Davranışsal gözlem için zebra balığı larvalarına uçucu anesteziklerin uygulanması

Özet

Bu protokol, davranışsal deneyler için larva zebra balıklarına uçucu anestezikler uygulamak için gaz geçirmez bir ortam oluşturmak için erişilebilir bir yöntem sunar.

Özet

Bu çalışma, davranışsal deneyler sırasında larva zebra balıklarına izofluran ve sevofluran gibi uçucu anesteziklerin uygulanması için benzersiz bir yöntemi açıklamaktadır. Zebra balığı, omurgalı bir model organizma olarak karmaşık davranışlar, genetik izlenebilirlik, şeffaf embriyolar ve hızlı gelişim dahil olmak üzere sayısız avantaj sunarken, uçucu anesteziklerin incelenmesinde kullanımları sınırlı kalmıştır. Uçucu anesteziklerin uygulanması genellikle geniş çapta erişilebilir olmayabilen karmaşık veya hantal aparatlar gerektirir ve bu da sulu model organizmalarda uçucu anesteziklerin farmakolojik çalışmasına engel oluşturur. Bu yöntem, 96 oyuklu cam plakalar üzerinde gaz geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için yapışkan silikon levhalar kullanan basit bir teknik sunar. Doğrulama, 90 dakikalık bir süre boyunca kapalı ve açık kuyular arasında önemli bir fark göstermeyen spontan hareketin değerlendirilmesi yoluyla gerçekleştirildi. Ek olarak, anestezik konsantrasyon, HPLC ile ölçüldüğü gibi zamanla sabit kalmıştır. Temsili sonuçlar, sevofluran için medyan etkili konsantrasyon (EC₅₀) değerlerinin deneysel olarak belirlenmesini içerir. Bu çalışma, diğer uçucu ajanları ve deneysel uç noktaları incelemek için kolayca uyarlanabilen uçucu anesteziklerin kullanıldığı farmakolojik deneyler için basit ve erişilebilir bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Sucul olmayan hayvan modelleri (solucanlar, sinekler, kemirgenler, tavşanlar, primatlar, vb.) tarihsel olarak anestezik farmakolojiyi incelemek için en yaygın olarak kullanılan modeller olmuştur. Bu türlerin her birinde, uçucu anestezikler (gazın solunması yoluyla uygulanır), intravenöz anesteziklerin uygulanmasından (intravenöz veya intraperitoneal yollarla uygulanır) çok daha az ^zordur1. İntravenöz ilaçların basitçe uygulanmasının teknik zorluğuna ek olarak, uçucu ajanlarla stabil bir anestezi durumu elde etmek intravenöz ajanlara göre çok daha kolaydır².

İntravenöz anesteziklerin larva sucul türlere uygulanması, çevrelerindeki sulu ortamdan ^3,4 difüzyon yoluyla sağlanabilir ve bu nedenle susuz türler için uçucu anesteziklerin uygulanmasına daha çok benzer. Uzun yıllar boyunca, kurbağa yavruları (Xenopus laevis), ilaç uygulama kolaylığı ve anesteziklerin yapay havuz suyuna basit banyo ilavesiyle elde edilen kararlı durum farmakokinetiği nedeniyle anestezikleri incelemek için tercih edilen modeldi ^5,6. Bununla birlikte, genellikle amaca yönelik olarak üretilen ve kullanımı zahmetli olabilen gaz geçirmez aparatların gerekliliği nedeniyle bu modelde uçucu anesteziklerin incelenmesine ilişkin nispeten az sayıda örnek vardır ^7,8.

