Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

Dokuyu steril bir doku kültürü plakasına yerleştirerek ve fazla ortamı çıkararak başlayın. Dokuyu steril bir metal cetvelle ölçün ve fotoğrafını çekin. Kesilen dokuya üç mililitre gelişmiş DMEM/F-12 ortamı ekleyin ve dokuyu yıkamak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Sonra dokuyu üç mililitre PBS ile yıkayın. Ortamı doku kültürü plakasından aspire edin ve steril bıçaklar ve iki mililitre sindirim ortamı kullanarak küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra dokuyu toplam beş mililitre sindirim ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Tüpü 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Süspansiyonu periyodik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tüpe beş mililitre gelişmiş DMEM / F-12 ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin.

Ardından, büyük kalıntıları temizlemek için numuneyi 70 mikrometrelik bir gözenek süzgecinden süzün. Şimdi, filtrenin tepesine% 10 FBS içeren iki mililitre DMEM pipetleyin ve fibroblast kültürü için kalıntıları ve doku kalıntılarını toplamak için bir pipet kullanın. Daha sonra fibroblast kültürü için döküntüleri kaplayın.

Süzüntüyü oda sıcaklığında 200 ila 300 G'de beş dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı aspire edin. Pelete beş mililitre gelişmiş DMF 12 ekleyin ve süspansiyonu beş dakika boyunca 300 G'de tekrar santrifüjleyin. Kırmızı kan hücresi lizisi için, peleti dört mililitre amonyum klorür potasyum lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Karışımı daha önce gösterildiği gibi aynı koşullarda santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire edin. Pelet'e beş mililitre gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin ve tekrar dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire ettikten sonra, pelete bir mililitre ticari olarak temin edilebilen hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, süpernatanı bir kez daha santrifüjleyin ve aspire edin. Ardından peleti beş mililitre gelişmiş DMEM/F-12 içinde yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu bir P1000 pipeti ile birden çok kez pipetleyerek hücre kümelerini ayırın. Süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Ardından, önceden soğutulmuş P1000 ve P200 pipet uçları edinin ve katılaşmayı önlemek için Falcon'u buza yerleştirmeden önce, hücre peletini membran matrisinde yeniden süspanse etmek için P1000 pipetine sabitlenmiş soğuk uçları kullanın.

Önceden ısıtılmış plakayı inkübatörden alın. 48 mikrolitrelik P200 pipet setini ve soğuk uçları kullanarak, önceden ısıtılmış plakada bazal membran matris kubbeleri oluşturun. Daha sonra bazal membran karışımını katılaştırmak için inkübe edin.

Matris katılaştıktan sonra, büyüme faktörleri ve inhibitörlerle desteklenmiş iki ila iki buçuk mililitre gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin. Tümör hücreleri izole edildi ve 15 günlük bir süre boyunca taze dokudan tümör organoidleri oluşturuldu. Bazen, büyük hücre enkaz hacimleri, gelişmekte olan tümör organoidlerinin doğru bir şekilde görüntülenmesini önler.

Gelişen organoidlerin, tümör orijinine bağlı olarak fenotipik olarak izole, yuvarlatılmış, küresel veya agrega benzeri kültürlerden değiştiği gözlendi. Organoid kültürler, primer tümör hücre kültürünün yaygın bir PI ürünü olan fibroblastlar tarafından kontamine olabilir. Yaklaşık yedi günlük kültürden sonra, fibroblastlar bazal membran matris kubbelerinden göç eder ve optimal organoid büyümeyi tehlikeye atabilecek hücre plakalarına yapışır.

Filtreden geri kazanılan doku artıklarından fibroblast kültürleri oluşturulur. Hücreler doku kalıntılarından dışarı çıkar ve kültür plakalarına yapışır.