Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (CBET 0.846.453) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Standart SU-8 fotolitografi 1 (Bu video görünmez) kullanılarak silikon ustaların Fabrikasyon. <ol><li> Mikroakışkan ağ ve kemotaksis odasına içeren PDMS kalıp imalatı için SU-8 &quot;master&quot; (SÜ-8 2025, MicroChem, Newton, MA) oluşturmak için standart SU-8 fotolitografi yöntemleri kullanın. Böyle bir ana kalıp herhangi bir mikroimalat tesisi (örneğin, Stanford Mikroakiskan <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">Döküm</a> http://thebigone.stanford.edu/foundry/ imal edilebilir) . </li><li> PDMS çoğaltma önce ana PDMS kolay bırakma kolaylaştırmak için bir vakum kaynağına bağlı bir desikatöre fluorosilane buhar SU-8 master ortaya bir kağıt havlu fluorosilane bir damla ekleyin ve bir dakika süreyle vakum uygulamak. Vakum çıkarın ve fluorosilane birikimi için 30 dakika izin verin. SU-8 ana ileride kullanmak üzere kapalı bir kapta tutun. </li></ol> 2. SU-8 ustadan PDMS Replica kalıplama: akışkan katman ve kontrol katmanı SU-8 master PDMS çoğaltma kalıplama yapılır. <ol><li> 10:01 ağırlıkça PDMS pre-polimer ve çapraz bağlayıcı karıştırın. 1 saat (ya da hava kabarcıkları PDMS karışımından kaldırılana kadar) bir desikatöre oranı ve gazını. </li><li> Petri SU-8 ana yerleştirin ve dikkatli bir şekilde istenilen kalınlıkta SU-8 ustanın üstüne PDMS karışımı dökün. </li><li> PDMS ve 80 ° C iki saat PDMS tedavi SU-8 ana kalıp içeren petri ısıtın. </li><li> Kaldır tedavi PDMS-kapalı ocak SU-8 master ve SU-8 master PDMS kalıp kabuğu. İstenen yapı PDMS kalıp içinde gömülü olacaktır. </li><li> 20 gauge künt uç iğne kullanarak degrade jeneratör ve hücre giriş boru PDMS kalıp delgeç. </li></ol> 3. PDMS cihazları Bağlar: <ol><li> Izopropanol ve azot veya hava akımı ile kuru bir cam mikroskop lamı temizleyin. </li><li> PDMS ve bir plazma temizleyici oksijen plazma cam slayt Açığa. </li><li> Cam slayt ile temas PDMS kalıp getirin. Temas slayt ve PDMS kalıp Isı 65 ° C 15 dk. </li></ol> 4. PDMS cihaz Montaj <ol><li> Bir jilet kullanarak boru kesme, 45 °, cihaz için gerekli olan doğru uzunlukta açı. </li><li> Forseps kullanarak aygıt (örneğin, çıkış) delikli deliklere hortumun bir ucunu. </li><li> Forseps kullanarak, hortumun diğer ucunu bir künt 30-gauge iğne takın. </li><li> Kalan tüm delikleri için adım 4.2 tekrarlayın. </li><li> Kemotaksis tampon (CB), bir 3ml şırınga şırınga hava kabarcıkları özen 1mL toplayın. </li><li> Çıkış hortumun bir ucunu bir iğne merkezi sabitleyin. </li><li> CB iğne hub ekleyin ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için iğne hub dokunun. </li><li> CB şırınga ucu biraz dışarı itin ve hava hapsi olmadan 3ml şırınga iğne hub bağlamak. </li><li> CB, CB ile geriye kalan tüm iğne hub dolana kadar cihaz üzerinden itin. Bu hava kabarcıkları büyük bir çoğunluğu kaldırmanız gerekir. </li><li> CB ile chemoeffector denenmektedir uygun konsantrasyonları içeren iki 500μL şırınga doldurun. Şırınga içeriğini küçük bir damla dışarı iterek ve dokunarak ve iğne merkezi sıvı açılan takılarak hava kabarcığı oluşumunu ortadan kaldırır. </li><li> Benzer şekilde, CB bakteri girişine içeren bir şırınga bağlayın. Bakteri cihazın içine sunulduğunda bu silinecektir. </li></ol> 5. Son derece hareketli E. Büyüme coli <ol><li> Grow E. gecede kültürlerin coli sallayarak Tripton suyu (TB) ile 32 ° C&#39;de 20 ml plazmid bir GFP ifade ile RP437. Plazmid korumak için uygun antibiyotik konsantrasyonları ekleyin. Protokolde, düşük kopya cihaz floresan dayalı bakteri tespit için bir plazmid pCM182 kullanın. E. için coli, 32 büyüyen kültürler ° C motilitesi yüksek sıcaklıklarda daha düşük olduğu gibi, yüksek hareketlilik açısından tavsiye edilir. </li><li> 250 mL Erlenmeyer şişesinin ~ 0.05 600Nm bir optik yoğunluk TB 20 ml kültür aşılamak için bir gecede kültür kullanın. 