Bu araştırma Alman Araştırma Derneği (BO5534) tarafından kurulmuştur. Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer ve PD Dr. Ingo Königs'e bize örnekler sağladıkları için teşekkür ederiz. Ek olarak, yazarlar immünofloresan mikroskobu ile ilgili destek için UKE Mikroskopi Görüntüleme Tesisi (Çekirdek tesis, UKE Tıp Fakültesi) ekibine teşekkür eder.

Bu çalışma, Hamburg Eyalet Hayvan Araştırmaları İdaresi, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Almanya (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16) tarafından onaylanan deneylerden elde edilen fare dokularını içermektedir. Kullanılan dokular septik bir modelden fare akciğeri ve kolon ve yanmış deriydi. 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullandık. Tüm deneyler için bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uyulmuştur. Anonimleştirilmiş insan örnekleri, yenidoğan enterokolit, yanmış cilt, biliyer atrezi, spondilodiskit ve miyokard dokularını içeriyordu. Hamburg Tıbbi Araştırma Etik Kurulu'na göre, numunelerin bilgilendirilmiş onam almasına gerek yoktu, ancak çalışma komite tarafından onaylandı (WF-026/21).
1. Örnek fiksasyon
<ol><li>Numune fiksasyonu, dehidrasyon, parafin gömme, kesit alma ve montaj için Abu Abed ve Brinkmann'dan türetilen aşağıdaki protokolü kullanın 3,15.<ol><li>40 g paraformaldehiti (PFA) 800 mL Tris tamponlu salin, pH 7.4 (TBS) içinde çözerek% 4 formaldehit çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Karışımı 60 °C'de çeker ocak altında PFA eriyene kadar karıştırın. Çözeltiyi oda sıcaklığına (RT) getirin ve TBS ile ses seviyesini 1.000 mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>PH'ı 7.4'e ayarlayın. 4 °C'de 2-3 hafta veya -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Numune fiksasyonu için, taze dokuyu TBS tamponuna yerleştirin ve 20 mm x 30 mm x 3 mm'den daha küçük parçalara ayırın. Doku bölümlerini 12-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın. NOT: Orijinal protokol %2'lik bir PFA çözeltisi ve 8-20 saatlik bir sabitleme süresi kullandı. Bu yöntemle bazı doku kesitleri 20 saat sonra tam olarak fikse edilmediği için PFA konsantrasyonu %4 PFA'ya çıkarıldı.</li>
	<li>Numuneleri etiketli doku işleme kasetlerine aktarın. Etiketleme için solvente dayanıklı işaretleyiciler veya kurşun kalemler kullanın.</li>
	<li>Kasetleri 1 saat boyunca %70 etanole batırarak numune dehidrasyonunu başlatın. Ardından, her adım 1 saat sürecek şekilde %80 etanol, %90 etanol, %96 etanol ve iki kez %100 etanole daldırın.</li>
	<li>Her seferinde 1 saat boyunca iki kez %100 ksilene (dimetilbenzen) ve ardından iki kez 60 °C parafine daldırın.</li>
	<li>Montaj için gömme kalıpları kullanın ve kalıbı çıkarmadan önce parafinin katılaşmasına izin verin.</li>
	<li>3 μm kalınlığındaki doku kesitlerini kesmek için bir mikrotom kullanın.</li>
	<li>Kesilen bölümleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirmek için cımbız kullanın ve doku kesiklerini germek için yüzeyde yüzmelerine izin verin.</li>
	<li>Bölümleri yapışkan cam slaytlara (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve gece boyunca 40 °C'lik bir ısı odasında kurumaya bırakın.</li>
</ol>2. Örnek rehidrasyon
<ol><li>Deparafinizasyon için, slaytları bir slayt rafına istifleyin ve her biri 5 dakika boyunca ksilen ikame ortamı limonene (Malzeme Tablosu) iki kez ve bir kez 5: 1 limonen / etanol karışımına 1 dakika daldırın. DİKKAT: Limonen 50 °C'de yanıcıdır ve alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Göz koruması ve eldivenli bir çeker ocak altında kullanın. Açık ateşten uzak tutun.</li>
	<li>Kayar rafı iki kez %100 etanole ve bir kez %96 etanole, %90 etanole, %80 etanole ve %70 etanole her biri 5 dakika daldırarak numuneleri azalan bir etanol serisinde yeniden sulandırın.</li>
	<li>Kalan etanolü temizlemek için sürgülü rafı 5 dakika boyunca deiyonize suya (DI su) daldırın.</li>
</ol>3. Otofloresan bloke etme ve antijen alımı
