu oluşturmak için kullanılacaktır. İlk kuyuların nihai konsantrasyonu 20.000 hücre / kuyu olacaktır. Kuyunun üstünden floresan okuyan plaka okuyucular için optik alt plakalar gerekli değildir. Hücre kültürü ortamı, test edilen hücreleri büyütmek için kullanılan ortamla aynı olmalıdır. Örneğin, U2OS hücreleri kullanılıyorsa, 40.000 hücre 180 μL DMEM'de yeniden süspanse edilmelidir.
3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 90 μL'yi en soldaki sütundan sağdaki bitişik sütuna aktararak 1:2 seri seyreltme oluşturun. Karıştırmak için 15x pipetleyin.
4. İkinci sütundan üçüncü sütuna, ardından üçüncü sütundan dördüncü sütuna geçerek 2.3 adımını tekrarlayın ve bu şekilde devam edin. Plakanın ikinci ila son sütununda titrasyonu bitirin. Hücre kültürü ortamının arka plan sinyalinin elde edilebilmesi için son sütunu hücreler olmadan bırakın.
5. Sondan ikinci sütun için, 90 μL'yi çıkarın, böylece tüm oyuklar çeşitli sayıda hücre içeren 90 μL ortama sahip olur. Hücrelerin 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe 6 saat boyunca yapışmasına izin verin.
6. Test edilecek her bir boya konsantrasyonu için 10x'lik bir DNA boyası çözeltisi hazırlayın ve DNA boyası, ilgilenilen hücrelerin kültürlenmesi için kullanılan tam büyüme ortamına seyreltilir. Adım 1'de açıklandığı gibi PBS'de 1,5 mL'lik %1,5 Triton-X çözeltisi hazırlayın.
7. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 10x DNA boyasından 10 μL ekleyin. Hücrelere nüfuz etmek için her oyuğa 10 μL% 1.5 Triton-X çözeltisi ekleyin. Hücreleri bu çözeltide, adım 1'de belirlenen en uygun süre boyunca inkübe edin.
   NOT: Triton-X'in eklenmesinden sonra, DNA boyasının nihai konsantrasyonu 1x'ten biraz daha azdır, ancak bu önemsizdir. İnkübasyondan sonra, tüm plaka parçalanmalıdır. Manuel hücre titrasyonu, optimal DNA boya konsantrasyonunu ve floresan elde etmek için en uygun ayarları belirlemek için kullanılacaktır.
8. Hücre titrasyon plakası boyunca floresan yoğunluklarını ölçün. DNA boyasının üreticisi tarafından belirtildiği gibi bir dizi edinim ayarında floresan miktarını belirleyin. Kullanılan plaka okuyucuya bağlı olarak, uyarma ve emisyon dalga boylarını ve/veya dijital kazancı değiştirin.
9. Hücre içermeyen sütunun ortalama sinyalini çıkararak her ölçümden arka plan sinyalini kaldırın. Bu değerler, seri seyreltme plakasındaki kuyucukların en sağdaki sütununda bulunabilir.
10. Her bir edinim ayarı için her bir DNA boya konsantrasyonunun doğrusallığını belirleyin. Doğrusallık, hücre numarasının floresan sinyaline karşı grafiği çizilerek ve doğrusal regresyon gerçekleştirilerek belirlenebilir. Belirleme katsayısı (r²), floresan sinyalinin hücre sayısı ile doğrusal olarak ilişkili olma derecesini bildirir.
11. En iyi doğrusallık ve dinamik aralık kombinasyonuna sahip olan alım ayarlarını ve DNA boya konsantrasyonunu seçin.
    NOT: 0 ile 20.000 hücre arasındaki tüm hücre numaraları aralığını göz önünde bulundurun. Kazanç ve DNA boya konsantrasyonunun, 0 ile 1000 hücre arasında, düşük hücre sayılarında doğrusal olduğundan emin olun. Birkaç cihaz ayarı veya DNA boya konsantrasyonları, tüm aralık boyunca güçlü bir korelasyon sağlayabilir. Bununla birlikte, ölü hücrelerdeki küçük değişikliklerin doğru bir şekilde ölçülebilmesi için alt uç hassasiyetinin sağlam olması önemlidir.

3. İlaçla tedavi edilen plakalarda hücre kaplama, kuyu içi ilaç uygulaması ve zaman içinde ölü hücre floresan ölçümü

NOT: İlaç seyreltme plakaları, deneysel ihtiyaçlara göre esnek bir şekilde tasarlanabilir. Genel olarak, ilaç seyreltme plakaları, bir veya birkaç ilacın bir log veya yarı log seyreltme serisini içerecektir.

1. Deney için en uygun kaplama düzenini göz önünde bulundurun. Dış kuyular, plakanın iç kuyularına kıyasla farklı sıcaklıklar, oksijenlenme ve buharlaşma yaşadığından, büyüme varyasyonu ile ilişkili gürültüyü azaltmak için 96 oyuklu bir plakanın dış kuyularından ölçümlerden kaçının.
   NOT: Plakanın manzarası boyunca kontrollerin dahil edilmesi, büyüme verilerinin sağlamlığını artıracaktır. Plakanın ortasına ve kenarlarına kontrol kuyuları eklemeyi düşünün.
2. Deney için gerekli plaka sayısını belirleyin. İlaç verme sırasında kuyucuk başına ortalama hücre sayısını belirlemek için testin başında parçalanacak bir ek plaka ekleyin (yani, T0 kontrol plakası).
3. Tam büyüme ortamında bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
   1. Deney için gereken plaka sayısına bağlı olarak (adım 3.2'de hesaplanmıştır), gerekli hücre süspansiyonunun hacmini belirleyin. Oyuk başına 90 μL'de tohumlama plakaları varsa, plaka başına yaklaşık 10 mL gereklidir. Gerekli plaka sayısını 10 mL ile çarpın.
      NOT: Rezervuarın ölü hacmini ve pipetleme sırasındaki hacim kaybını hesaba katmak için bu hacmin artırılması arzu edilir. Örneğin, hesaplanan hacim 1.2 ile çarpılabilir.
   2. Hücreleri sayın ve oyuk başına istenen hücre sayısına göre bir hücre seyreltmesi hazırlayın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 90 μL'lik ortamda 2000 hücreyi tohumlamayı hedefliyorsanız, toplam 3 plaka için, deney için gereken toplam hücre sayısını aşağıdaki gibi hesaplayın:
      