32 sallayarak kültür büyütün ° C </li><li> 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de düşük hızda santrifüj ~ 0.35 0.45 OD 600 hücreleri Hasat. </li><li> Chemoeffector kanalın ortasında beklenen konsantrasyon içeren CB ~ 0.35 OD 600 hücreleri tekrar </li><li> GFP ifade canlı hücreler bir OD 600 ~ 0.35 RFP etiketli ölü hücreleri ekleyin. Ölü hücreleri (kırmızı), herhangi bir göç akışı etkileri nedeniyle olmadığından emin olmak için bir iç kontrol sistemi olarak kullanılmaktadır. </li></ol> 6. İzleme kemotaksis <ol><li> Hücreye giriş iğne CB kısmını çıkarıngöbeği. Yedek hücre süspansiyonu ile. </li><li> 50μL şırınga yavaşça yeniden süspanse hücreleri ile doldurun. Bu adım, kamçı makaslanmış gibi yavaş yavaş yapılması gerektiğini ve motilite azaltacaktır. </li><li> 50μL şırınga adım adım 4.10 &#39;da açıklandığı gibi giriş-iğne hub&#39;a takın. </li><li> Görüntü elde etmek için yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop aşamasında cihazı yerleştirin. Giriş şırınga (her ikisi de 500 mcL degrade şırınga ve 50 mcL hücre şırınga) şırınga pompası içine yerleştirin ve degrade oluşur ve hücreleri borudan akan akışını başlatmak. </li><li> Hücreleri kemotaksis odasına girin görüntüleme önce istikrara kavuşturmak için sistem için ~ 20 dakika bekleyin. </li><li> Odanın uzunluğu boyunca farklı yerlerde (farklı pozlama süreleri karşılık gelen), yeşil (canlı) ve kırmızı (ölü) floresan görüntüleri toplayın. Genellikle, 100 görüntü 3 saniye aralıklarla her yerde toplamak. </li></ol> 7. Veri analizi: aşağıdaki adımları kullanarak veya herhangi bir piyasada bulunan görüntü analiz programı (örneğin, ImageJ, Metamorph) Matlab yazılmış basit kodlar kullanılarak yapılabilir. <ol><li> Arka plan piksel görüntü (yani, set eşik piksel yoğunluğu ve eşik daha az bir yoğunluk var tüm pikselleri kaldırmak) çıkarın. Analizinde bu gürültü en aza indirir. </li><li> Görüntünün merkezini belirlemek için ölü hücreleri (kırmızı floresan) pozisyonunu kullanın. Ölü hücreleri yok kemotaksis gösteren bu yana, bu hücreleri kemotaksis odasına girdi ve herhangi bir göç yokluğunda tespit olacaktır konumu temsil eder. </li><li> Görüntüyü canlı hücreleri (yeşil floresan) bulun. </li><li> Kanal içine görüntü bölün ve her kanalda canlı hücrelerinin sayısını belirlemek. Önceki 3, 1050 mikron genişliğinde kemotaksis odasının her ~ 16 mikron genişliğinde 64 kanal ayrıldı. </li><li> Tüm fotoğraflar için 7.1 7.3 adımları tekrarlayın ve her kanal için tüm görüntüleri üzerinden toplam hücre sayıları toplamı. Bu deney süresi boyunca her kanal tespit edilen toplam hücre sayımı verir. </li><li> +1 Ve -1 çarpanı, yüksek konsantrasyon (sağda) ve düşük konsantrasyonda (sol), ölü hücreler kenarlarında bulunan Her hücre atanır aşağıdaki gibidir: göç yönü temsil kemotaksis partisyon katsayısı (TBM), hesaplayın sırasıyla. Yani, degrade aşağı hareket hücreleri -1 ile çarpılır ise degrade +1 ile çarpılır kadar göç bir hücre. Çarpılarak tüm değerleri eklendi ve tespit edilen hücrelerin toplam sayısı normalize edilir. Örneğin, bir TBM değeri 0.40, toplam bakteri% 40 daha düşük konsantrasyonda tarafı (yani, daha fazla bakteri degrade yukarı hareket tespit edildi chemoeffector Cezbedici) daha yüksek konsantrasyon tarafına taşınmış olduğunu gösterir. </li><li> Kemotaksis göç göç ettiğini hücreleri mesafe ile orantılı bir faktör her kanalda Ağırlık hücre sayısı aşağıdaki gibidir: mesafe hücrelerinin göç, seyahat ağırlığında katsayısı (CMC), hesaplayın. Yüksek konsantrasyon tarafına yarım hareket bir ağırlık faktörü 0,5 ise, uzak yüksek konsantrasyon pozisyonlar (kanal 64) ile hareket eden bir hücre +1 bir ağırlık faktörü göz önüne alındığında, ve uzak bir hücre -1 ile düşük konsantrasyon konumunu ağırlıklı. Tüm ağırlıklı hücre sayıları toplamı ve CMC oluşturmak için hücre sayısı normale. