Transfekte HeLa hücrelerinin görüntülenmesine başlamak için, görüntüleme yazılımı tarafından üretilen yoğunluk histogramlarına bağlı olarak canlı görüntü modunda bireysel floresan kanalları için yeterince uzun bir pozlama süresi seçin. Z ekseninde görüntüleme için uygun düzlem sayısını ayarlayın. Kuyu başına görüntülenecek uygun sayıda görüş alanı seçin.
Elde edilen görüntülerin kantitatif analizine başlamak için, tüm floresan kanallarından gelen tüm görüntüler için arka plan düzeltmesi yapın. Analiz edilen nesnelerin boyutuna bağlı olarak, uygun filtre boyutunu seçin. Ardından, floresan sinyalinin yoğunluğunun hücre çekirdeğine karşılık gelen kanalın arka planına oranına bağlı olarak ana nesnenin bir maskesini oluşturarak görüntü segmentasyonuna başlayın.
Verilen yapılara uygun floresan kanallarını kullanarak BrdU ve mitokondriyal DNA lekelerini temsil eden alt nesneler için maskeler oluşturun. Parametreleri ayarlayın ve tüm floresan kanalları için her maskedeki tek tek piksellerin yoğunluğunu ölçün. BrdU veya mitokondriyal DNA kanalı için toplam floresan yoğunluklarını elde etmek için, belirli bir hücre çekirdeğine atanan tüm alt nesnelerin yoğunluklarını toplayın.
Ortalama floresan yoğunluğunu elde etmek için, toplam floresan yoğunluğunu, belirli bir hücre çekirdeğine atanan alt nesnelerin alanının toplamına bölün. Görüntüleme sonuçları, kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak mitokondriyal DNA ve gen ekspresyon seviyeleri ölçülerek doğrulandı. Dideoksisitidin veya DDC ile tedavi, mitokondriyal DNA seviyelerinde çok güçlü bir düşüşe neden oldu.
TFAM ve TWINKLE helikaz susturmada daha zayıf bir etki gözlenirken, mitokondriyal DNA polimeraz gama veya POLG siRNA ile hücrelerin transfeksiyonu mitokondriyal DNA kopya sayısı üzerinde mütevazı bir etkiye sahipti. TFAM ve TWINKLE helikaz ekspresyonunun ölçülmesi, mRNA ekspresyonlarında kontrol seviyelerinin yaklaşık% 15 ila% 20'sine etkili bir azalma olduğunu doğruladı. POLG'de, mRNA ekspresyonu sadece% 30'a düşürüldü, bu da mitokondriyal DNA kopya sayısı üzerindeki beklenmedik mütevazı etkiyi açıklıyor.