<ol><li>Veri sayfasına göre pH 6 sitrat hedef alma çözeltisini (TRS) (Malzeme Tablosu) hazırlayın. Bu TRS 10 kez konsantre edilmiştir. Bu nedenle 1:10 oranında DI su ile seyreltin. Plastik bir boyama kavanozunda 96 °C'ye ısıtın. NOT: TRS, antijen epitoplarını açığa çıkarmak için numune fiksasyonu sırasında oluşan metilen köprülerini kırar. Bu, birincil antikorların hedef antijenlerine bağlanmasına izin verir. Konsantre TRS'yi 2-8 °C'de 8 ay saklayın. Her zaman taze TRS hazırlayın.</li>
	<li>Slaytları sürgülü raftan çıkarın ve ıslak bir odaya yerleştirin. Her numuneye bir ila iki damla otofloresan azaltıcı madde (Malzeme Tablosu) pipetleyin. 5 dakika inkübe edin. NOT: Otofloresan azaltıcı ajan, endojen floroforlar ve fiksatiflerin neden olduğu doğal doku otofloresansını bloke eder. Otofloresan azaltıcı ajanı RT'de 1 yıla kadar saklayın. NOT: Numunelerin kurumasını veya inkübasyon süresini aşmasını önlemek için yalnızca küçük doku bölümleriyle çalışın.</li>
	<li>Slaytları tekrar sürgü rafına istifleyin ve kullanılmayan tüm otofloresan azaltıcı reaktif yıkanana kadar yukarı ve aşağı hareketlerle %60 etanol içinde 1 dakika durulayın.</li>
	<li>Sürgülü rafı 5 dakika boyunca DI suya daldırın.</li>
	<li>Antijen alımı için, slaytları önceden ısıtılmış TRS ile bir boyama kavanozuna aktarın. Bir su banyosunda 96 ° C'de 10 dakika inkübe edin. NOT: TRS 96 °C'ye önceden ısıtılırsa ve 96 °C'de 10 dakikalık inkübasyon süresi sağlanırsa, 96 °C'lik su banyosu bir mikrodalga fırın veya buharlı pişirici ile ikame edilebilir.</li>
	<li>Boyama kavanozunu çıkarın ve yaklaşık 60-90 dakika RT'ye kadar yavaşça soğumaya bırakın. NOT: Protokol burada 4 saate kadar duraklatılabilir ve slaytlar TRS'de bırakılabilir.</li>
	<li>TRS'yi çıkarın, ancak slaytları kavanozda saklayın. Kalan TRS kalıntılarını yıkamak için her biri 3 dakika boyunca %0.05 Tween (TBST, pH 7.4) içeren Tris tamponlu salin ile iki kez durulayın.</li>
	<li>Geçirgenlik için, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde% 0.2 Triton hazırlayın ve numuneleri 10 dakika geçirgenleştirmek için boyama kavanozuna doldurun. NOT: Permeabilizasyon, primer antikorların sabit numunelerdeki hücre içi hedef proteinlere bağlanmasını arttırır.</li>
	<li>Slaytları her seferinde 3 dakika boyunca TBST'de iki kez tekrar durulayın.</li>
	<li>Islak hazneyi hazırlayın ve slaytları yerleştirin. Slaytlardaki fazla suyu kağıt mendillerle silin. Antikor çözeltisinin akmasını önlemek için her numuneyi hidrofobik bir bariyer kalemle daire içine alın. NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. Küçük bölümlerle çalışmak en iyisidir.</li>
</ol>4. Spesifik olmayan antikor bağlanmasının engellenmesi
<ol><li>Eşek serumu (Malzeme Tablosu) ile kullanıma hazır engelleme solüsyonu alın ve her numuneye bir damla pipetleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin. NOT: Bu bloke edici adım, ikincil antikorun numune üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerine bağlanmasını en aza indirir. Bu spesifik olmayan epitopları bloke ettikten ve birincil antikoru uyguladıktan sonra, ikincil antikor birincil antikora bağlanacak ve dokunun yüzeyi ile etkileşime girmeyecektir. Bu kullanıma hazır bloke edici reaktif, 6 ay boyunca 2-8 °C'de saklanır.</li>
	<li>Kızakların kenarını sert bir yüzeye vurarak fazla engelleme solüsyonunu slaytlardan çıkarın. Onları durulamayın.</li>
</ol>5. Birincil antikor
<ol><li>Antikor seyreltme tamponundaki primer antikorları seyreltin (Malzeme Tablosu). Her numune için yaklaşık 100 μL nihai çözelti kullanın. NE ve H3cit (R8) antikoru ve izokontrolü için 5 μg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. MPO ve karşılık gelen izokontrol için 10 μg/mL kullanın. Her primer antikor için bir tüp ve her izokontrol antikoru için bir tüp hazırlayın. NOT: H3cit (R8)/MPO veya NE/MPO ve bunların izokontrolleri NET'lerin boyanması için birleştirilebilir. H3cit (R8)/MPO kombinasyonu için, H3cit (R8) için 5 μg/mL ve MPO için 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. NE / MPO için, NE için 5 μg / mL ve MPO için 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona, numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. İzokontrol için, karşılık gelen her bir antikor ile aynı konsantrasyonu kullanın. Kullanılan her antikor için her zaman yeni bir pipet ucu kullanın. Primer antikorlar 4 °C'de 1-2 hafta ve −20 °C veya −80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.</li>