      Benzer şekilde, sayılan hücre süspansiyonu 400.000 hücre / mL ise, deney için gereken hücre süspansiyonunun hacmi şöyle olacaktır:
      
   3. Eklenecek sayılan hücre süspansiyonunun hacmini çıkararak kaplama için kullanılan hücre kültürü ortamının hacmini düzeltin.
      36 mL ortam - 2 mL hücre süspansiyonu = 34 mL düzeltilmiş ortam hacmi
4. Sayılan hücre süspansiyonunu serolojik bir pipet kullanarak doğru ortam hacmiyle karıştırın. Bu hücre süspansiyonunu V tabanlı bir reaktif rezervuarına aktarın.
5. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 90 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hacim başına istenen hücre konsantrasyonunun korunmasını sağlamak için istenen hücre konsantrasyonunu sağlamak için serolojik bir pipetle tekrarlanan pipetleme kullanarak reaktif rezervuarındaki hücre süspansiyonunu düzenli olarak karıştırın.
6. Hücrelerin 37 ° C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe (genellikle 12-24 saat) gece boyunca yapışmasına izin verin.
7. Adım 1.5'de açıklandığı gibi PBS'de %1'lik bir Triton-X çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltinin hacmi tüm plakaları parçalamak için yeterli olmalıdır. PBS'de yaklaşık 1.5 mL% 1.5 Triton-X, 96 oyuklu bir plakayı parçalamak için yeterlidir.
   NOT: PBS'deki %1,5 Triton-X çözeltisi bir haftadan fazla stabildir ve kolaylık sağlamak için önceden yapılabilir.
8. Bir ilaç seyreltme plakası yapmak için gereken hücre kültürü ortamının miktarını belirleyin. İlaç seyreltme plakalarını U veya V tabanlı 96 kuyulu şeffaf plakalarda hazırlayın.
   1. Seyreltilmiş ilacın hacminin deney için yeterli olduğundan emin olmak için, pipetleme sırasında hacim kaybını hesaba katmak için gereken minimum hacmi artırın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 10 μL'lik ilaçlar eklenecekse ve deney üç plaka içeriyorsa, kuyucuk başına 30 μL seyreltilmiş ilaç gereklidir. Hacim kaybını hesaba katmak için oyuk başına 40-50 μL ilaçlı ortam hazırlayın. T0 kontrol plakası için gereken ortamı hesaba katmak için gereken ortam hacmine 1,5 mL ekleyin.
9. Seçilen DNA boyasının 10x konsantrasyonunu tam büyüme ortamında hazırlayın. Bu konsantrasyon, adım 2.11'de seçilen konsantrasyona dayanmaktadır. Bu çözümün toplam hacmi adım 3.8'de hesaplanmıştır.
10. Adım 3.9'daki DNA boyası + büyüme ortamını kullanarak, test edilecek her ilacın 10x konsantrasyonunu hazırlayın. İlaç seyreltme plakasında her bir ilacın sadece en yüksek dozunu oluşturun ve ilaçları çok kanallı bir pipetle seri olarak seyreltin, her bir kuyucuk arasında 15 kez karıştırın.
    NOT: İlaç seyreltme plakasında belirli bir ilaç için en yüksek dozu yaparken, konsantrasyonun doğru olduğundan emin olmak için ilacın hacmi hesaba katılmalıdır.
11. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücreleri içeren plakalara adım 3.10'dan 10 μL ilaç + DNA boya çözeltisi ekleyin.
    NOT: Seri seyreltmenin oluşturulduğu ilaç seyreltme plakaları için, ilaçlar en düşük ilaç konsantrasyonundan başlayarak ve en yüksek konsantrasyona kadar çalışarak hücrelere eklenirse, çok kanallı pipetin uçlarının değiştirilmesine gerek yoktur. Bununla birlikte, çok kanallı pipet üzerindeki uçlar, her plaka arasında ve uçlar farklı bir ilaç veya daha yüksek bir ilaç konsantrasyonu içeren bir kuyucukta kullanıldığında değiştirilmelidir.
12. İlaçların eklendiği tüm plakalar için floresan okuyun. Bu floresan okuması T0 okumasıdır (yani, Zaman = 0 saat'teki ölü hücreler).
13. T0 floresan okumasını aldıktan sonra plakaları inkübatöre geri koyun.
14. T0 kontrol plakasına adım 3.9'da oluşturulan 10x DNA boya çözeltisinden 10 μL ve adım 3.7'de %1.5 Triton-X çözeltisinden 10 μL ekleyin. Bu plakayı, adım 1.8'de seçilen süre boyunca inkübatöre geri koyun.
15. Adım 1.6'da açıklandığı gibi hücreler tamamen parçalandıktan sonra T0 kontrol plakasını okuyun.

4. İlaçla tedavi edilen plakalar için zaman içinde ölü hücre floresansını ölçün

NOT: Plakaların inkübatörden çıkma süresini en aza indirin. Sıcaklıktaki uzun süreli değişiklikler hücre canlılığını etkileyebilir ve ışığa maruz kalmak SYTOX Green gibi DNA floroforlarını tehlikeye atabilir.

1. İlaçlamadan sonra her 3-4 saatte bir ilaçla tedavi edilen tüm plakalar için floresan okumaları alın. Çok hassas ölüm kinetiği gerekmedikçe plakaların gece boyunca okunmasına gerek yoktur.
   NOT: Zaman noktalarının sabit/standart aralıklarla alınmasına gerek yoktur. Genel olarak, zaman noktaları, ölüm kinetiğinin aşağı akış analizinde hatalara neden olmadan yalnızca normal çalışma saatleri içinde alınabilir. Kinetik olarak, ölüm başlangıcından önceki dönemde, ölümün yükselen evresinde ve doygunluk/plato evresinde bazı ölçümler yapıldığı sürece çıkarımda bulunulabilir.
2. İstenilen son zaman noktasında, bir floresan okuması elde edin. Hemen ardından, hücreleri parçalamak için adım 3.7'de hazırlanan% 1.5% Triton-X çözeltisinden 10 μL ekleyin.
3. Plakaları inkübatöre geri koyun ve hücrelerin 1. adımda belirlenen süre boyunca geçirgenleşmesine izin verin.
4. Geçirgenliği takiben floresan okumaları elde edin. Bu floresan değeri, her bir kuyucuk için toplam hücre sayısı (yani canlı + ölü hücreler) ile orantılıdır.

