200 mikrolitre indirgenmiş serum ortamını, steril bir mikro santrifüj tüpünde ayrı ayrı herhangi bir plazmid DNA'sının iki mikrogramı ile karıştırarak başlayın. Bunu ayrı tüplerdeki diğer iki plazmid için tekrarlayın. Daha sonra yeni tüp ikide, 200 mikrolitre azaltılmış serum ortamını altı mikrolitre transfeksiyon reaktifi ile karıştırın ve içeriği pipetleme ile karıştırın.
İki tüpün içeriğini bir tüpe karıştırmadan önce tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Ayrı tüplerde, diğer iki plazmidin bir transfeksiyon reaktifi ile karıştırılmasını tekrarlayın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra, damla damla damla, transfeksiyon komplekslerini HeLa hücre kültürü tohumlu görüntüleme kaplarına ekleyerek tüm çanak boyunca eşit dağılım sağlayın. Görüntülemeden bir saat önce, karbondioksit tankı vanasını açın ve mikroskop için çevre denetleyicisini açın. Dokunmatik yüzeydeki yukarı ve aşağı okları kullanarak sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karbondioksiti %5'e ayarlayın İşlemi tamamladığınızda Set tuşuna basın.
Lazer ayarlarını yapmak için, Al sekmesini tıklatıp Lazere Genel Bakışı Aç'ı seçerek beyaz ışık lazerini açın. İletişim kutusunda, beyaz ışık lazerini açık konuma getirin. Lazer gücünü %85 olarak girinUyarma kontrolü düğmesine tıklayın ve açılır menüden maksimum gücü seçin.
Tetraetil rhodamine etil ester perkolat veya TMRE'ye başlayın, uyarma lazerini 514 nanometreye ve emisyon spektrum penceresini YFP için 524 ila 545 nanometreye ayarlayarak deney yapın. Daha sonra, MitoTracker Deep Red için, uyarma lazerini 641'e ve emisyon spektrum penceresini 650 ila 750 nanometreye ayarlayın. Benzer şekilde, TMRE için, uyarma lazerini 555 nanometreye ve emisyon spektrum penceresini 557 ila 643 nanometreye ayarlayın.
Görüntü alma ayarını, Edinme sekmesini seçip biçimi 1024 x 1024 olarak ayarlayarak başlatın. Açılır menüde hızı 600 olarak ayarlayın. Ardından Çizgi Ortalaması düğmesini tıklayın ve açılır menüden üçünü seçin.
Çift yönlü taramayı açın ve faz ve yakınlaştırma faktörünü sırasıyla 22,61 ve 1,50 olarak ayarlayın. İşiniz bittiğinde, YFP ayarına tıklayarak ve Hızlı Canlı düğmesine basarak YFP floresan sinyaline göre hücreleri seçin. Ardından YFP'nin kazancını ve yoğunluğunu ayarlayın ve ardından YFP floresan sinyaline göre hücreleri seçin.
TMRE deneyinde DMSO kontrol plakasını görüntülemek için, TMRE sinyal ayarının kazancını ve yoğunluğunu, mitokondriyal ağ yoğunluğu doygunluğun hemen altında olacak şekilde ayarlayın. TMRE için kazancı ve yoğunluğu sabit tutun. Ardından, MitoTracker ayarının kazancını ve yoğunluğunu, mitokondriyal ağın görünür ancak loş olması için ayarlayın.
Kazanç ve yoğunluk ayarları tamamlandıktan sonra, bir görüntü almak için Başlat'ı tıklatın. Deneysel koşul başına 20 hücrenin görüntülerini elde edin.