	<li>Bir slaytta iki numune ile, izokontrol antikorları için bir tane ve MPO / H3cit veya MPO / NE antikor seyreltmesi için bir tane kullanın. Her numune için yaklaşık 100 μL kullanın ve antikor solüsyonunu eşit şekilde yayın. NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. İzokontrol ve primer antikorları karıştırmaktan kaçınmaya dikkat edin.</li>
	<li>Islak bir odada gece boyunca 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Ertesi gün, slaytlardaki fazla primer antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları bir küvette istifleyin. Kalan primer antikor solüsyonunu yıkamak için her seferinde TBST ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın.</li>
</ol>6. İkincil antikor
<ol><li>İkincil antikor çözeltisini hazırlayın. İki farklı floresan sekonder antikor kullanın: MPO için eşek anti-keçi ve H3cit boyama için eşek anti-tavşan. Her birini antikor seyreltme tamponu ile 7.5 μg/mL konsantrasyona seyreltin (Malzeme Tablosu). NOT: Çift boyama için, farklı uyarma alanlarına ve minimum spektral örtüşmeye sahip iki floresan antikor kullanın. Her iki ikincil antikoru birleştirin ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacim için her bir antikor için 7.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Antikorları ışıktan koruyun. İkincil antikorlar 2-8 °C'de 6-8 hafta veya -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.</li>
	<li>Slaytları ıslak odada tutun ve her numuneye 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe etmelerine izin verin ve ışıktan koruyun.</li>
	<li>Fazla ikincil antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları sürgülü rafa istifleyin. Kalan bağlanmamış antikorları yıkamak için PBS ile dolu bir boyama kavanozuna her biri 5 dakika boyunca üç kez daldırın.</li>
	<li>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve DI su ile 1 μg/mL konsantrasyona seyreltin. Sürgülü rafı DAPI solüsyonu ile bir boyama kavanozuna daldırın ve karanlıkta RT'de 5 dakika inkübe edin. NOT: DAPI, çift sarmallı DNA için floresan lekesi olarak kullanılır. Hazırlanan DAPI çözeltisi birden çok kez kullanılabilir. Hazırlanan DAPI çözeltisini RT'de saklayın. DAPI konsantresi −20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.</li>
	<li>Fazla DAPI solüsyonunu yıkamak için sürgülü rafı 5 dakika boyunca PBS'li bir boyama kavanozuna daldırın.</li>
</ol>7. Numunelerin montajı ve saklanması, mikroskobik analiz
<ol><li>Numuneleri lameller ve montaj ortamı ile monte edin (Malzeme Tablosu). NOT: Yalnızca az miktarda montaj ortamı kullanın ve fazla ortamı ıslak mendillerle silin. Eldiven giyin ve lameller veya slaytlardan herhangi bir ortamı yanlışlıkla silmekten kaçının. Kabarcık oluşumundan kaçının ve slaytlardaki kabarcıkları gidermek için lamellere hafifçe bastırmak için pamuklu çubuklar kullanın.</li>
	<li>Görüntüleme için geniş alan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın. NOT: Önce izokontrolün bir görüntüsünü alın. Floresan filtrelerin (DAPI için mavi filtre hariç) maruz kalma süresini neredeyse hiç sinyal algılanmayana kadar azaltın. Ardından, ilgili örnekleri incelemek için bu ayarı kullanın. Floresan kanalını kullanarak her bir numunede bir floresan sinyalinin tespit edilebileceği alanları arayın. Alanın bir görüntüsünü aldıktan sonra, program tüm kanalların bileşik bir görüntüsünü oluşturur ve farklı floresan sinyallerini farklı renklerin üst üste binmesi olarak gösterir. Görüntü daha sonra ImageJ gibi görüntüleme yazılımlarıyla birlikte yerelleştirme için daha fazla analiz edilebilir.</li>
	<li>Slaytları 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.</li>
</ol>