5. Öldürücü fraksiyon kinetiğini hesaplayın

NOT: Bu protokolde açıklanan hesaplamalar herhangi bir formatta veya yazılımda analiz edilebilir. Ancak MATLAB, R veya Python gibi bir programlama ortamı kullanmak daha hızlı ve daha esnek analize olanak tanır.

1. %50 kesilmiş ortalamayı kullanarak T0 kontrol plakasından ortalama floresan değerlerini hesaplayın. Bu değer, ilaçlamadan önceki toplam hücre sayısı ile orantılıdır.
2. Eğri uydurma ve üstel büyüme fonksiyonu kullanarak, deneydeki tüm kuyular için nüfus artışının kinetiğini hesaplayın. Her kuyucuk için ilk popülasyon büyüklüğü, adım 5.1'de hesaplanan ortalama T0 floresan değeridir. Her bir kuyucuk için nihai popülasyon büyüklüğü, adım 4.4'te hesaplanan geçirgenlik sonrası değerdir. Testin süresi, adım 4.4'te seçilen test son noktasına kadar 0 saat arasındadır.
3. Adım 5.2'de belirlenen büyüme parametrelerini kullanarak, her kuyucuk için tahlilde ölçülen her zaman noktasındaki toplam hücre sayısını hesaplayın. Adım 5.2'de hesaplanan toplam hücrelerden ölü hücre ölçümünü çıkararak ölçülen her zaman noktasındaki canlı hücre sayısını belirleyin.
   NOT: Tahlildeki küçük miktarlarda gürültü nedeniyle, bazen canlı hücre sayısı küçük bir negatif sayı olabilir. Bu, manuel olarak 0'a ayarlanabilir, çünkü negatif sayıda canlı hücre olamaz ve büyük olasılıkla o kuyudaki tüm hücrelerin öldüğünü gösterir.
4. Ölü hücre floresan sinyalini her zaman noktası için toplam hücre sinyaline bölerek her zaman noktası için öldürücü fraksiyonu (LF) hesaplayın.
5. Gecikme Üstel Ölüm (LED) denklemini ölümcül kesir zaman seyri verilerine^{sığdırın 10}. Herhangi bir önemli ölümcüllüğe neden olmayan bir ilacın dozları için keyfi kinetik parametrelerden kaçınmak için, 0'a eşit bir eğime sahip doğrusal bir modele uyun. Deneydeki gürültüye veya engebeli koşullar için gözlemlenen LF'ye dayalı olarak önemli ölümcüllük seviyelerini belirleyin.
6. LED denkleminden ölüm başlangıç zamanını (DO) kaydedin. LED denkleminin dört parametresi vardır: ilk LF (LFi), platodaki LF (LFp), ilk ölüm oranı (DR) ve DO. Bu parametreleri doğrusal olmayan bir regresyon (yani eğri uydurma) kullanarak verilerden çıkarın.
7. Her dozda her ilaç için tahlil uç noktasında fraksiyonel canlılığı (FV) hesaplayın. Uç nokta LF değerini 1'den çıkarın veya canlı hücre sayısını toplam hücrelere bölün.
   NOT: FV, yalnızca tahlil son noktasında değil, herhangi bir zaman noktasında hesaplanabilir. Bu veriler doz farmakolojisini değerlendirmek için kullanılır (ör., ilaç IC50 veya EC50).

6. GR değerini hesaplayın

1. Tahlilin başlangıcında her kuyucuk için ortalama canlı hücre sayısını belirleyin. Bu değeri, adım 3.15'te hesaplanan geçirgenlik sonrası T0 okumasını kullanarak ve adım 3.12'de toplanan her kuyu için T0 okumasını çıkararak hesaplayın. Aşağıdaki GR denkleminde (adım 6.3), bu değer x₀ olarak adlandırılır.
   NOT: Bazen bir ilacın en yüksek dozu, DNA boyasının floresan okumasına müdahale edebilir. Kontrol kuyuları kullanılarak 0 zamanında ortalama canlı hücre sayısının hesaplanması istenebilir.
2. Kontrol kuyuları için (x_ctrl), tahlil uç noktasındaki her bir kuyucuk için ortalama canlı hücre sayısını belirleyin. Tedavi edilen her ilaç durumu için test son noktasındaki ortalama canlı hücre sayısını belirleyin (x (c)).
   NOT: Plaka boyunca hücre büyümesindeki varyasyona bağlı olarak, her bir oyuğun normalizasyonu için farklı x_ctrl değerleri kullanılabilir. Örneğin, x_ctrl değerleri plaka boyunca sistematik olarak değişiyorsa, plakanın ortalama x_ctrl değeri yerine en yakın x_ctrl değerinin kullanılması istenebilir.
3. İlaçla tedavi edilen her kuyu için, aşağıdaki denklem^4'ü kullanarak normalleştirilmiş büyüme hızı inhibisyon değerini (GR) hesaplayın:
   
   4 parametreli bir lojistik regresyon kullanarak eğri uydurma gerçekleştirin. GR, -1 ile 1 arasında bir ölçektedir.

7. GRADE yöntemini kullanarak ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarını hesaplayın

NOT: GR, gerçek hücre çoğalma oranını değil, net nüfus artış oranını temsil eder. Uyuşturucuya bağlı nüfus artışı ve ölüm oranları, GR ve öldürücü fraksiyonun (LF) bir kombinasyonu kullanılarak hesaplanabilir.

1. Aşağıdaki denklemi çözmek için T0 kontrol okumasından (x₀) elde edilen ortalama canlı hücre sayısını, tahlil uç noktasındaki kontrol koşulundan ortalama canlı hücre sayısını (x_ctrl) ve saat cinsinden testin uzunluğunu (t) kullanarak deney sırasında hücre hattının iki katına çıkma süresini (τ) belirleyin:
   
   NOT: Hücre ikiye katlama süresinin (τ) doğru hesaplanması, hücrelerin test uzunluğu boyunca sürekli olarak iki katına çıkmasını gerektirir. Temas inhibisyonu yaşayan hücreler için, hücreler, istenen tahlil süresi boyunca birleşmeyecek başlangıç yoğunluklarında tohumlanmalıdır. Örneğin, U2OS'un ortalama ikiye katlama süresi 24 saattir. 72 saatlik bir tahlilde kuyu başına 2000 hücrenin tohumlanması, büyüme hızlarını yorumlamak için en uygunudur.
2. Büyüme/ölüm oranları ile nüfus büyüklüğü arasındaki ilişkiyi belirleyin. Bunu yapmak için, bir doğum/ölüm modeli ve büyüme ve ölüm oranlarının tüm makul ikili kombinasyonlarıyla başlatılan bir simülasyon kullanın. Bu simülasyon, T0 kontrol plakasından (x₀) ortalama canlı hücre sayısını, testin uzunluğunu (t) ve kullanıcı tanımlı bir makul çoğalma oranları (p) ve ölüm oranları (d) aralığını gerektirir.
   
