Başlamak için, gliserol stokundan Limosilactobacillus reuteri DSM20016 50 mililitrelik bir tüpte altı mililitre De Man, Rogosa, Sharpe veya MRS suyuna aşılayın. Kültürü, statik bir inkübatörde gece boyunca 37 santigrat derecede aerobik olarak inkübe edin. Ertesi gün, gece kültürünün dört mililitresini 200 mililitre MRS suyuna aşılayın.
600 nanometredeki optik yoğunluk 0,5 ila 0,85'e ulaşana kadar kültürün statik 37 santigrat derece inkübatörde aerobik olarak büyümesine izin verin. Daha sonra, kültürü 50 mililitrelik santrifüj tüplerine boşaltın ve tüpleri dengelerken buzun üzerine yerleştirin. Kültürü önceden soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Peletin 50 mililitre önceden soğutulmuş çift damıtılmış suda yeniden askıya alınmasından önce, santrifüjlemeyi iki kez tekrarlayın. Son santrifüjlemeden sonra, pelet 25 mililitre çift damıtılmış su, 0.5 molar sakkaroz ve% 10 gliserol içinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti iki mililitre çift damıtılmış su, 0.5 molar sakkaroz ve% 10 gliserol buz üzerinde yeniden askıya alın.
Süspansiyonu önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerinde 50 ila 100 mikrolitrelik porsiyonlara ayırın ve tüpleri daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, elektroporasyon için, buz üzerinde elektrokompetan hücrelerin bir aliquot'unu çözün. Plazmidin beş ila 10 mikrolitresini çözülmüş aliquot içine karıştırın ve pipetlemeyi mümkün olduğunca önleyin.
Karışımı buz soğutmalı bir mililitre boşluklu elektroporasyon küvetine ve 1.25 kilovolt, 400 ohm ve 25 mikrofaraddda elektroporata aktarın. Elektroporasyondan sonra, bir mililitre MRS suyu ekleyin ve küveti bir veya iki kez ters çevirerek karıştırın. Küvetleri, iyileşme için 2,5 ila üç saat boyunca statik bir 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.
Ardından, tüm süspansiyonu uygun seçimle birden fazla MRS burgu plakasına yerleştirin. Plakaları, poşet oluşturan anaerobik bir atmosferde küçük yanan bir mumla hava geçirmez bir kabın içine yerleştirin. İki ila üç gün boyunca veya görünür koloniler ortaya çıkana kadar 37 santigrat derecede büyüyün.
L.reuteri'nin pTRKH3 plazmidi üreten kurucu mCherry2 ile elektroporasyonu, plazmid metilasyon koşulundan bağımsız olarak kaplanmış 200 mikrolitre başına kabaca beş ila sekiz koloninin transformasyon verimliliğini sağlar. Eksojen kurucu muhabir proteini taşımayan pNZ123 ile transformasyon, DNA'nın mikrogramı başına dört CFU'ya üç kat 10 arasında dönüşüm verimliliği sağladı.