Nötrofil hücre dışı tuzakları görselleştirmek için boyama ve görüntüleme

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin,+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans.">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).</li><li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).</li><li>Kawasaki, H., Iwamuro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+histones+in+host+defense+as+antimicrobial+agents.">Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents.</a> Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).</li><li>Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+anti-Aspergillus+defense+by+neutrophil+extracellular+traps+in+human+chronic+granulomatous+disease+after+gene+therapy+is+calprotectin-dependent.">Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+neutrophil+extracellular+trap+degradation+is+associated+with+lupus+nephritis.">Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).</li><li>Papadaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+exacerbate+Th1-mediated+autoimmune+responses+in+rheumatoid+arthritis+by+promoting+DC+maturation.">Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation.</a> European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).</li><li>Toussaint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+DNA+released+by+NETosis+promotes+rhinovirus-induced+type-2+allergic+asthma+exacerbation.">Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation.</a> Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA+traps+promote+thrombosis.">Extracellular DNA traps promote thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps.">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).</li><li>Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+Neutrophil+extracellular+traps+license+macrophages+for+cytokine+production+in+atherosclerosis.">Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li><li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines.">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li><li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections.">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).</li><li>de Buhr, N., von K&#246;ckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue.">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy.">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li><li>Savchenko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+form+predominantly+during+the+organizing+stage+of+human+venous+thromboembolism+development.">Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).</li><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+(ANCA)-associated+glomerulonephritis.">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li><li>Barliya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+involvement+of+NETosis+in+inflammatory+processes+in+the+eye:+Evidence+from+a+small+cohort+of+patients.">Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients.</a> Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduced+bone+marrow+neutrophils+in+collagen-induced+arthritis+are+primed+for+NETosis:+An+ignored+pathological+cell+involving+inflammatory+arthritis.">Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis.</a> Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).</li><li>Nonokawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+neutrophil+extracellular+traps+with+the+development+of+idiopathic+osteonecrosis+of+the+femoral+head.">Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head.</a> American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).</li><li>Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+are+present+in+the+airways+of+ENaC-overexpressing+mice+with+cystic+fibrosis-like+lung+disease.">Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease.</a> BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).</li><li>Knackstedt, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+inflammatory+pathogenesis+in+malaria.">Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria.</a> Science Immunology. 4 (40), (2019).</li><li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histones+and+neutrophil+extracellular+traps+enhance+tubular+necrosis+and+remote+organ+injury+in+ischemic+AKI.">Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).</li><li>Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy.">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).</li><li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer.">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+antigen+retrieval:+Mechanisms+and+application+to+histochemistry.">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+cell+membranes.">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li><li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer's+disease.">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li><li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues.">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils.">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu çalışmada, gerçek boyama işleminden başlayarak, NET'lerin görüntülenmesi için mevcut protokolleri daha fazla doku tipine uyarlamayı ve optimize etmeyi amaçladık. Bu yöntem için ilk kritik adım, en uygun antikorların seçilmesidir. NE için, insan dokusu üzerinde bir fare konakçısından bir NE antikoru denedik, bu da bir tavşan konakçısından alınan NE'ye kıyasla güvenilir bir lekelenme göstermedi. Ayrıca, Thålin ve ark. hücre dışı boyama için daha spesifik bir antikor olarak H3cit (R8...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) ilk olarak Brinkmann ve ark. 2004yılında apoptoz ve nekrozdan farklı bir hücresel ölüm yolu olarak 1. Bu yolda, nötrofiller, daha önce granüllerde veya sitozolde depolanan antimikrobiyal proteinlerle kaplı büyük ağ benzeri yapılar oluşturmak için yoğunlaştırılmış kromatinlerini hücre dışı boşluğa bırakırlar. Bu antimikrobiyal proteinler, NET'lerin dolaylı immünofloresan tespiti için yaygın olarak kullanılan nötrofil elastaz (NE), miyeloperoksidaz (MPO) ve sitrüline histon H3'ü (H3cit) içerir2. Bu yöntem sadece bu proteinlerin kantitatif varlığını tanımlamakla kalmaz; gerçekten de, NET benzeri yapıları özel olarak tespit etme avantajına sahiptir. NET'lerde, söz konusu proteinler, her bir boyanmış proteinin ve hücre dışı DNA'nın floresan sinyallerinin üst üste binmesiyle tespit edilebilen hücre dışı DNA ile birlikte lokalize olur. NET'lerde hücre dışı DNA ve protein kolokalizasyonuna bağlı örtüşen sinyallerin aksine, sağlam nötrofiller kolokalizasyon göstermez. Burada, NET bileşenleri genellikle granüllerde, çekirdeklerde ve sitozol3'te ayrı olarak depolanır.
