Doku örneklerine eşek serumu ile bir damla kullanıma hazır bloke edici solüsyon pipetleyerek başlayın. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kenarı sert bir yüzeye vurarak fazla engelleme solüsyonunu slaytlardan çıkarın.
Her numune için 100 mikrolitre nihai çözelti hazırlamak için antikor seyreltme tamponundaki birincil antikorları seyreltin. Her primer antikor için bir tüp ve her izokontrol antikoru için bir tüp olmak üzere antikorları ayarlayın. Bir numuneye 100 mikrolitre izokontrol antikoru ve diğer numuneye 100 mikrolitre miyeloperoksidaz ve sitrüline histon H3 veya miyeloperoksidaz ve nötrofil elastaz antikor seyreltmesini eşit olarak yayın.
Slaytları ıslak bir odaya koyun ve gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, slaytlardaki fazla primer antikor solüsyonunu çıkarın ve bunları bir küvete koyun. Slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın, ara ile Tris tamponlu salin kullanarak Kalan birincil antikor çözeltisini çıkarmak için.
İki belirgin floresan ikincil antikor, miyeloperoksidaz için eşek anti-keçi ve sitrüline histon H3 boyama için eşek anti-tavşan hazırlayın. Her bir antikoru, antikor seyreltme tamponunda mililitre konsantrasyonda 7.5 mikrograma seyreltin. Slaytları ıslak bir odaya yerleştirin ve her numuneye 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi dağıtın.
Işıktan korunan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Slaytlara dokunarak fazla ikincil antikor solüsyonunu çıkarın. Slaytları bir slayt rafına koyun.
Slaytları, bağlanmamış antikorları yıkamak için PBS ile dolu bir boyama kavanozuna her biri beş dakika boyunca üç kez daldırın. Zarif çözeltiyi hazırlayın ve deiyonize su ile mililitrede bir mikrogram konsantrasyona seyreltin. Sürgülü rafı, dappy solüsyonunu içeren bir boyama kavanozuna daldırın ve karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Ardından, fazla dappy solüsyonunu yıkamak için sürgülü rafı PBS ile beş dakika boyunca bir boyama kavanozuna daldırın. Son olarak, numuneleri lameller ve montaj ortamı kullanarak monte edin. Sitrüline histon H3 antikoru sadece hücre dışı histonlara bağlandı ve hücre içi histonlarda lekelenme göstermedi.
İnsan veya fareye özgü miyeloperoksidaz antikoru spesifik bir boyama göstermedi. Evrensel insan ve fare antikorları, miyeloperoksidaz için tutarlı iyi boyama gösterdi. Hiçbir bloke edici ajan kullanılmadığında, bazı fare örnekleri daha spesifik olmayan ve kısmi pozitif boyama gösterdi.
Engellendiğinde, beş dakikalık engelleme süresi, 10 dakikalık engelleme süresine kıyasla iyi sonuçlar verdi. Mikrodalga ve su banyosundaki daha yüksek sıcaklıklar, sürekli olarak orta ila iyi antijen alımı gösterdi. Oysa 60 santigrat derecelik bir su banyosunda lekelenme yok denecek kadar pozitifti.
Çift boyama için, 96 santigrat derece su banyosunda inkübe edilen numuneler için daha olumlu sonuçlar elde edildi. Bununla birlikte, 96 santigrat derecede 40 dakikalık inkübasyon süresinin aşılması, daha az yoğun antikor boyaması ile sonuçlandı.
