Başlamak için, 143B insan osteosarkom hücrelerini altı kuyucuklu bir plakada tohumlayın. Hücreler% 75 birleştiğinde, her bir kuyucuktaki ortamı 10 milimolar 13C4 aspartat içeren ortamla değiştirin ve hücreleri etiketlemek için sabit bir durum elde etmek için sekiz saat boyunca inkübe edin. Metabolitleri izole etmek için, hazırlanan tamponu gece boyunca eksi 80 santigrat derecede soğutun veya kuru buz üzerine yerleştirin.
Bu arada, inkübatörden bir plaka alın ve bir pipet kullanarak ortamı her bir kuyudan aspire edin. PBS ile iki kez yıkayın ve daha fazla ilerlemeden önce kalan PBS'yi çıkarın. Şimdi plakayı kuru buz üzerine yerleştirin ve her bir oyuğa 800 mikrolitre hazırlanmış tampon ekleyin.
Hücre lizizini kolaylaştırmak için, plakayı eksi 80 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bir hücre kaldırıcı kullanarak her bir kuyucuğu kuru buz üzerinde kazıyın ve lizatı kuru buz üzerine yerleştirilmiş 15 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Lizatı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca vorteks edin ve 10 dakika boyunca dört santigrat derece ve 17.000 g'da santrifüj edin.
Daha sonra süpernatantı 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve yaklaşık altı saat boyunca yüksek bir vakum altında soğuk bir tuzakla dört santigrat derece vakum yoğunlaştırıcısında kurutun. Kurutulmuş metabolit peletini bir sonraki kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneyi sıvı kromatografisi kütle spektrometresi veya LCMS kullanarak analiz etmek için, gösterildiği gibi kurutulmuş pelet ve vortekse 100 mikrolitre HPLC sınıfı su ekleyin.
Numuneleri dört santigrat derecede maksimum hızda 10 dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra LCMS şişesine 25 mikrolitre süpernatant aktarın ve LCMS sistemine iki mikrolitre enjekte edin. Sıvı kromatografisi yapmak için, mobil faz B'nin gradyan modu altında dakikada 0,15 mililitrelik sabit bir akış hızı kullanın 20 dakika boyunca% 80 ila% 20, 0,5 dakika boyunca% 20 ila% 80 ve mobil faz A'ya karşı 7,5 dakika boyunca% 80'de tutun.Ardından, mz 70 ila 1 arasında tam bir tarama seçerek kütle spektroskopisi yapın, 000 Dalton.
Ve 70.000'de çözünürlük. AGC hedefini 10 ila altıncı arasında bir kez ve maksimum enjeksiyon süresi 20 milisaniye olarak ayarlayın. Ardından, çalışma zamanını 16,5 dakikaya ayarlayın.
Polarite pozitif olarak ayarlandı. AGC hedefi beşin gücüne kadar bire ayarlandı. Maksimum BT değeri 20 milisaniyeye ayarlandı.
Tarama aralığı ise 70 ila 1.000 kütle-şarj oranına ayarlanır. Ardından püskürtme voltajını 3.0 kilovolta ayarlayın. Ve ısıtılmış kılcal damar 275 santigrat derecede.
40 ünitede kılıf gazı akışını, 15 ünitede yardımcı gaz akışını ve bir ünitede süpürme gazı akışını seçin. 13C5 glutamin izotop izlemesi için, hücreler% 75 akıcılığa ulaştığında, ortamı iki milimolar 13C5 glutamin içeren ortama değiştirin ve ilgilenilen hücreleri etiketlemenin sabit bir durumunu elde etmek için inkübe edin. Metabolitleri daha önce gösterildiği gibi izole edin ve analiz edin.
Metabolitleri izole ettikten ve analiz ettikten sonra, 13C3 fumarat, 13C4 fumarat, 13C3 süksinat ve 13C4 süksinatın yüzde etiketlemesini hesaplayarak süksinat dehidrogenaz veya SDH aktivitesini analiz edin. Daha sonra formülü kullanarak süksinat oksidasyonunu ve fumarat indirgemesini değerlendirin. Araçla tedavi edilen koşullarda, SDH kompleksi ileri aktiviteyi destekledi ve 13C4 süksinatın 13C4 fumaratın 13C3 süksinata dahil edilmesi, 13C3 fumaratın 13C3 süksinata dahil edilmesinden daha yüksekti.
Antimisin ile tedavi edilen osteosarkom hücrelerinde, SDH kompleksi ters aktiviteyi destekledi ve 13C3 fumaratın 13C3 süksinat içine dahil edilmesi, 13C4 süksinatın 13C4 fumarat içine dahil edilmesinden daha önemliydi.