İlk keşflerinden bu yana, NET'lerin başta inflamasyon olmak üzere birçok hastalıkta merkezi bir rol oynadığı gösterilmiştir. NET'ler, kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayıp öldürerek enfeksiyon sırasında antimikrobiyal işlevler gösterir 4,5. Bununla birlikte, NET'ler sistemik lupus eritematozus, romatizmal artrit ve alerjik astım gibi otoimmün hastalıklar ve hiperinflamatuar yanıtlarla da bağlantılıdır 6,7,8. NET'ler aterosklerozda, trombosit yapışmasında vazo-oklüzyon ve inflamasyonu teşvik eder ve metastatik kanserde rol oynadığı tahmin edilmektedir 9,10,11. Bununla birlikte, proinflamatuar sitokin düzeylerini azaltarak anti-inflamatuar özelliklere sahip oldukları düşünülmektedir12. NET'ler daha geniş bir araştırma alanına daha fazla ilgi gösterse de, gelecekteki araştırmalar için sağlam bir NET algılama yöntemi esastır.
İmmünofloresan görüntüleme kullanılarak farklı dokulardaki NET'lerin görüntülenmesi karmaşık ve özelleştirme gerektirse de, elektron mikroskobu dışında, şu anda NET'ler ve hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için en bilinen yöntemlerden biridir ve ağırlıklı olarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda (FFPE) kullanılmaktadır13,14. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar kendi özelleştirilmiş protokollerini kullandığından, NET görüntülemeyi karşılaştırmak zordur. Bu protokoller antikor, antijen alımı veya geçirgenlik yöntemi kullanımlarında farklılık gösterir ve genellikle belirli bir doku tipi için optimize edilmiştir 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
Brinkmann ve ark. FFPE dokusunda NET'lerin immünofloresan görselleştirmesini kullanan ilk metodik çalışmayı yayınladıktan sonra, bu protokolü daha geniş bir doku ve tür çeşitliliği için optimize etmek istedik15. Ek olarak, geniş çapta uygulanabilir bir immünofloresan protokolü oluşturmak için, NET'leri tespit etmek için FFPE dokusunda immünofloresan yöntemlerini kullanan çalışmalardan farklı modifiye protokolleri test ettik 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Ayrıca, daha spesifik hücre dışı boyama için yeni bir H3cit antikoru denedik28. Mevcut boyama protokollerini farklı türlere ve dokulara sistematik olarak uyarlayarak, in vitro görüntülemenin geliştirilebileceğini ve bunun sonucunda nötrofiller ve NET'ler arasındaki etkileşimin hem lokal hem de sistemik olarak daha iyi temsil edilebileceğini varsayıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 68672&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&#160; 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 5103</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 25989</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 90810</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Microscopy Software&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>&#160;GTX30972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0101202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 25 mg</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6335.1</td>
			<td>1:25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCS antibody dilution 500 mL</td>
			<td>DCS diagnostics</td>
			<td>DCS AL120R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey ant goat Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit AF647</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit Cy3</td>
			<td>JacksonImmunoResearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide rack</td>
			<td>Roth</td>
			<td>H552.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse MPO Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF 3667&#160;</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
			<td>KISKER</td>
			<td>MKP-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 37415</td>
			<td>1:2000 and 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml</td>
			<td>Maxvision</td>
			<td>MB-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCamHR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Bosch</td>
			<td>HMT84M421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 negative control</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0931 Aglient</td>
			<td>1:50 and 1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-108-C&#160;</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Phosphate buffered saline (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP staining jar</td>
			<td>Roth</td>
			<td>2292.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 219406</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200&#181;g</td>
			<td>abcam</td>
			<td>Ab 172730</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>&#160;6640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>R. Langenbrinck</td>
			<td>03-0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS Tris buffered saline (x10)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>830476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath rice cooker</td>
			<td>reishunger</td>
			<td>RCP-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet chamber</td>
			<td>Weckert Labortechnik</td>
			<td>600016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Widefield microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of neutrophil extracellular traps in human and mouse tissues

