Plazmit içeren adeno-ilişkili ITR'de ilgilenilen genin klonlanmasından sonra,% 10 FBS ile desteklenmiş önceden ısıtılmış DMEM kullanılarak altı oyuklu bir plakaya üç kez 10 ila beşinci hücrelere tohumlayın. Hücrelerin 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte büyümesine izin verin ve %75 ila 90 birleşme elde edin. Daha sonra, mikrolitre stok başına bir mikrogram yapmak için 100 miligram polietilenimin hidroklorür veya PEI max'ı 100 mililitre damıtılmış suda çözün.
Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.1'e ayarlayın. Daha sonra karışımı 0.22 mikrometrelik bir filtre kullanarak sterilize edin ve reaktifi bir ay boyunca dört santigrat derecede saklayın. İki mililitrelik bir tüpte, serum serbest DMEM'e 1.3 mikrogram rep / cap plazmid, plazmit içeren 1.3 mikrogram ITR ve 2.6 mikrogram adenovirüs yardımcı plazmidi ekleyin.
Bu karışımın toplam hacmi 100 mikrolitre olmalıdır. Rep/cap plazmidini ilgisiz bir plazmid ile değiştirerek ayrı bir tüpte negatif bir kontrol hazırlayın. Şimdi plazmit karışımına 5.2 mikrolitre PEI max ekleyin.
Bu, eşit bir plazmid / PEI oranını korur. Yediye ayarlanmış bir girdap karıştırıcıda 10 ila 15 kez hafifçe girdap yapın. Birden çok vektör için, sonraki adımlarda yeterli süre için PEI eklemesini bir dakikalık aralıklarla kademelendirin.
Her tüpü oda sıcaklığında tam olarak 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, iki mililitrelik bir nihai hacim elde etmek için 1.9 mililitre serum serbest DMEM ekleyerek reaksiyonu seyreltin. İçeriği karıştırmak için iki kez hafifçe pipetleyin.
Kuyudan medyayı aspire edin. Hücre ayrılmasını önlemek için plazmit PEI karışımını kuyunun kenarlarına dikkatlice ekleyin ve hücreleri 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra transfekte edilmiş hücrelerin plakasını eksi 80 santigrat derecede 30 dakika dondurun ve 37 santigrat derecede 30 dakika çözdürün.
Döngüyü toplam üç kez tekrarlayın. Laminer akış başlığında, hücreleri etkili bir şekilde parçalamak için pipetleme yoluyla her bir kuyucuğu aseptik olarak karıştırın. Lizatı iki mililitrelik bir tüpe aktarın.
Hücre kalıntılarını gidermek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 15.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve tüpü dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra, istenen hücre tipini 96 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve transdüksiyon süresine bağlı olarak% 50 ila 75'lik bir hedef birleşme için inkübe edin. Ertesi gün, transdüksiyon için gereken optimal vektör miktarını elde etmek için serum serbest ortamda ham preparatın bir ila üç seyreltme serisini gerçekleştirin.
Daha sonra ortamı 96 oyuklu plakadan aspire edin ve kuyucuklara 50 ila 100 mikrolitre seyreltilmiş ham preparat ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Transdüksiyon verimliliğini belirlemek için, transdüksiyondan 48 saat sonra bir floresan mikroskobu kullanarak floresan raportörün ifadesini gözlemleyin.
Daha fazla analiz için, vektörü çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın. Son olarak, hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyerek transdüksiyonu sonlandırın. Transdüksiyon verimliliği verileri, AAV2 ve KP1'in test edilen tüm hücre hatlarında en güçlü serotipler olduğunu göstermiştir.
HEPA1-6, Huh7'ye kıyasla transdüksiyonda belirgin bir azalma sergiledi. AAV2, farklılaşmamış HSKMC miyoblastlarını ve farklılaşmış HSKMC miyotüplerini verimli bir şekilde dönüştürdü. Transdüksiyon sırasında farklı medya koşulları önemli bir rol oynar.
Transdüksiyon öncesi ortamda kültürlenen fare ince bağırsak organoidleri, organoid büyüme ortamında kültürlenenlere kıyasla daha az etkili bir şekilde transdüksiyon edildi.