   
   1. Büyüme oranları için makul değerleri belirlemek için, en yüksek büyüme oranı olarak saat başına iki katına çıkan hücre popülasyonunda (1 / T) işlenmemiş büyüme oranı ve en düşük büyüme oranı olarak 0 ile başlayın. Bu aralığı eşit aralıklı 500 parçaya bölün. Benzer bir işlem, 0 ile 1 arasında bir aralığı test ederek ölüm oranı için de uygulanabilir.
      NOT: 500 hızın tüm ikili kombinasyonları herhangi bir programlama ortamı kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak bazı yazılımlar kullanılıyorsa hesaplama açısından çok yoğun olabilir. Bunu, 50 büyüme ve ölüm oranlarının tüm ikili kombinasyonlarına indirgemek, çıkarımın kesinliğinde bir azalma ile bu sorunu hafifletebilir. Bu protokolle birlikte bir elektronik tablo şablonu sağlanmıştır.
3. Simüle edilmiş her proliferasyon (p) ve ölüm (d) oranı çifti için GR ve LF değerlerini (yukarıda açıklanmıştır) belirleyin.
   NOT: Adım 7.2-7.3, her bir teorik proliferasyon ve ölüm oranı çiftini, bu teorik çift için hesaplanan GR ve LF değerleriyle birlikte içeren bir tablo oluşturacaktır. Bu, deneysel olarak gözlemlenen bir çift GR ve LF değerini bir çift ilaca bağlı proliferasyon ve ölüm oranlarıyla ilişkilendirmek için bir arama tablosu olarak işlev görecektir. Proliferasyon ve ölüm oranları için 500'den fazla ayrık değerin test edilmesi, sayısal olarak daha kesin bir değerle sonuçlanacaktır, ancak bu hassasiyet seviyesi muhtemelen testin hassasiyetinin ötesinde olacaktır.
4. Arama tablosunda deneysel olarak hesaplanan her bir GR/LF çifti ile her bir teorik GR/LF çifti arasındaki ikili mesafeyi hesaplayın. Deneysel olarak gözlemlenen GR/LF değerleri çiftine minimum mesafeye sahip teorik çifti, gerçek ilaca bağlı proliferasyon ve ölüm oranları olarak çıkarın.

8. Yol seçici kimyasal inhibitörler kullanılarak ölüm yollarının belirlenmesi

NOT: Kimyasal inhibitörler tek başına belirli bir ilacın ölüm mekanizmasını kesin olarak belirlemek için yetersizdir. Ölüm yollarının kimyasal inhibitörleri, morfolojik değerlendirme, yola özgü biyokimyasal belirteçler ve genetik bağımlılıkların değerlendirilmesini içermesi muhtemel olan sonraki deneylerde hangi biyokimyasal veya fenotipik yanıtların araştırılması gerektiğini belirlemek için kullanılmalıdır.

1. İlgilenilen ölüm yollarının kanonik aktivatörü bağlamında bir doz inhibitör konsantrasyonu aralığını test ederek ilgilenilen hücre hattındaki her bir hücre ölümü inhibitörünün dozunu optimize edin (Tablo 2). İdeal olarak, seçilen inhibitör dozu kendi başına hücre canlılığını etkilememelidir (GR metriğini kontrol edin).
   NOT: Tüm hücre hatları tüm ölüm yollarını aktive edemez. Farklı ölüm yollarının aktivatörlerini/inhibitörlerini test ederken biyokimyasal veya fenotipik doğrulama gerekebilir.
2. Bir inhibitör elek için en uygun kaplama düzenini düşünün. Toplu etkileri en aza indirmek için, her ilacı, değerlendirilmekte olan inhibitör(ler) ile aynı plakada tutun ve replikasyonlar ayrı plakalarda olsun.
3. Adım 3.3'e benzer şekilde, 96 oyuklu, optik tabanlı, siyah duvarlı bir plakanın her bir oyuğunda istenen sayıda hücreyi tohumlayın. İnhibitör ve ilacın hacimlerini hesaba katmak için kaplama hacmini 80 μL'ye düşürün.
4. Tam ortamda test edilecek inhibitörlerin 10x konserasyonunu hazırlayın ve her bir oyuğa 10 μL ekleyin. Hücreleri 2-4 saat boyunca ölüm yolu inhibitörleri ile ön işlemden geçirin. Daha sonra, ilgilenilen ilaçları ekleyin ve 3-5. adımlarda olduğu gibi floresan okuması elde edin.
5. İnhibitör(ler)in etkinliğini değerlendirmek için ölüm başlangıç zamanındaki (DO) ve/veya maksimum öldürücü fraksiyondaki değişikliği değerlendirin. DO, Gecikme Üstel Ölüm (LED) modelinden çıkarılan bir parametredir. 5.6 - 5.7 arasındaki adımlara bakın.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, U2OS hücrelerinin HDAC inhibitörü Belinostat'a duyarlılığını araştırdık. Bu deneyler, ölü hücreleri etiketlemek için 2 μM SYTOX Green kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 1A). Kinetik okumalar, 130 kazanç ayarında bir floresan plaka okuyucu kullanılarak yapılmıştır (Şekil 1B). Hücreler, testin sonunda 2 saat boyunca PBS'de% 1.5 Triton-X çözeltisi içinde parçalandı (Şekil 1C-D).