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyona veya travmatik doku hasarına yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır, ancak aynı zamanda otoimmün hastalıklarda ve steril inflamasyonda da rol oynar. Çift sarmallı DNA filamentleri, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. Serbest bırakıldıktan sonra, NET'ler kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayabilir ve öldürebilir. Ayrıca, NET'ler trombosit adezyonunu ve pıhtılaşmayı uyararak homeostatik regülasyona katılırlar. Bununla birlikte, NET'lerin düzensiz üretimi, sepsis veya otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir ve bu da onları terapötik müdahale için umut verici bir hedef haline getirmektedir. Elektron mikroskobunun yanı sıra, immünofloresan görüntüleme kullanılarak NET'lerin görüntülenmesi, şu anda dokudaki NET etkileşimlerini göstermek için bilinen tek yöntemlerden biridir. Bu nedenle, NET'leri görselleştirmek için çeşitli boyama yöntemleri kullanılmıştır. Literatürde farklı boyama protokolleri tanımlanmış ve protokoller arasında yüksek değişkenlik gösteren dört anahtar bileşen tanımlanmıştır: (1) kullanılan antikor tipleri, (2) otofloresan azaltıcı ajanların kullanımı, (3) antijen elde etme yöntemleri ve (4) geçirgenlik. Bu nedenle, in vitro immünofloresan boyama protokolleri, farklı türler (fare, insan) ve dokular (cilt, bağırsak, akciğer, karaciğer, kalp, omurilik) için uygulanabilir hale getirmek için bu çalışmada sistematik olarak uyarlanmış ve geliştirilmiştir. Fiksasyon ve parafin gömüldükten sonra 3 μm kalınlığındaki kesitler slaytlara monte edildi. Bu örnekler, modifiye bir boyama protokolüne göre miyeloperoksidaz (MPO), sitrüline histon H3 (H3cit) ve nötrofil elastaz (NE) için birincil antikorlarla boyandı. Slaytlar sekonder antikorlarla boyandı ve geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Sonuçlar bir değerlendirme formuna göre analiz edildi ve farklılıklar yarı nicel olarak kaydedildi.
Burada, farklı dokular için uygun optimize edilmiş bir NET boyama protokolü sunuyoruz. H3cit için boyama yapmak için yeni bir primer antikor kullandık ve otofloresan indirgeyici bir ajan ile spesifik olmayan boyamayı azalttık. Ayrıca, NET boyamanın sabit bir yüksek sıcaklık ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirdiğini gösterdik.