Son yıllarda, zebra balığı, iyi tanımlanmış karmaşık davranışları ve bu davranışları gözlemlemek için ticari birimlerin mevcudiyeti gibi diğer avantajlara ek olarak, aynı ilaç uygulama kolaylığı nedeniyle intravenöz anesteziklerin incelenmesi için tercih edilen bir model haline gelmiştir⁹. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, zebra balığı larvalarının^{davranışını} ölçmek için 96 oyuklu ve 24 oyuklu plaka formatlarını kullanarak, anestezikler de dahil olmak üzere nöroaktif bileşikleri taramak için ticari olarak temin edilebilen bu tür gözlem birimlerini kullanmıştır 4,10,11,12,13,14,15 . Larva evreleri, birçok davranışsal yanıtı değerlendirme yetenekleri, küçük boyutları, yüksek verim uyumlulukları ve iyi karakterize edilmiş nöral devreleri nedeniyle farmakoloji çalışmaları için özellikle uygundur ^9,16,17. Bununla birlikte, zebra balığı modelindeki bu anestezik çalışmalarındaki önemli bir sınırlama, uçucu anesteziklerin uygulanmasındaki göreceli zorluktur. Bu sınırlılık, uçucu ve intravenöz ajanlar arasında yetersiz karşılaştırma örneklerine yol açmıştır ^4,15,18. Her iki anestezik sınıfını tek bir hayvan modelinde kolayca inceleyebilmek ve karşılaştırabilmek, tüm sınıflarda anestezik farmakoloji çalışmasını kolaylaştırmak için önemli bir araç ekler.

Geleneksel olarak, suda yaşayan bir türde intravenöz anesteziklerin incelenmesi, deney süresince anestezik kaybını önlemek için kullanımı zor olabilen veya yeterince gaz geçirmez olmayabilen özel, genellikle özel ekipman gerektirmiştir. Burada açıklanan prosedür, ticari bir gözlem ünitesi kullanarak larva zebra balığı davranışının gözlemlenmesi için uygun olan bir cam haznede gaz geçirmez bir conta üretmenin kolay erişilebilir bir alternatif yolunu sunar (bkz. Malzeme Tablosu).

Protokol

Tüm zebra balığı deneyleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan hayvan kullanım protokollerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Yetişkin zebra balıkları, Üniversite Laboratuvarı Hayvan Kaynakları'nın (ULAR) gözetimi altında Pennsylvania Üniversitesi'nin su tesisinde tutuldu. Tübingen uzun yüzgeçli yabani tip zebra balığı, tüm deneyler için kurum içinde yetiştirildi ve döllenmeden 5 gün sonrasına (dpf) ulaşana kadar 13/11 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü ile standart yetiştirme koşulları altında tutuldu. Deneyler, yeterli biyolojik çeşitliliği sağlamak için farklı çiftleşme çiftlerinden türetilen kavramalarla biyolojik kopyalar kullanılarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yapışkan silikon levhaların imalatı

NOT: Bu malzemenin eşdeğerleri (silikon levha artı yapıştırıcı) ticari olarak tedarik edilebilir, ancak genellikle daha fazla masraf ve daha az kullanılabilirlik ile.

1. 0,5 mm'lik silikon levhayı temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin.
2. Çarşaflarda herhangi bir kırışıklık olup olmadığını kontrol edin ve mümkün olduğunda bunlardan kaçının.
   NOT: Kırışıklı silikon levhalar banda yeterince yapışmayabilir ve kuyuların yetersiz sızdırmazlığına ve/veya zebra balığının yetersiz görselleşmesine neden olabilir.
3. Yağ veya kalıntıları temizlemek ve kurumasını sağlamak için çarşafları %70 alkolle temizleyin.
4. Boya fırçası gibi bir aplikatör kullanarak, silikon tabakaya ince, eşit bir kat yapışkan astar uygulayın. Aşırı uygulamayı önlemek için, yapışkan motor hızlı bir şekilde kuruduğundan (1-5 sn içinde ayarlanır) daha küçük bölümler halinde çalışın.
   NOT: Bu yapışma motoru olmadan, bant silikon levhaya yeterince yapışmayacaktır.
5. Yapışkan promotor uygulandıktan sonra, çift taraflı bandı, kağıt desteği yukarı bakacak şekilde silikon levha ile hizalayın.
6. Yüzeyi düzleştirmek ve hava kabarcıklarını gidermek için bir rulo kullanarak bandı silikona kademeli olarak uygulayın (ilk uygulamadan sonra, silikon tarafı yukarı bakacak şekilde çalışmak hava kabarcıklarını görselleştirmeye ve çıkarmaya yardımcı olacaktır).
7. Yapıştırıcı promotörün düz bir yüzeyde 24 saat boyunca tamamen kürlenmesine izin verin.
8. Yapışkan silikonu en az 10 mm genişliğinde şeritler halinde kesin (7,5 mm kuyu çapı artı her iki tarafta üst üste binme).
   NOT: Kuyu plakasının diğer her sırasını kullanırken, şeritlerdeki daha geniş varyans, bitişik sıralardaki kuyuları olumsuz etkilemeyecektir, bu sadece uygulamayı kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda kuyunun tüm çevresi etrafında bir sızdırmazlık elde etmek için de gerekli olabilir.
   1. Şeritlerin, kuyu plakasının en azından bir sırasının genişliğini kaplayacak kadar uzun olduğundan emin olun.
      NOT: 24 oyuklu veya 48 oyuklu plaka gibi 96 oyuklu olmayan bir kuyucuk plakası kullanılıyorsa, şerit boyutları, plakanın belirli boyutlarına uyacak şekilde ayarlanabilir veya kesilebilir, bu da plaka boyutundan bağımsız olarak uygun kapsama alanı sağlar.