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar 3,4: Biz kullanılan mikroakışkan cihazı (Şekil 1A) E. kemotaksis araştırmak için buradayız cezbedicilerde (aspartik asit, autoinducer-2) ve kovucular (Niso 4, indol) 3,4 Degradelerde coli. Prototip kemotaksis zorlanma 5 E. coli RP437 ifade GFP kanamisin-öldürülen E. ile birlikte kullanılır. akış etkilerini izlemek için kırmızı floresan proteini ifade coli TG1 hücreleri. Şekil 1B μFlow cihazda oluşan konsantrasyon farkı gösterilmiştir. Hücre giriş üzerinden akış ve 0 100 fluoresscein ng / ml cihaz yılında kurulmuştur istikrarlı bir eğim vardı, böylece kapatılmış oldu. Cihaz üzerinde piksel yoğunluğu floresein konsantrasyonunun profilini belirlemek için kullanılmıştır. Veri kemotaksis odasına girdiğinizde bakteriler doğrusal bir degrade karşılaştıkları göstermektedir. Şekil 2A ve B E. floresan görüntüleri gösterir . aspartik asit (0 100 mcM) ve Niso 4 (0 225 mcM) degradeler yanıt coli RP437 göç. Gözlenen bu kanonik cezbedici yanıtları ve itici tahmin edilmektedir. Şekil 3A E. sayısal dağılımını göstermektedir coli RP437 konsantrasyon farkı olmaması (yani, boş degrade aspartik asit),Şekiller 3B ve C aspartik asit ve Niso 4 gradyanlar dağılım gösterir. Bu yanıtların özgüllük (yani, göç önyargı) E. olarak açıktır coli RP437 Δ tar suşu (örneğin, E. coli aspartik asit ve nikel anlamda kullanılan Tar kemoreseptör eksik suşu), aspartik asit veya 4 Niso bir konsantrasyon gradiyenti varlığı göç önyargı göstermek değil . Mekansal dağılımının profilleri belirgin eğilimleri de hesaplanan TBM ve CMC değerleri ile tutarlı. E. göç TBM değerleri aspartik asit veya Niso 4 gradyanlar coli RP437 sırasıyla 0,33 ve -0,33,. Ilgili CMC değerleri sırasıyla 0,13 ve -0,14,. E. aksine, TBM ve CMC değerleri aspartik asit veya Niso 4 gradyanlar coli RP437 Δ tar gerginlik önemsizdir. Buna ek olarak, bir boş degrade aspartik asit TBM ve CMC sırasıyla 0,03 ve 0,02, ve bir degrade yokluğunda göç yanlılık eksikliği gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" /> Şekil 1. Aygıt şematik ve konsantrasyon farkı. (A) mikroakışkan kemotaksis cihazının şematik gösterimi. Cihaz bir degrade karıştırma modülü (20 x 100 x 18750 mm) ve kemotaksis gözlem modülü (20 x 1050 x 11500 mm) oluşur. Cihaz giren iki degrade kanal genişlikleri 500 mm ve bakteri giriş genişliği 50 mm. Içerlek sinyal molekülüne (gri) ve buna yanıt olarak göç eden bakterilerin bir degrade gösteriyor. Ise ölü bakteri açık oval olarak gösterilen Live bakteri, katı oval olarak tasvir edilmektedir. (B) 0 ile 100 ng / ml floresein arasındaki konsantrasyon farkı cihaz oluşturulan ve floresan mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Floresan görüntüleri 30 dakika sonra elde edilen ve görüntü analizi ile ölçüldü. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. E. Kemotaksis coli RP437 mikroakışkan cihaz. E. coli RP437 bir degrade maruz kalan (A) 0-100 mcM L-aspartat veya (B) 0-225 cihaz mcM Niso 4 ve göç canlı bakteri (yeşil), L-aspartat doğru veya nikel 30 dakika boyunca her 2.5 saniye görüntülenmiş. Ölü bakteriler (kırmızı), cihazın akış etkileri kontrol olarak görev yaptı. Görüntü analizi program3 geliştirilen bir evi kullanılarak ölçüldü. Gösterilen veriler, üç bağımsız deneyler temsilcisi sözde renkli görüntüler. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Şekil 3a" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Şekil 3b" /> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Şekil 3c" /> Şekil 3: kanonik cezbedici ve itici göç profilleri Niceleme. Yanıt mikroakışkan cihaz RP437 mekansal dağılımı (A) üniforma mcM 100 L-aspartat (yani, degrade), (B) aspartat 0 100 mcM degrade, (C) ve Niso 4 0 225 mcM degrade . RP437 hücrelerin ölü hücreleri dağılımı bir düz çizgi olarak gösterilir, dağıtım kesik çizgi olarak gösterilir ve RP437 eda + Δ tar hücrelerinin dağılımı, bir noktalı çizgi olarak gösterilir . Gösterilen veriler üç bağımsız deneyler için ortalaması alınır.