Neutrophil extracellular traps (NETs) were first visualized by Brinkmann et al. as a pathway of cellular death different from apoptosis and necrosis in 20041. In this pathway, neutrophils release their decondensed chromatin into the extracellular space to form large web-like structures covered in antimicrobial proteins that were formerly stored in the granules or cytosol. These antimicrobial proteins include neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), and citrullinated histone H3 (H3cit), which are commonly used for indirect immunofluorescence detection of NETs2. This method not only identifies the quantitative presence of these proteins; indeed, it has the advantage of specifically detecting NET-like structures. In the NETs, the mentioned proteins co-localize with extracellular DNA, which can be detected by an overlap of the fluorescence signals of each stained protein and the extracellular DNA. In contrast to the overlapping signals due to extracellular DNA and protein co-localization in NETs, intact neutrophils show no co-localization. Here, the NET components are usually stored separately in the granules, nuclei, and cytosol3.
Since their first discovery, it has been shown that NETs play a central role in numerous diseases, particularly those involving inflammation. NETs show antimicrobial functions during infection through trapping and killing extracellular pathogens in blood and tissue4,5. However, NETs have also been connected to autoimmune diseases and hyperinflammatory responses, like systemic lupus erythematosus, rheumatic arthritis, and allergic asthma6,7,8. NETs promote vaso-occlusion and inflammation in atherosclerosis, platelet adhesion, and are speculated to play a role in metastatic cancer9,10,11. Nevertheless, they are thought to have anti-inflammatory properties by reducing proinflammatory cytokine levels12. While NETs are gaining more interest in a broader field of research, a robust NET detection method is fundamental for future research.
Even though the visualization of NETs in different tissue using immunofluorescence imaging is complex and requires customization, apart from electron microscopy, it is currently one of the most renowned methods for visualizing the interactions between NETs and cells and is predominantly used in formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPE)13,14. However, comparing NET imaging is difficult, as different laboratories use their own customized protocols. These protocols differ in their use of antibodies, antigen retrieval, or permeabilization method and are often optimized for a specific type of tissue3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
After Brinkmann et al. published the first methodic study using immunofluorescent visualization of NETs in FFPE tissue, we wanted to optimize this protocol for a wider variety of tissues and species15. Additionally, to establish a broadly applicable immunofluorescence protocol, we tested different modified protocols from studies that used immunofluorescence methods in FFPE tissue to detect NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Furthermore, we tried a new H3cit antibody for more specific extracellular staining28. We hypothesize that by systematically adapting current staining protocols to different species and tissue, in vitro imaging can be improved, resulting in a better representation of the interaction between neutrophils and NETs both locally and systemically.

Yazar Spotlight: İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Görüntüleme 

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Among antibody selection for tissue imaging, the fixation process poses a challenge by epitope masking. Therefore, customized retriever step is required to expose these antigens for antibody binding. Additionally, tissue inherent autofluorescence can cause difficulties through to a high background staining.However, the use of different approaches in the protocols in the literature hinders a standardized comparison between the images. Our study aims to address the demand for standardized procedures and assist the researcher in overcoming challenges during the imaging process. We established a versatile imaging protocol applicable to different tissues by comparing various different protocols.So our work provides guiding and troubleshooting tips from antibody usage to sample mounting, highlighting the potential pitfalls. Our findings advance research by introducing a new primary antibody for citrullinated hisone three, and an autofluorescent reducing agent to minimize background staining. Furthermore, for successful imaging, we emphasize the careful handling of samples and the importance of maintaining a constant high temperature for antigen retrieval.

Protokol optimizasyonumuza başlamadan önce, NET'lerin immün boyanması için FFPE dokusu kullanan çalışmalar için PubMed'de arama yaparak başarılı boyama için temel adımları belirledik ve protokollerini karşılaştırdık. En umut verici protokol farklılıkları, protokol optimizasyonu için anahtar adımlar olarak belirlenirken, çoğunlukla birbirine karşılık gelen adımlar değiştirilmemiştir (Tablo 1).
Tablo 1: NET'lerin FFPE immün boyaması i?...

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues at JoVE.com

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Doku görüntüleme için antikor seçimi arasında, fiksasyon işlemi epitop maskelemesi ile bir zorluk teşkil etmektedir. Bu nedenle, bu antijenleri antikor bağlanması için ortaya çıkarmak için özelleştirilmiş retriever adımı gereklidir. Ek olarak, doku doğasında bulunan otofloresan, yüksek bir arka plan boyaması nedeniyle zorluklara neden olabilir.Ancak literatürdeki protokollerde farklı yaklaşımların kullanılması, görüntüler arasında standart bir karşılaştırma yapılmasını engellemektedir. Çalışmamız, standartlaştırılmış prosedürlere olan talebi ele almayı ve araştırmacıya görüntüleme sürecindeki zorlukların üstesinden gelmede yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Çeşitli farklı protokolleri karşılaştırarak farklı dokulara uygulanabilen çok yönlü bir görüntüleme protokolü oluşturduk.Bu nedenle çalışmamız, antikor kullanımından numune montajına kadar yol gösterici ve sorun giderme ipuçları sağlayarak potansiyel tuzakları vurgulamaktadır. Bulgularımız, sitrüline hisone three için yeni bir primer antikor ve arka plan lekelenmesini en aza indirmek için bir otofloresan indirgeyici ajan ekleyerek araştırmayı ilerletmektedir. Ayrıca, başarılı görüntüleme için numunelerin dikkatli bir şekilde ele alınmasını ve antijen alımı için sabit bir yüksek sıcaklığın korunmasının önemini vurguluyoruz.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