FLICK protokolü, nüfus artış hızı ve ilaca bağlı hücre ölüm oranı hakkında bilgi üretir. Bu içgörüler ayrı ayrı veya ilaç GRADE görselleştirme ve analiz çerçevesi kullanılarak birlikte görüntülenebilir (Şekil 1E). GR değeri kullanılarak Belinostat duyarlılığının değerlendirilmesi, 1 μM Belinostat'ın yaklaşık 0'lık bir GR değeri ile sonuçlandığını ortaya koymaktadır (Şekil 2A). GR ölçeğinde, pozitif değerler nüfus artış oranını, negatif değerler ise nüfus küçülme oranını bildirir. Bu nedenle, 0'lık bir GR değeri, popülasyonun durağanda kaldığını ortaya koymaktadır (yani, sitostatik bir ilaç yanıtı). Sitostazın geleneksel yorumu göz önüne alındığında, 1 μM Belinostat'ın herhangi bir hücre öldürmesi olmadan tam büyüme inhibisyonuna neden olduğu sonucuna varılabilir. Bununla birlikte, ilaca bağlı öldürücü fraksiyonun değerlendirilmesi, 1 μM Belinostat'ın bu test süresince kabaca %50 ölümcüllüğe neden olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 2B). Çoğu durumda, bu iki içgörü, elmadan elmaya bir şekilde karşılaştırılamayan farklı deneylerden türetilecektir. Daha da önemlisi, FLICK tahlili kullanılarak, her iki içgörü de aynı deneysel verilerden türetilmiştir, ancak Belinostat'ın hücre ölümüne karşı popülasyon büyümesi üzerindeki etkilerini yakalamak için farklı şekilde analiz edilmiştir.

Bu iki içgörü, GRADE analitik yöntemi kullanılarak da entegre edilebilir (Şekil 2C). İlaç GRADE, ortalama ölüm oranıyla orantılı olan Ölümcül Fraksiyonu, net nüfus artış hızı olan GR değeriyle yan yana getirir. Verilerin bu şekilde entegre edilmesi, bir ilacın büyüme inhibisyonunu ve ölüm aktivasyonunu nasıl koordine ettiğine dair bir görselleştirme sağlar. GRADE grafiği içinde: ölümü aktive etmeden büyümeyi engelleyen ilaçlar (yani, ortak yorumu kullanan sitostatik ilaçlar) üst sınırı işgal edecek, hücre çoğalma hızlarını değiştirmeden sadece öldüren ilaçlar sağ sınırı işgal edecek ve önce büyüme inhibisyonuna neden olan ilaçlar, ardından büyümeyi durduran hücrelerin ölümü sol sınırı işgal edecektir (yani, iki fazlı ilaçlar; Şekil 2C). Bu sınırlar içinde kalan GR / LF yanıtları ile sonuçlanan ilaçların, aynı anda hücre ölümünü aktive ederken (yani, çakışan ^{ilaçlar) bir} dereceye kadar proliferasyonu inhibe ettiği sonucuna varılabilir3. Daha da önemlisi, her bir ilaç yanıtının GR / LF alanı içindeki konumu, bir ilacın her bir konsantrasyonu için gerçek proliferasyon oranını (p) ve ortalama ölüm oranını (d) hesaplamak için kullanılabilir (Şekil 2D-E). GR değerinin gerçek hücre çoğalma hızı değil, net nüfus artış hızı (yani, gerçek çoğalma hızı ile ilaca bağlı ölüm oranını birleştiren net etki) olduğunu unutmayın. Ayrıca, bir GRADE analizinde üretilen ölüm oranı (ortalama ölüm oranı olan d), LED kinetik analizindeki ölüm oranı parametresinden (DR, maksimum hız veya maksimum ölüm oranı) farklıdır.

FLICK testi, ilaca bağlı öldürücü fraksiyon gibi ölüme özgü veriler üretebilir; Bununla birlikte, bu veriler hücre ölümü mekanizmasına karşı agnostiktir. FLICK kullanarak hücre ölümü mekanizması hakkında bilgi edinmek için en basit yöntem, ölüm yoluna özgü inhibitörlerin dahil edilmesiyle ölümcül fraksiyon kinetiğinin nasıl değiştirildiğini belirlemektir. İlgili bir ölüm mekanizmasının engellenmesi, ilaca bağlı öldürücü fraksiyonun azaltılması ve/veya ölüm başlangıç zamanının geciktirilmesi ile sonuçlanmalıdır. Burada, pan-kaspaz inhibitörü z-VAD'nin 50 μM'sinin, 1 μM Belinostat'ın neden olduğu ölümcüllüğün yaklaşık% 50'sini kurtardığını gösteriyoruz (Şekil 2F). Daha da önemlisi, ilaçlar gibi, inhibitörler de sınırlı özgüllüğe sahiptir ve yanlışlıkla diğer ölüm mekanizmalarını inhibe edebilir veya şiddetlendirebilir. Bu nedenle, kesin bir sonuca varılmadan önce, bu veriler hücre morfolojisi, aktivasyonun biyokimyasal belirteçlerinin ölçümü ve/veya yola özgü genetik bağımlılıkların değerlendirilmesi gibi diğer bilgilerle tamamlanmalıdır¹⁴.

