Soya fasulyesi kotiledonlarını Agrobacterium rhizogenes ile enfekte etmek için, Agrobacterium rhizogenes PRI2659 plazmid dizisini kullanarak TI plazmid geni virD2'yi tespit etmek için primerler tasarlayın. Dönüşümü takiben, bir PCR kiti kullanarak virD2'nin PCR ile tutulması için Agrobacterium kolonilerini test edin. Hem virD2 hem de ilgili geni içeren Agrobacterium rhizogenes kolonilerini seçtikten sonra, bazı kolonileri, ilgilenilen plazmid için litre spektinomisin başına 100 miligram içeren LB plakalarına çizin.
Ertesi gün, bir P200 pipet ucu kullanarak, Agrobakterinin 1,5 santimetre uzunluğundaki bir uzunluğunu LB plakasından kazıyın ve bir mililitre fosfat tamponunda yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunu ve sterilize edilmiş ultra saf suyu asetosiringonda seyreltin. 600 nanometre optik yoğunlukta bir küvet tüpü kullanarak absorbansı ölçün.
Daha sonra, bir biyogüvenlik kabininde, sterilize edilmiş bir neşteri Agrobacterium çözeltisine batırın ve kotiledonun iç yüzeyi boyunca bir milimetre derinliğinde bir kesim yapın. Altı ila sekiz kotiledonu, çimlenme ve asetosisingon ile yetiştirme ortamına doymuş filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yan yana kesilmiş olarak yerleştirin. Plakaları 16 saatlik bir fotoğraf süresi altında üç gün boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Üç gün sonra, enfekte kotiledonları tüylü kök büyümesine veya HRG plakalarına aktarın. Plakaları, 22 santigrat dereceye ayarlanmış büyüme odalarında ve 16 saatlik bir fotoğraf periyodunda 100 mikromol ışık yoğunluğunda, iki ila üç santimetre uzunluğunda ikincil köklere sahip birincil kökler gözlenene kadar inkübe edin. Üç ila dört hafta sonra, nasırdan büyüyen ve steril bir neşter ve forseps kullanarak ikincil kökler içeren birincil kökleri hasat edin.
Kökleri uygun antibiyotikler içeren seçilmiş HRG plakalarına aktarın ve beş gün daha büyümelerine izin verin. Beşinci günde, üç ila altı santimetre uzunluğunda ikincil kökleri olan transgenik tüylü kökleri hasat edin. Floresan proteinleri gözlemliyorsanız, ikincil köklerin çok az otofloresansa sahip olduğundan emin olun.
Daha sonra, elicitor veya kimyasal işlemler yapmak için, ikincil kökleri bir santimetre parçalara ayırın ve bir yığın halinde HRG agar üzerine yaklaşık 100 miligram yerleştirin. Daha sonra yığını 80 mikrolitre uygun arıtma çözeltisi ile doyurun ve plakanın oda sıcaklığında inkübe etmesine izin verin. 24 saat sonra, RNA ekstraksiyonu için, kökleri sterilize edilmiş bir kağıt havlu üzerinde hızla kurutun ve doğrudan iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
Hemen parafilm kullanarak tüpün üstünü kapatın ve sivri forseps kullanarak iki küçük delik açın. Transforme Agrobakterinin koloni PCR sonuçları gösterilmiştir. PCR'deki pozitif koloniler ilgilenilen geni gösterdi.
Bununla birlikte, kolonilerin üçte biri ila yarısı virD2 gen taraması için negatifti. Floresan mikroskopisi GFP-GmJAZ1-6'nın hücre altı lokalizasyonunu gösterir. Gen ekspresyon analizi, Williams 82 harry köklerinde gliseollin transkripsiyon faktörü GmHSF6-1'in aşırı ekspresyonunu ve GmMYB2912'nin RNAi susturulmasını doğruladı.
