Murin ince bağırsak kript izolasyonu için, izole edilmiş murin ince bağırsağının beş milimetre x beş milimetre parçalarını uygun şekilde yıkayın. Parçaları iki milimolar EDTA içeren PBS antibiyotiklerinde 30 dakika boyunca buz üzerinde sallamadan inkübe edin. Hücre dışı matrisin veya ECM'nin katılaşmasını kolaylaştırmak için, önceden 37 santigrat derece doku kültürü inkübatöründe 24 kuyucuklu bir plakayı inkübe edin.
EDTA çözeltisini doku parçalarından aspire ettikten sonra, 25 mililitre taze soğuk PBS antibiyotik ekleyin. Ardından kabı 30 ila 40 kez elle kuvvetlice çalkalayın. Süspansiyonu 70 mikronluk bir süzgeçten bir kez filtreleyin.
Bir sonraki adıma geçmeden önce, mikroskop altında kriptoların varlığını onaylayın. Ardından, süspansiyonu üç dakika boyunca 390 G ve dört santigrat derecede santrifüj edin. Daha sonra, kript peletini% 2 sorbitol içeren 20 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın, bundan böyle sorbitol DMEM olarak anılacaktır.
Kript süspansiyonunun 10 mililitresini iki yeni 15 mililitrelik tüpün her birine aktarın. Bu kez, büyük hücre kütlelerini hücrelerden veya döküntülerden ayırmak için iki tüpü dört santigrat derecede üç dakika boyunca 80 G'lik daha düşük bir hızda santrifüj edin. Süpernatantı nazikçe aspire edin, her tüpte yaklaşık iki mililitre süpernatant bırakın.
Ardından, her tüpe 10 mililitre sorbitol DMEM ekleyin. Süspansiyonu üç dakika boyunca 80 G ve dört santigrat derecede tekrar santrifüjleyin. Süpernatantı daha önce gösterildiği gibi aspire edin ve yeniden süspansiyon için 10 mililitre sorbitol DMEM ekleyin.
Süpernatanı aspire ettikten sonra, 10 mililitre tam DMEM ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden askıya alın. Kayan kriptoları verimli bir şekilde elde etmek için süspansiyonu bir dakika dinlenmeye bırakın. Bir dakika sonra, kriptleri saflaştırmak için süspansiyonu her iki tüpten 70 mikronluk bir hücre süzgecinden taze bir tüpe filtreleyin.
Tohumlamadan önce saf kriptleri saymak için, 25 mikrolitrelik damlacıkları üç noktada altı santimetrelik bir kaba damlatın. Mikroskop altındaki kript sayısını 4X büyütmede sayın ve 25 mikrolitre başına kript konsantrasyonunu hesaplayın. Ardından, tüm filtratı 290 G'de dört santigrat derecede üç dakika boyunca santrifüj edin.
Tohumlama için, ECM'deki kriptleri 40 mikrolitre ECM başına 100 kript konsantrasyonunda askıya alın. Homojen bir süspansiyon elde etmek için hava kabarcıklarından kaçınarak beş ila 10 kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Daha sonra, önceden ısıtılmış 24 kuyucuk plakasında kuyu başına 40 mikrolitre kript süspansiyonu tohumlayın.
ECM'nin polimerizasyonu için 24 kuyucuk plakasını 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 15 dakika boyunca inkübe edin. ECM'yi fare epidermal büyüme faktörü, rekombinant fare R-Spondin 1 ve rekombinant fare noggin içeren 500 mikrolitre kültür ortamı ile örtün. Kuyu başına malzemelerin nihai konsantrasyonu burada gösterilmiştir.
Kriptleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe ederek kültürleyin. Yedi güne kadar her üç saatte bir Timelapse görüntü mikroskobu kullanarak organoid morfogenezi kaydetmek için canlı görüntüleme gerçekleştirin ve seri Z yığılmış görüntüler elde edin. Hemen hemen tüm izole edilmiş kriptler derhal kapatıldı ve epitel nişlerinden sıkıldıktan sonra koni şeklinde ortaya çıktı.
Ayrıca, son fraksiyondaki kriptler entegre edildi ve kültürde kullanım için uygundu. Organoid büyümenin timelapse görüntüleri, tomurcuklanma ile birlikte kript bölgesinde bağırsak kök hücrelerinin aktif proliferasyonunun ve farklılaşmasının meydana geldiğini ortaya koymuştur. Tomurcuklanma, hücre göçü, proliferasyon ve paneth hücre farklılaşması ile birleşti.