Bir ilaç yanıtının yorumlanmasının FLICK tabanlı bir değerlendirme ve GRADE tabanlı analiz ile nasıl değiştirilebileceğini resmi olarak göstermek için, daha sonra farklı büyüme / ölüm koordinasyonu türlerine sahip üç ilacı araştırdık. Palbociclib, sitostatik bir yanıtla (hücre ölümü olmadan büyüme inhibisyonu) sonuçlanan bir Cdk4/6 inhibitörüdür. Kamptothecin, iki fazlı bir yanıta (büyüme inhibisyonu, ardından yüksek dozlarda hücre ölümü) neden olan bir topoizomeraz I inhibitörüdür. Belinostat, çakışan bir yanıta neden olan bir HDAC inhibitörüdür (her dozda kısmi büyüme inhibisyonu ve ölüm aktivasyonu, ancak dozlar arasında değişen oranlarda). Bu verilerin geleneksel bir analizi kullanılarak, her üç ilacın da U2OS hücrelerinin göreceli canlılığını önemli ölçüde azalttığı gözlemlenebilir (Şekil 2G). Palbociclib gözle görülür şekilde daha az güçlü olmasına rağmen, bu verilerden Palbociclib'in hücre ölümünü aktive edemediği açık değildir. İlaçların net nüfus artış hızını nasıl etkilediğini bildiren GR tabanlı bir analiz kullanılarak, Palbociclib ile tedavi edilen popülasyonların tüm dozlarda genişlemeye devam ettiği, buna karşın yüksek dozlarda Camptothecin veya Belinostat'ın popülasyon küçülmesine neden olduğu ve bu nedenle bu ilaçların yüksek dozlarını takiben hücre ölümünün aktive edilmiş olması gerektiği daha doğru bir şekilde yorumlanabilir (Şekil 2H). Bununla birlikte, GR tabanlı bir analiz, büyüme ve ölüm arasındaki çeşitli koordinasyonu hesaba katmaz, bu da belirli bir ilaç tarafından aktive edilen hücre ölümü seviyesi hakkında hatalı sonuçlara yol açabilir. Örneğin, GR verilerine dayanarak, Camptothecin'in -0.25'lik bir GR değeri ile sonuçlandığı ve Belinostat'ın 0'lık bir GR değeri ile sonuçlandığı göz önüne alındığında, 1 μM Camptothecin'in 1 μM Belinostat'tan daha büyük ölçüde hücre ölümünü aktive ettiği sonucuna varılabilir; -0.25 GR değeri, tedavi edilmeyen popülasyonun artması kadar popülasyonun %25 oranında küçüldüğü anlamına gelir. GRADE tabanlı bir görselleştirme ve analiz kullanılarak, Camptothecin ve Belinostat'ın büyüme / ölüm koordinasyonlarında farklılık gösterdiği gözlemlenebilir. Bu nedenle, 1 μM dozunda, her iki Belinostat, Camptothecin'den daha yüksek bir oranda ölümü aktive eder (Belinostat için% 0.8 ölüm / saat, Camptothecin için% 0.7 ölüm / saat ile karşılaştırıldığında), ancak Camptothecin ile tedavi edilen popülasyon, bu ilacın neden olduğu daha belirgin bir büyüme inhibisyonu nedeniyle daha hızlı küçülür (Şekil 2I).

Şekil 1: FLICK protokolünün akış şeması. (A) Bir mikroplaka okuyucuda DNA boya konsantrasyonunu ve floresan ölçümlerinin doğrusallığını optimize etmek için bir hücre seyreltmesi oluşturun. (B) U2OS hücrelerinde 2 μM SYTOX Green için hücre sayısı boyunca titrasyon elde edin. 130'luk bir kazanç, tüm hücre sayılarında en doğrusal sinyali sağlar. (C) U2OS hücrelerinin faz görüntüleri, 10x objektif kullanılarak zaman içinde %1,5 Triton-X ile parçalanmıştır. Kutulu bölge, SYTOX Green floresansının yakınlaştırılmış bir görünümüdür. Ölçek çubukları tüm görüntüleri temsil eder. (D) Belirtilen zamanlarda lizisi takiben SYTOX Green sinyali. Veriler 3 biyolojik kopya için ortalama +/- SD'dir. (E) Kurulumdan analize kadar tahlilin kavramsal bir genel bakışı. Anahtar adımlar, bir ilaç seyreltme plakasının oluşturulması, çok kuyucuklu bir plakadaki hücrelerin ilaçlanması, zaman içinde floresan ölçümlerinin elde edilmesi ve büyüme ve ölüm ölçümlerinin hesaplanmasıdır. B ve D panelleri için veriler, n = 3 bağımsız biyolojik kopya için SD ± ortalamadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: FLICK testi ve GRADE tabanlı analiz kullanılarak ilaç yanıtlarının karakterize edilmesi. (A) HDAC inhibitörü Belinostat için bir doz dozun üzerinde GR metriği. Gösterilen veriler, 66 saat olan tahlil son noktasından alınmıştır. 1 μM'de Belinostat, sitostatik bir yanıtı gösteren yaklaşık 0'lık bir GR değerine sahiptir. (B) Belinostat için öldürücü fraksiyon kinetiği. 1 μM'de Belinostat, GR değeri tarafından yakalanmayan yaklaşık% 50 ölümcüllüğe neden olur. (C) Olası tüm büyüme ve ölüm oranlarının simülasyonuna dayanan GRADE faz diyagramı. Simülasyon, bu testte U2OS'un iki katına çıkma süresine (27.12 saat) dayanıyordu. (D) Test son noktasında doz boyunca Belinostat için GRADE grafiği. (E) Belinostat dozları için GRADE-çıkarımlı büyüme (p, saatte iki katına çıkan popülasyon) ve ölüm (d, saatte ölen nüfusun fraksiyonu) oranlarının çubuk grafiği. Oranlar, (C)'deki simüle edilmiş oranlardan ve (D)'deki verilerden belirlenmiştir. (F) Apoptotik inhibitör z-VAD (mor) veya (siyah) 50 μM olmadan tedavi edilen 1 μM Belinostat için öldürücü fraksiyon grafiği. ΔLF = 0.18, inhibitör ile tedavi edilen durumdan ortalama maksimum LF'nin kontrolden alınan ortalama maksimum LF'den çıkarılmasıyla hesaplandı. (G) 72 saatlik bir maruziyeti takiben üç ilaç için nispi canlılık (ilaçla tedavi edilen durumdaki canlı hücre sayısı, tedavi edilmeyen durumdaki canlı hücre sayısına bölünür). Tüm ilaçlar hücre canlılığını azaltır, ancak hücre ölümünün yanıta katkısı bilinmemektedir. (H) (G)'deki üç ilaç için GR metriği. Bu veriler, üç ilacın ikisinin, GR < 0 ile gösterilen popülasyon küçülmesine yol açtığını göstermektedir. Hücre ölümünün katkısı hala belirsizdir, ancak GR değeri negatif olduğunda hücre ölümünün aktive edilmiş olması gerekir. (I) Üç ilaç için GRADE-çıkarımlı oranlar. Palbociclib öldürücü değildir ancak büyümenin durmasına neden olur. Kamptothesin bifaziktir; Daha düşük dozlar büyümenin durmasına neden olurken, daha yüksek dozlar büyümenin durmasına ve ardından ölümcüllüğe neden olur. Belinostat tesadüfi bir ilaçtır; doz aralığı, GRADE grafiğinin ortasından geçer, bu da tüm dozların bir büyüme pertürbasyonu ve hücre ölümü aktivasyonu ile sonuçlandığını gösterir. Tüm panellerdeki veriler, üç bağımsız biyolojik çoğaltma deneyi için SD ± ortalamasıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Boya	Kinetik	Bitiş Noktası
SYTOX Yeşil	Y	Y
CellTox Yeşili	Y	Y
NucSpot 500/515, 594/615, 750/780	Y	Y
YOYO-3	Y	Y
Propidyum İyodür	N	Y
7-AAD	N	Y

Tablo 1: DNA boyaları ve FLICK'teki uygulamaları. Yalnızca uç nokta FLICK tahlilleri için birçok boya türü kullanılabilir. Daha az boya, tahlil boyunca sürekli olarak inkübe edilecek koşulları karşılar. Yeşil olmayan boyalar da dahil olmak üzere diğer boyalar derinlemesine karakterize edilmemiştir ve kullanımdan önce dikkatlice değerlendirilmelidir.

