Bir hemositometre kullanarak yenidoğan Sıçan Ventriküler Kardiyomiyosit konsantrasyonunu ölçerek başlayın. Hücre süspansiyon çözeltisini mililitre başına 3.000 hücreye seyreltin, alfa MEM% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS içerir. Seyreltilmiş ventriküler kardiyomiyositin 100 mikrolitresini, hücrenin yapışkan olmayan 96 oyuklu plakalarının her bir oyuğuna dağıtın.
Hücreleri 100 G'de beş dakika santrifüjleyin ve hücre kültürü inkübatöründe iki ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kültürleyin. İnkübasyondan sonra, kültür ortamını yapışkan olmayan 96 oyuklu plakaya ekilen Sıçan Kardiyomiyosit toplarından aspire edin. Daha sonra, kardiyomiyosit toplarını her bir oyuktan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Kardiyomiyosit toplarını santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Ardından, bir ADS tamponu kullanarak yıkayın. Aşılamadan sonra Sıçan'daki kardiyomiyosit hücrelerinin izlenmesini kolaylaştırmak için, hücreleri PKH26 ile boyayın.
Hücreleri santrifüjlemeden önce, tohumlamadan sonra düzenli olarak mikroskop altında gözlemleyerek bidim kardiyomiyosit toplarının gelişimini takip edin. Bir şırınga ile donatılmış 29 gauge, 50 milimetre uzunluğunda bir iğne kullanarak yenidoğan kardiyomiyosit top enjeksiyonu için ana enjeksiyon aparatını hazırlamaya başlayın. 18 gauge bir mililitrelik güç transfer şırınga iğnesini düşük lümen genişletilebilirliğine sahip ince bir polipropilen tüpe bağlayın.
Bir şırınga kullanarak suyu aspire edin ve şırıngadaki ve bağlı tüplerdeki tüm kabarcıkları çıkarın. Başka bir 18 gauge iğne için tekrarlayın. Ardından, güç transfer tüpünün diğer tarafını aynı bir mililitrelik şırınganın 18 gauge iğnesine bağlayın.
Bir şırınga pistonunu aşağı ve başka bir şırınga pistonunu yukarı iterek başarılı güç geçişini onaylayın. Bittiğinde, şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin. Ardından, sıkıca sarılmış bakır boruyu hücre enjeksiyon şırıngasının bir kısmını içeren hücreye takarak soğutma sistemini kurun.
Her iki uçta 10 milimetre fazla boru bırakmak. Plastik borunun diğer uçlarını harici bir pompaya bağlamadan önce bakır boruyu esnek plastik boruya bağlayın. Hattı soğutma suyuyla doldurun ve suyu soğutmak için fazla bakır boruyu kırılmış buza batırın.
Bu soğutma sistemi, silindir içindeki hücre süspansiyon çözeltisini yaklaşık 2 santigrat derecede tutar.