2. Çözeltilerin hazırlanması

NOT: Uçucu anesteziklerin tüm stok ve tahlil çözeltileri, uçucu bileşik konsantrasyonu kaybını önlemek için deneyden hemen önce yapılmıştır.

1. Her çözelti için (stok veya çalışma çözeltisi), bir HPLC veya sintilasyon şişesine bir hacimde uçucu olmayan çözücü (E3 embriyo suyu, DMSO, vb.) ekleyin, böylece uçucu anestezikin son seyreltilmesi ile birleştirildiğinde, toplam hacim şişeyi minimum üst boşluk bırakarak yeterince dolduracaktır (bkz. Şekil 1A).
2. Hamilton gaz geçirmez bir şırınga ile uçucu anestezik ekleyin ve şişeyi hızlı bir şekilde kapatın.
   NOT: Septum kapaklı şişelerdeki stok çözeltileri, çözeltinin gaz geçirmez şırıngalarla transferi yoluyla daha fazla seyreltmeyi kolaylaştırmak için kullanılabilir.
3. Ardından, şişeleri (girdap, sonikasyon) gerektiği gibi karıştırın ve zebra balığı tabakları hazırlarken geçici olarak saklayın.

3. Davranışsal deneyin kurulması

NOT: Protokolün bu adımı biraz pratik gerektirebilir. Tekniğe alışana kadar balık veya değerli malzeme içeren solüsyonlar olmadan çalışılması tavsiye edilir.

1. Bir larva zebra balığını (5 dpf) cam 96 oyuklu plakanın diğer her sırasına aktarın.
   NOT: Diğer her sıranın boş bırakılması, kuyular adım 3.4'te kapatıldığından, bitişik kuyuların yayılmadan kirlenme potansiyelinin azalmasına izin verir.
2. E3 çözeltisini her kuyucuktan dikkatlice çıkarın. Bu, her seferinde bir sıra veya hızlı bir şekilde çalışabiliyorsa tüm plaka üzerinde yapılabilir.
   NOT: Potansiyel stresi azaltmak için larvaların çözelti dışında kaldığı süre en aza indirilmiştir. Stresi en aza indirmek için ilaç içeren çözeltinin eklenmesinden önce çözeltinin sadece kısmen çıkarılması da dahil olmak üzere farklı deneysel ihtiyaçlara dayalı olarak alternatif prosedürler kullanılabilir. Protokol, herhangi bir potansiyel stresi telafi etmek için hayvanlara verilen dengeleme süresi, çözelti karıştırma verimliliği ve ilaç içeren bir çözeltinin konsantrasyonlarının doğruluğu dahil olmak üzere deneyin ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanmalıdır, eğer E3'ün tamamı çalışma çözeltisinin eklenmesinden önce çıkarılır.
3. Daha sonra, sıradaki her bir kuyucuğu deneysel çözelti ile doldurmak için bir transfer pipeti kullanın. Baloncuk sokmamaya dikkat edin. Her kuyuyu aşırı doldurun (Şekil 1B).
4. Adım 1'de yapılan yapışkan silikon şeritleri kullanarak şeridi hızlı bir şekilde aşağı doğru bastırın (Şekil 1C). Bu, kabarcık oluşumunu önlemeye yardımcı olur ve balıkların bitişik kuyulara taşmasını önler.
5. Her bir kuyunun sızdırmaz olduğundan emin olmak için plakanın üstüne sıkıca bastırın.
6. Çözelti değiştirilene ve kuyu plakasının diğer her sırası için kuyucuklar kapatılana kadar 2-5 arasındaki adımları tekrarlayın (Şekil 1D).
7. Plakayı yavaşça ters çevirin ve hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Hava kabarcıklarının varlığı, zebra balığı hareketinin görselleştirilmesini engelleyecektir.
8. Plakayı davranış gözlem ünitesine yerleştirin (silikon yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde) ve davranış deneyini gerçekleştirin (ayrıntılar için Sonuçlar bölümüne bakın).