Ölüm Yolu	Inhibitörü	Tipik Doz
İntrinsik apoptoz	ZVAD-FMK	50 μM
Ekstrinsik apoptoz	Z-IETD (Türkçe)	30 μM
Ferroptoz	Ferrostatin-1	10 μM
Nekrotoz	Nekrostatin-1	50 μM
Piroptoz	VX-765 Serisi	50 μM
Parthanatos (Parthanatos)	Rucaparib	1 μM
Otofajik Bağımlı Hücre Ölümü	Hidroksiklorokin (HCQ)	10 μM
Lizozomal Bağımlı Hücre Ölümü	E-64D Serisi	10 μM
Küproptoz	Tetratiyomolibdat (TTM)	5 μM
Okseiptoz	N-asetil-l-sistein (NAC)	2 milyon
MPT güdümlü nekroz	Siklosporin A (CsA)	10 μM

Tablo 2: Hücre ölüm yolları ve inhibitörleri. Hücre ölümü inhibitörleri, her ölüm yolu için kanonik bir aktivatöre karşı doğrulanmalıdır. Seçilen inhibitör dozları ideal olarak hücre canlılığını etkilememelidir.

Ek Tablo 1: SINIF hesaplayıcı. FLICK tabanlı GR ve FV verilerinden ilaca bağlı büyüme ve ölüm oranlarını hesaplamak için elektronik tablo. Kullanıcılar, GR ve FV verilerini, testin saat cinsinden uzunluğunu, saat cinsinden hücre iki katına çıkma süresini ve popülasyon boyutlarını başlatma/bitirme ile birlikte girmelidir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

FLICK testi, bir ilacın bir hücre popülasyonunun büyümesi ve ölümü üzerindeki etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini oluşturmak için sağlam bir yöntemdir. Bu yöntem doğrudan hücre sayımı yapmadığından, protokoldeki kritik adımlar, triton geçirgenlik adımları sırasında tahlil doğrusallığını ve tam lizizi sağlamaktır. Doğru geçirgenlik süresi, bu protokolde vurgulandığı gibi görsel olarak veya zaman içinde plaka floresansını okuyarak ve sinyal platolarının ne zaman olduğunu belirleyerek kantitatif olarak tanımlanabilir. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, şüpheye düştüğümüzde, daha uzun süre beklemenin herhangi bir maliyeti yok gibi görünüyor: FLICK testinde kullandığımız DNA boyaları için, sinyal yoğunluğu lizizi takip eden birkaç gün boyunca sabit kalıyor. SYTOX Green nükleik asit boyasını düzenli olarak kullanıyoruz ve Tablo 1'de atıfta bulunulan her bir floroforu doğrulamamış olsak da, diğer birkaç protokol etkili kullanımlarını göstermektedir 13,15,16. Belirli bir hücre geçirimsiz DNA boyasının bir dizi hücre sayısı ve cihaz ayarı boyunca doğrusallığının değerlendirilmesi, sağlam ve kantitatif olarak güvenilir veriler sağlayacaktır.

Bazı hücre hatlarının parçalanması diğerlerinden daha zordur ve bir hücre hattının parçalanma süresinin başka bir hücre hattı ile aynı olduğu asla varsayılmamalıdır¹³. Bazı hücre hatları için, daha yüksek yoğunluklarda, hücre lizisi, hücrelerin bir tabaka gibi kuyudan kalkmasına neden olur ve bu da plaka okuyucu hatasına neden olabilir. Bu, başlangıç tohumlama yoğunluğunu azaltarak veya lizizden sonra ve okumadan önce kuyucukları pipetle karıştırarak önlenebilir. Parçalama süresini veya parçalama verimliliğini artırmak için, Triton-X çözeltisi daha yüksek veya daha düşük bir yüzdeye ayarlanabilir, ancak bunun gerekli olduğu bir senaryoyla henüz karşılaşmadık.

Sağlam büyüme verileri istendiğinde deneysel tasarım ve ilaç kaplama düzeni dikkatlice düşünülmelidir. FLICK testi için bir ilaç seyreltme plakası oluşturmak, diğer 96 oyuklu plaka tahlili ile aynıdır. Bununla birlikte, bir plakanın manzarasının farklı kısımlarını kapsayan birçok kontrolün dahil edilmesi, büyüme kinetiği hakkında sağlam içgörüler oluşturmaya yardımcı olacak ve sistematik büyüme varyasyonunun olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir. Bir plakanın dış kuyucuklarından kaçınmak, bu kuyucuklar sıcaklık, oksijen veya nem dalgalanmalarına karşı daha hassas olduğundan ve büyümelerini etkilediğinden, daha kesin büyüme verileri üretecektir. Son olarak, bir ilacın replikat plakalar üzerindeki konumunu değiştirmek gibi sözde randomize bir ilaç paterni kullanmak, ilaç davranışının daha doğru bir değerlendirmesini sağlayacaktır.

