Yedinci günde yaklaşık 25 milyon mitokondri donör hücresi elde edildikten sonra, üstel olarak büyüyen hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve oda sıcaklığında ve 520 g'da beş dakika boyunca santrifüj yaparak toplayın. Hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin ile yıkayın ve beş dakika boyunca 520 g'da oda sıcaklığında santrifüjleme ile tortulayın. Şimdi sonra, soğuk reaktifler kullanarak tüm mitokondriyal ekstraksiyonu dört santigrat derecede gerçekleştirin ve hücreleri veya mitokondrileri buz üzerinde tutun.
Üçüncü santrifüjlemeden sonra, bir vakum pompasına bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspirasyon yoluyla atın ve paketlenmiş hücreleri, hücre pelet hacminin yedi katına eşit bir hipotonik tampon hacminde yeniden askıya alın. Daha sonra hücre süspansiyonunu bir homojenizatör tüpüne aktarın ve hücrelerin iki dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek şişmesine izin verin. Dakikada 600 dönüşte dönen motorlu bir havaneyle birleştirilmiş homojenizatörde 8 ila 10 vuruş gerçekleştirerek hücre zarlarını kırın.
Hücre homojenatına, izotonik bir ortam oluşturmak için ilk peletin hacminin yedi katına eşit hipotonik tampon ekleyin. Homojenatı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 1.000 g ve dört santigrat derecede sabit bir rotorda santrifüj edin. Daha sonra süpernatanın sadece 3 / 4'ünü toplayın, çekirdeklerle veya sağlam hücrelerle kontaminasyonu önlemek için peletten büyük bir kenar boşluğu bırakın ve başka bir tüpe aktarın.
İşlemi iki kez tekrarladıktan sonra, mitokondriyal fraksiyonu içeren süpernatantı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpleri dört santigrat derecede iki dakika boyunca maksimum 18.000g hızında santrifüj edin. Süpernatantı atın ve mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti tampon A.İki tüpün içeriğini bir araya getirin ve daha önce gösterildiği gibi santrifüj yapın.
Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar işlemi tekrarlayın. Son santrifüjlemeden elde edilen peleti 300 mikrolitre tampon kullanarak yıkayın A.Bradford testini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Mitokondriyal alıcı hücre hattı ile füzyondan önce, nükleer proteinlerin immünotespiti ile mitokondriyal fraksiyondaki çekirdek kirleticilerinin yokluğunu değerlendirin.
Alternatif olarak, bir nükleer genin kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunu veya QPCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.