<ol>
	<li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly(dimethylsiloxane)+using+solid-object+printing.">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li><li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration.">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li><li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable,+Competing+Gradients.">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li><li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis. , (2009).</li><li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp;amp, M. a. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis.">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li></ol>

Kemotaksis bölüm katsayısı (TBM) ve kemotaksis göç katsayısı (CMC), Mao ve ark 5 açıklandığı gibi hesaplanır . Düşük konsantrasyonda tarafında tespit edilen bir hücre -1 değeri verilir ise, yüksek konsantrasyon tarafına bir hücre tespit edilirse, 1 değeri verilir. Değerleri toplanır ve toplam hücre sayısına göre TBM oluşturmak için ayrılmıştır. TBM (pozitif ya da negatif) işareti göç yönü (bir sinyal doğru veya uzak) verir. TBM hücreleri ya da cezbedici bir...

a microfluidic device for quantifying bacterial chemotaxis in stable concentration gradients

Kemotaksis bakteri cezbedici kimyasalların kaynakları yaklaşım veya itici kimyasalların kaynakları önlemek için izin verir. Bakteriler sürekli akım konsantrasyonunu konsantrasyonu ile karşılaştırarak özel chemoeffectors konsantrasyonu monitör daha önce birkaç saniye tespit. Bu karşılaştırma, net hareketin yönünü belirler. Birden fazla, rekabet gradyanlar genellikle doğada bir arada olmasına rağmen, bakteriyel kemotaksis araştırmak için geleneksel yaklaşımlar cezbedicilerde ve kovucular konsantrasyonu gradyanlar yanıt göç ölçülmesi için optimal. Burada, bakterilere karşı hassas ve kararlı chemoeffectors konsantrasyon gradyanlar sunulması ve nicel olarak uygulanan degrade tepki soruşturma mikroakışkan kemotaksis model geliştirme açıklar. Cihaz istenen herhangi bir mutlak konsantrasyon ve degrade gücü bu konsantrasyon gradyanlar çok yönlü kolayca uzadıya karıştırılması ile oluşturulabilir. Cihaz yanıtı ile gösterilmiştir<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 amino asitler ve nikel iyonları degradeler.

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients at JoVE.com

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Görüntüleme.  Texas A&M University. Bu protokol, chemoeffectors istikrarlı konsantrasyon gradyanlar bakteriyel kemotaksis soruşturma için bir mikroakışkan aygıt geliştirme açıklar.

Video: A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Mikroakiskan kullanarak Bakteriyel Kemotaksis Çalışmaları - Röportaj

Biyoloji

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

Nöral Kök Hücre Motilite değerlendirilmesi Agaroz Jel tabanlı mikroakışkan Cihaz Kullanımı

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Mikroakışkan Perifusion Cihaz içindeki Multi-Parametrik Islet Perifusion Sistemi

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...