FLICK testinin doğru kullanımı için bazı sınırlamalar mevcuttur. Bu sınırlamalar çoğunlukla kinetik çıkarımla ilgilidir, çünkü uç nokta verileri deneysel olarak gözlemlenen değerlerdir. Hem canlı hücre proliferasyon kinetiği hem de ölüm kinetiği, ilaçla tedavi edilen durumda zaman içinde canlı hücrelerin büyüme yörüngesi ile ilgili bazı varsayımlara bağlıdır. Bu protokolde, bu büyüme yörüngesini üstel ve zaman içinde tek tip bir oranla tanımlıyoruz. Bu özelliklerin bir ilacın yokluğunda görülmesi muhtemel olsa da, bir ilacın varlığında bunlara bağlı kalınamayabilir. FLICK yöntemi doğrudur, çünkü büyüme yörüngeleri hakkındaki varsayımlar her zaman doğru değildir, bunun yerine, ilaçla tedavi edilen popülasyon çok fazla çoğalmazsa (yani, tahlil döneminde 2 veya 3'ten az popülasyon iki katına çıkarsa) herhangi bir yanlış varsayımın etkisi en aza indirildiği için doğrudur. FLICK'te doğru bir şekilde profili çıkarılamayan ilaçlarla karşılaşmadık; bununla birlikte, teori, FLICK testinin, hücre ikiye katlanma süresinin birkaç katı olan uzun süreler boyunca, ölümün çok yavaş gerçekleştiği bir ilaç için doğru olmaktan çıkacağını öne sürecektir (not: bu özelliklere sahip herhangi bir ilaç tanımlamadık³). Bununla birlikte, toplam popülasyonun büyüme kinetiği için herhangi bir yanlış varsayımın etkisi, LED uyumundan elde edilen ölüm başlangıç süresini veya nihai maksimum LF değerlerini etkilemeyecektir, çünkü bunlar ampirik olarak ölçülen ölü hücre değerleri ve testin sonunda deneysel olarak belirlenen nihai toplam hücre değerleri ile sınırlıdır.

Bu sınırlamalara rağmen, FLICK testi, diğer ilaç yanıt yöntemleri kullanılarak üretilmesi zor olan içgörüler sağlar. Çoğu ilaç yanıt yöntemi, canlı hücre sayısıyla orantılı bir sinyal üretir ve bu yöntemler, ilaçların net popülasyon artış oranını (yani, GR değeri veya eşdeğeri) nasıl etkilediğini ölçmek için kullanılabilir, ancak bir ilacın sitotoksik ve sitostatik etkileri arasında doğru bir ayrım yapamaz. Alternatif olarak, hem canlı hem de ölü hücreleri ölçen mikroskopi tabanlı tahliller kesinlikle kapsamlı bir resim oluşturabilir. Bununla birlikte, mikroskopi tabanlı tahliller, birçok apoptotik olmayan hücre ölümü formu bağlamında hızlı bir şekilde gerçekleşeceği gibi, hücreler döküntülere ayrıştıktan sonra ölü hücreleri saymak için mücadele edebilir. FLICK'in önemli bir özelliği, ölçümlerin doğrudan ölü hücreleri saymak yerine toplam ölü hücre floresansını toplayan bir plaka okuyucuda yapılmasıdır. Bu nedenle, FLICK'teki ölü hücre sinyali, apoptotik olmayan hücre ölümü bağlamında benzersiz bir şekilde gerekli olan ölü hücrelerin bozulmamış hücreselliğine bağlı değildir. Ayrıca, FLICK testinin benzersiz bir özelliği, aynı reaktifi kullanarak hem canlı hem de ölü hücre popülasyonlarını ölçme yeteneğidir. Bu nedenle, FLICK testi, canlı ve ölü hücrelerin ölçümlerini eşit hassasiyetle üretir. Bu özellik, GRADE yöntemini kullanarak analize olanak tanır ve GRADE'in eşzamanlı büyüme ve ölüm oranı hesaplamalarının doğruluğunu artırır. Dahil edilen Ek Tablo 1 , kullanıcının test uzunluğunu, adım 7.1'den hesaplanan büyüme oranını, kontrol koşullarından hücre sayılarını veya floresan okumalarını başlatıp bitirebileceği ve 5.4 ve 6.3 adımlarından hesaplanan LF ve GR'yi girebileceği ilaç GRADE'in görselleştirilmesi için kullanılan bir şablon içerir. Dosya, kullanıcı tanımlı parametrelere göre otomatik olarak güncellenecek olan 50 büyüme ve ölüm oranının tüm ikili kombinasyonlarının bir simülasyonunu içerir. Şablon, ilaç yanıtının ve GRADE'den çıkarılan büyüme (p) ve ölüm (d) oranlarının GRADE tabanlı bir görselleştirmesini oluşturur.

Gelecekteki çalışmalar, FLICK testinin 3D hücre kültürü senaryolarında veya tümör kaynaklı organoidlerin ilaç tepkilerinin değerlendirilmesinde uygulanmasını araştırmalıdır. FLICK verilerinin doğrusallığı ve hassasiyeti bu bağlamlarda derinlemesine sorgulanmamıştır, ancak teoride, FLICK testi, floresansı 3 boyutlu numunelere entegre etmek için bazı modifikasyonlarla etkili olmalıdır. Ek olarak, hücreye özgü ek etiketler eklemek, ko-kültürde iki veya daha fazla hücre tipi arasında ayrım yapmaya yardımcı olacaktır. Bu ilerlemeler, kanser hücreleri ile bağışıklık hücresi etkileşimlerini keşfetmek için değerli olacaktır. Son olarak, SPARKL gibi tahliller, hücre ölümü içgörülerinin doğruluğunu korurken verimi artırabilecek^FLICK tahlil formatında ölüme özgü raportörlerin kullanımına ilham verir ^11,16.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Belinostat	ApexBio	A4612
Camptothecin	ApexBio	A2877
Conical centrifuge tube, 15mL	Fisher Scientific	12-565-269
DMEM	Corning	10017CV	For seeding and drugging cells
DMSO	Fisher Scientific	MT-25950CQC	For seeding and drugging cells
Fisherbrand 96-Well, Cell Culture-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	FB012932	For seeding and drugging cells (pin plate)
Greiner Bio-One CELLSTAR μClear 96-well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate	Greiner	655090	For seeding and drugging cells
IncuCyte S3	Essen Biosciences		Any phase microscope will work
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	MATLAB version R2023b, a license is required
Microplate fluorescence reader	Tecan	Spark	For measuring dead cell fluorescence
Palbociclib	ApexBio	A8316
PBS	Corning	21-040-CM	Any PBS works
Spark Multimode Microplate Reader	Tecan	https://www.tecan.com/spark-overview	SparkControl software version 2.2
Sterile reservoir, 25 mL	Fisher Scientific	13-681-508	For seeding and drugging cells
Sytox Green nucleic acid stain	Thermo Fisher Scientific	S7020	DNA stain for measuring dead cell fluorescence
Triton-X 100	Thermo Fisher Scientific	J66624-AP	For permeabilizing cells
U2OS	ATCC	HTB-96	An example cell line used in this protocol
Z-VAD-FMK	ApexBio	A1902