Sonuçlar

Geleneksel açık kuyu gözlemi ile karşılaştırma
Yapıştırıcı sızdırmazlığın kendiliğinden hareket üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını değerlendirmek için, açık ve kapalı kuyulardaki kontroller arasında bir karşılaştırma yapılmıştır. Şekil 2A'da görüldüğü gibi, bu makalede açıklanan deneylerde kullanılan standart ~ 30 dakikalık süre boyunca bu gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir hareket farkı gözlenmemiştir. Diğer deneysel paradigmaların daha uzun deneysel maruziyete ihtiyaç duyabileceğini kabul ederek, 2 saatlik bir zaman kursu gerçekleştirildi ve 2 saatlik işarete kadar harekette istatistiksel bir fark ortaya çıkmadı (bkz. Şekil 2B). Daha uzun deney süresi, muhtemelen harekette daha da büyük bir diferansiyel ile sonuçlanacaktır. Önceki çalışmalar, hipoksinin yüzme davranışı¹⁹ üzerindeki olumsuz etkisini ölçmüş ve sonuçta deneysel sonuçların bütünlüğünü tehlikeye atmıştır. Bu nedenle, hipoksi ve/veya CO₂ üretiminin, açık kuyu kontrollerine kıyasla SM'deki bu sapmanın en olası nedenleri olduğu varsayılmaktadır. Ne yazık ki, kapalı kuyudan uçucu anestezik kaybını önleyen gaz geçirmez conta, diğer gazların kapalı çözeltinin içine veya dışına difüzyonunu da önler. Bu, elbette, balıklar tarafından üretildikleri ve tüketildikleri için_CO2 ve oksijenin sınırlı difüzyonu anlamına gelir. Bu, bu yöntemle mümkün olan deney uzunluğu açısından önemli bir sınırlamadır. Zamanla, muhtemelen metabolizmaya bağlı olarak, daha önce kabarcıksız kuyularda küçük kabarcıkların oluşmaya başladığını not etmek de önemlidir. Ancak test sırasında bu baloncuklar zebra balığının yazılım tarafından izlenmesini engellemedi. 1,5 saate kadar olan deneylerin (artı dengeleme süresi), bu vahşi tip zebra balıklarının SM izlemesi üzerinde önemli bir etkisi olmadığı görülmektedir, ancak daha fazla hareket sergileyen veya diğer artan metabolik talepleri olan balıklar bu uzunluktaki deneyler için uygun olmayabilir.

Zamanla uçucu anestezik konsantrasyonu
Zaman içinde tutarlı uçucu anestezik konsantrasyonunu sağlamak için, HPLC tarafından belirlenen anestezik konsantrasyonun zaman seyrini ölçmek için zebra balığı içermeyen kuyular kullanıldı. Her bir kuyucuğa aynı çözelti ilave edildi ve sevofluran veya izofluran konsantrasyonu her 15 dakikada bir 3 saat boyunca ölçüldü (aynı kuyudan tekrarlanan ölçümlerin aksine, her ölçüm farklı bir kuyudan). Şekil 3'te görülebileceği gibi, izoflurandan (25 ° C'de 238 mmHg buhar basıncı) daha düşük bir buhar basıncına sahip olan sevofluran (25 ° C'de 197 mmHg buhar basıncı) ile zaman boyunca neredeyse hiç anestezik kaybı olmamıştır ve bu da 3 saatte% 4'lük bir kayıp göstermiştir. Hiçbir uçucu anestezik, birçok davranışsal deney için tipik olan 30 dakika ila 60 dakikalık aralıklarla kayda değer bir kayıp göstermedi.

Larva zebra balığında sevofluranın gücü
Bu teknik, zebra balığı^15'teki uçucu anesteziklerin gücünü ölçmek için kullanılmıştır ve daha önce kullanılan diğer metodolojilerden daha üstün olabilir⁴. Spontan hareket (SM) ve ortaya çıkan hareket (EM) ölçümleri ile sevofluran için medyan etkili konsantrasyon (EC₅₀) Şekil 4'te gösterilmektedir. Kapalı kuyu tekniği ile EC₅₀ değerleri SM için 62 μM (%95 CI: 49-81) ve EM için 126 μM (%95 CI: 81-193) olarak belirlenmiştir. SM değeri, daha önce bildirilen 76 μM'lik EC₅₀ ile karşılaştırılabilir (% 95 CI: 50-114). Bununla birlikte, EM için daha önce bildirilen 240 μM (% 95 CI: 169-328) değeri, burada elde edilen değerin neredeyse iki katıdır:⁴. Bu metodolojinin benzer bir HPLC çalışmasını (hava geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için vakumlu gres ve bir cam lamel yapmadan) yapmadan, bu farkın zaman içinde uçucu anestezik kaybından kaynaklanıp kaynaklanmadığı kesin olarak söylenemez. Bununla birlikte, özellikle EM (akustik musluk) için uyaranın davranışsal gözlem süresinin sonunda kaydedildiği göz önüne alındığında, rasyonel bir hipotezdir. Kuyu kapatma yönteminden bağımsız olarak, herhangi bir sevofluran konsantrasyonu kaybı, daha sonraki zaman noktalarında en büyük etkiye sahip olacaktır. Tabii ki, bu farklılıklar zebra balığının genetik geçmişi gibi altta yatan diğer faktörlerden kaynaklanıyor olabilir.

Şekil 1: Temel prosedür adımları. (A) Uçucu çözeltilerle çalışırken, her şişedeki üst boşluğu en aza indirmek için seyreltme planlaması yapılır. (B) Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için zebra balığı içerenlere deneysel çözeltiler eklenirken kuyuların aşırı doldurulması gerçekleştirilir. (C) Hava sıkışmasını önlemek için plakanın bir tarafından diğer tarafına silikon yapışkan şeritler uygulanır. (D) Her iki sıra, bitişik kuyuların kirlenmesini önlemek için deneyler için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kapalı ve açık kuyulardaki hareketin karşılaştırılması. (A) Davranış biriminde 15 dakikalık bir dengelemeyi takiben 0 dakikadan 4 dakikaya kadar toplam spontan hareket karşılaştırılır. Döllenmeden 5 gün sonra (dpf) zebra balığının açık kuyularda (254 mm, %95 CI: 185-322) ve kapalı kuyularda (257 mm, %95 CI: 186-326) hareketi anlamlı bir fark göstermez (P = 0.374). (B) Zebra balığı davranış sisteminde 15 dakikalık bir alışma periyodunun ardından, balıklar (N ≥ 36) her yarım saatin başında 4 dakikalık bir süre boyunca spontan hareket (kat edilen toplam mesafe) için gözlemlenir. Veriler, 0 saatlik zaman noktasına yapılan istatistiksel karşılaştırmalar (ANOVA) ile yüzde kontrol (açık kuyular) olarak gösterilir. <0.05'lik bir P değeri eşiği kullanılarak, kırmızı ile vurgulanan 2 saatlik işarette (P = 0.0139) açık ve kapalı kuyular arasındaki harekette önemli bir fark gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sevofluranın zamanla geri kazanılması. Silikon yapıştırıcı ile kapatılmış cam kuyu plakalarındaki sevofluran ve izofluran konsantrasyonları, 3 saatlik bir süre boyunca yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile belirlenir. Üç yinelemenin ortalaması olarak hesaplanan kurtarma yüzdesi, grafiğin alt kısmında gösterilir. İzofluran, muhtemelen sevoflurana (25 ° C'de 197 mmHg) kıyasla daha yüksek buhar basıncı (25 ° C'de 238 mmHg) nedeniyle 3 saatte konsantrasyonda% 4'e kadar bir kayıp sergiler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sevofluran EC₅₀ eğrileri. Kapalı kuyularda bir sevofluran EC₅₀ eğrisi, 5 dpf zebra balığının spontan hareketine (4 dakikalık bir süre boyunca) ve ortaya çıkan harekete (akustik bir musluktan sonra 1 saniyelik süre) dayalı olarak belirlenir. Hareket, yalnızca DMSO kontrollerine göre ölçeklendirilir. Nihai EC₅₀ değeri, spontan hareket (SM) için 62 μM (%95 CI: 49-81) ve ortaya çıkan hareket (EM) için 126 μM (%95 CI: 81-193) olarak hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu makale, vahşi tip balıklarda uçucu anestezik potansiyelini ölçmek için kullanılan larva zebra balığına sevofluran gibi uçucu anesteziklerin kolayca uygulanması için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu teknik kavramsal olarak basit olsa da, uçucu maddelerin kaybını en aza indirmek için kısa bir zaman diliminde yeterince sızdırmaz, kabarcıksız bir kuyu sırası sağlamak pratik gerektirebilir. Bu yöntem uçucu bileşikler için tasarlandığından, sadece silikon yapıştırıcının kuyu plakasına dikkatli bir şekilde uygulanmasını değil, aynı zamanda uçucu bileşik konsantrasyonlarının doğruluğunu optimize etmek için deneysel çözeltilerin dikkatli bir şekilde hazırlanmasını da gerektirir.

Havanın sıkışması, doğru görselleştirmeyi ve izlemeyi engelleyebilir. Sızdırmazlık uygulamasına ek olarak, her bir kuyucuğun dikkatli bir şekilde doldurulması ve incelenmesi çok önemlidir, çünkü sızdırmazlıktan önce mevcut olan herhangi bir kabarcıkların mühürleme işlemi sırasında çıkarılması olası değildir. Kuyuların aşırı doldurulması ayrıca her bir kuyuda havanın sıkışmasını önlemeye yardımcı olur. Bununla birlikte, çok fazla doldurma, balıkların istenmeyen şekilde bitişik kuyulara aktarılmasına neden olabilir. Böyle bir durumda, daha az doldurmaya çalışın. Aşırı dolumun en aza indirilmesi, yalnızca balığın kasıtsız olarak bitişik kuyulara aktarılmasına yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda büyük miktarlarda fazla çözelti varlığında sızdırmazlık için kullanılan yapıştırıcının etkinliğini artırabilir. Yapıştırıcı, kısmen ıslak yüzeylere yapışma kabiliyeti nedeniyle özel olarak seçilmiş olsa da, temiz ve kuru bir plaka ile başlamak, başka hiçbir maddenin yapışmaya müdahale etmemesini sağlar, böylece deney düzeneğinin genel bütünlüğünü iyileştirir. Yapıştırıcı uygulamasından önce kuyuda kabarcık olmamasına rağmen, aşırı doldurmanın optimizasyonu ve silikon yapıştırıcı uygulama tekniğine rağmen kabarcıklar hala devam ediyorsa, bunun nedeni çok dar yapışkan şeritlerin kullanılması olabilir. Yeterince geniş olmayan şeritler, uygulama işlemi sırasında veya sonrasında hava girmesini önlemek için sızdırmaz olmayabilir veya yetersiz sızdırmaz olabilir. Bu teknikle ilgili bir başka potansiyel hata girişi, silikondaki kırışıklıklardan, yapıştırıcının yetersiz sızdırmazlığından (yetersiz yapıştırıcı astarı, kürlenme süresi veya silikon uygulamasından önce yüzeylerin temizlenmesi) kaynaklanabilen yapışkan silikon şeritler tarafından üretilen contanın kalitesidir. Yapıştırıcının kendisi, koruyucu bir destek olarak silikon olmadan yeterince sıkı bir sızdırmazlık sağlıyor gibi görünse de, yapıştırıcı tek başına, bir deney süresince dolaşan su banyosuna karşı koruma sağlamak için yeterli su direnci sağlayamayabilir.

Cam plakalar bu uygulama için çok uygundur, çünkü birçok plastik^20'den farklı olarak, uçucu anestezikler gibi hidrofobik maddelerle uyumludurlar, yüzeyleri düzdür (tipik plastik kuyu plakalarının aksine), silikon şeridin yapışmasına izin verir ve şeffaf tabanlara sahiptir (Teflon ve bazı plastik plakaların aksine). Kuvars kuyu plakaları, daha yüksek çözünürlüklü görüntülemenin gerekli olduğu deneyler için daha fazla optik netlik sağlayabilir. Burada sunulan tüm örnek veriler 96 oyuklu cam plakalarda elde edilmiştir ve diğer benzer plakalar daha büyük kuyu formatlarında ticari olarak mevcuttur, ancak bunlar yazarlar tarafından test edilmemiştir. Daha büyük bir kuyuda daha fazla çözelti, daha fazla oksijen mevcudiyeti nedeniyle bu teknikle yapılan bir deneyin potansiyel süresini artırabilir ve ayrıca daha eski zebra balıkları ile deneyleri kolaylaştırabilir, ancak bir deneyin bu şekilde değiştirilmesi daha fazla doğrulama gerektirecektir. Bu tekniğin diğer modifikasyonları, bu tekniğin diğer davranışsal paradigmalara (örneğin, ışık gibi uyaranlar)²¹, çeşitli genetik modellere, diğer farmakolojik çalışmalara (örneğin, ilaçların birlikte uygulanması) ve hatta belki de görüntüleme çalışmaları için adaptasyona uygulanmasını içerir.

Bu yöntem, davranışsal gözlem amacıyla uçucu bileşiklerin zebra balığına uygulanması için basit ve erişilebilir bir yöntem sağlar. Zebra balığı, anesteziklerin, özellikle intravenöz (IV) anesteziklerin (propofol, etomidat, ketamin, vb.) incelenmesi için giderek daha popüler bir modeldir. Bu kısmen ilaç uygulamasının kolaylığından kaynaklanmaktadır, ancak aynı zamanda IV anesteziklerin suda yaşamayan hayvan modellerine (solucanlar, sinekler, kemirgenler, insanlar vb.) uygulanmasına kıyasla azaltılmış farmakokinetik hususlar da vardır. kararlı durum uygulaması için hedef kontrollü infüzyon modelleri gerektirir². Bu, bu hayvanlarda uçucu ajanların uygulanmasıyla karşılaştırılabilir, bu da hayvanı bir kutuya koymak ve oksijen / hava ile karıştırılmış ajanı solumasını sağlamak kadar basittir. Uçucu maddelerin suda yaşayan hayvanlara (zebra balığı, kurbağa yavruları) uygulanması, kapalı bir sulu ortam gerektirdiğinden daha karmaşıktır. Bu diferansiyel, belirli anestezikler için belirli hayvan modellerinin kullanımını bölme eğilimindedir, ancak burada sunulan yöntemle, her iki anestezik sınıfı da aynı hayvan modeline kolayca verilebilir. Farklı uygulama yollarına rağmen çeşitli deneysel paradigmaları tek bir modelde kolayca karşılaştırabilme. Bu aynı zamanda, fizyolojik tepkilerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştıran genetik izlenebilirlik, hızlı gelişim ve şeffaf embriyolar dahil olmak üzere zebra balığının diğer güçlü yönlerini kullanacak şekilde uçucu anesteziklerin kullanımı için de uyarlanabilir. İzofluran ve sevofluran gibi uçucu anesteziklerin zebra balıklarındaki etkisini anlamak, etki mekanizmalarının ve yan etkilerinin anlaşılmasını artırabilir. Bu yeni metodoloji, zebra balıklarında uçucu anesteziklerin araştırılması için sağlam bir çerçeve sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well glass microplates	Zinsser North America	3600500	"These glass microplates are made from special high purity, temperature resistant borosilicate glass and the surfaces are acid polished. Plates are rectangular in the standard SBS microplate footprint (85 x 127 mm).These glass reactor microplates are designed primarily for use with chemistry applications and are resistant to temperatures up to 530° C. They can be autoclaved. They are machined from a homogeneous glass sheet and feature uniform geometry and shape to provide consistent temperatures from well to well (within 0.2 degrees C typical)."
2.0 mL Clear, Large Opening, 9 mm Thread Vials	Chemglass Life Sciences	CV-1150-1232	"With a 40% larger opening, these vials are specifically designed to work in robotic arm auto samplers. They also incorporate the unique Step Vial design that precisely centers a limited volume insert in the neck of the vial. "
3M Double Coated Tape 9490LE	AbbVie Inc	24WG90	"3M Double Coated Tape 9490LE with 3M Laminating Adhesive 300LSE provides high bond strength to most surfaces, including many low surface energy plastics such as polypropylene and powder coated paints. The acrylic adhesive also provides excellent adhesion to surfaces contaminated lightly with oil typically used with machine parts. 3M double coated tape 9490LE offers the added feature of 3M Laminating Adhesive 300MP on one side to provide excellent bond strength to a variety of foam and fabric materials (6 in x 5 yd)"
DanioVision Observation Chamber	Noldus	DVOC-0041	"DanioVision is a complete system, designed for the high-throughput testing of zebrafish larvae in multi-well plates. It includes the Observation Chamber and renowned EthoVision XT video tracking software."
DanioVision Temperature Control Unit	Noldus	DVTCU-0011	"The DanioVision Temperature Control Unit is a flow-through system: water flows evenly underneath the well plate at the temperature of your choice. The temperature is the same all throughout the well plate."
Ethovision XT16 software	Noldus	NSE-EV-BASE	"EthoVision XT is the most widely applied video tracking software that tracks and analyzes the behavior, movement, and activity of any animal, trademarked by Noldus"
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC # 66794-017-10	Liquid for inhalation, a nonflammable nonexplosive inhalation anesthetic, containing 100 mL isoflurane. Stored at controlled room temperature 20º to 25º C
Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 Clear	3M	"62-3916-0860-1 (Product ID) C2103N (Lot)"	"3M Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 is designed for use on difficult-to-bond low surface energy elastomers, such as EPDM, silicone and other rubbers. Surface preparation and application are straightforward and the adhesive primer is fast drying to keep jobs moving quickly."
Silicone Sheets 0.5 mm thick	various suppliers	N/A	translucent silicone sheets were purchased from multiple suppliers
Speedball Pop-in Hard Rubber Brayer with Plastic Frame, 4 Inches"	Speedball	793728	"The Speedball Pop-In Hard Brayer has a roller that snaps out for easy cleaning. Plastic, one piece frame with detachable 4 inch wide roller. Made from pure natural gum rubber with a ground finish. The hard rubber brayer is 4 inches wide with a sturdy plastic frame and great for glue application"
SureSTART 9 mm Screw Caps, Level 2 High-throughput Applications, Type: AVCS Screw Cap Black PP, White Silicone/RED PTFE Septa 1.0 mm	Thermo Scientific	6ASC9ST1B	"Use Thermo Scientific SureSTART 9 mm Screw Caps with screw vials that have a 9 mm opening. The performance Level 2 caps are manufactured and tested to ensure low bleeding, robustness, and reproducibility of results for y routine GC-MS and LC-MS analyses. Choose from polypropylene caps with all-purpose silicone/PTFE septa of various hardness values designed to reduce autosampler needle issues. Our AVCS caps incorporate Advanced Vial Closure System technology to ensure optimal seal compression when closing a vial."
Ultane Sevoflurane	AbbVie Inc	NDC # 0074-4456-04	Volatile Liquid for Inhalation, is packaged in amber colored bottles containing 250 mL sevoflurane. Stored at controlled room temperature 15º to 30º C
Wheaton Liquid Scintillation Vials, Caps Attached to Vials, Glass, Metal Foil / Pulp, 24-400, 20 mL	DWK Life Sciences	986561	20 mL scintillation vials converted from Type I borosilicate glass tubing, PET, or HDPE. Available with cap attached.