4.1K Görüntüleme.  University of Hamburg. Doku görüntüleme için antikor seçimi arasında, fiksasyon işlemi epitop maskelemesi ile bir zorluk teşkil etmektedir. Bu nedenle, bu antijenleri antikor bağlanması için ortaya çıkarmak için özelleştirilmiş retriever adımı gereklidir. Ek olarak, doku doğasında bulunan otofloresan, yüksek bir arka plan boyaması nedeniyle zorluklara neden olabilir.Ancak literatürdeki protokollerde farklı yaklaşımların kullanılması, görüntüler arasında standart bir karşıl...

Video: Yazar Spotlight: İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar Görüntüleme 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

﻿Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples

Autofluorescence Blocking and Antigen Retrieval in Tissue Samples  

To begin, prepare 10 times concentrated citrate, target retrieval solution or TRS of pH six, according to the manufacturer's instructions. Dilute it to a ratio of 1:10 with deionized water. Then heat the solution in a plastic staining jar to 96 degrees Celsius.Remove the slides from the slide rack and place them into a wet chamber. Next, pipette one or two drops of the autofluorescence-reducing agent onto each tissue sample and incubate the samples for five minutes. Stack the slides back into the slide rack, and rinse for one minute in 60%ethanol using upward and downward motions to remove the unused autofluorescence-reducing reagent.Submerge the slide rack in deionized water for five minutes. Transfer the slides into a staining jar with preheated TRS Buffer for Antigen Retrieval. Incubate the slides for 10 minutes at 96 degrees Celsius in a water bath.Remove the staining jar and let it cool to room temperature for approximately 60 to 90 minutes. Next, remove the TRS while keeping the slides in the jar. Rinse the slides twice with TRIS Buffered Saline containing 0.05%Tween at pH 7.4 for three minutes each to remove any remaining TRS residues.Place the slides in a wet chamber. Gently wipe excess water from the slides using paper tissues, then encircle each sample using a hydrophobic barrier pen to prevent the antibody solution from running off.

Doku Örneklerinde Otofloresan Blokajı ve Antijen Alımı

Immunofluorescence Staining of Neutrophil Extracellular Traps in Tissue Samples

Begin by pipetting one drop of ready-to-use blocking solution with donkey serum onto the tissue samples. Then incubate the samples for 30 minutes at room temperature. Remove the excess blocking solution from the slides by tapping the edge against a hard surface.Dilute the primary antibodies in the antibody dilution buffer to prepare 100 microliters of the final solution for each sample. Set up the antibodies, one tube for each primary antibody and one for each isocontrol antibody. Evenly spread 100 microliters of isocontrol antibodies to one sample, and 100 microliters of myeloperoxidase and citrullinated histone H3, or myeloperoxidase and neutrophil elastase antibody dilution to the other sample.Place the slides in a wet chamber and store them overnight at four degrees Celsius. The following day, tap off excess primary antibody solution from the slides and stack them in a cuvette. Rinse the slides three times for five minutes each using Tris buffered saline with tween To remove the remaining primary antibody solution.Prepare two distinctly fluorescent secondary antibodies, donkey anti-goat for myeloperoxidase and donkey anti-rabbit for citrullinated histone H3 staining. Dilute each antibody to 7.5 micrograms per milliliter concentration in the antibody dilution buffer. Place the slides in a wet chamber and dispense 100 microliters of the secondary antibody solution onto each sample.Incubate them for 30 minutes at room temperature protected from light. Remove excess secondary antibody solution by tapping the slides. Put the slides in a slide rack.Submerge the slides three times for five minutes each in a staining jar filled with PBS to wash off unbound antibodies. Prepare the dappy solution and dilute it to a concentration of one microgram per milliliter with deionized water. Submerge the slide rack in a staining jar containing the dappy solution and incubate for five minutes at room temperature in the dark.Next, submerge the slide rack in a staining jar with PBS for five minutes to wash off any excess dappy solution. Finally, mount the samples using cover slips and mounting medium. The citrullinated histone H3 antibody only bound to the extracellular histones and showed no staining of intracellular histones.The human or mouse specific myeloperoxidase antibody showed no specific staining. While the universal human and mouse antibodies showed consistent good staining for myeloperoxidase. When no blocking agent was used, some mouse samples showed more non-specific and partial positive staining.When blocked, the five minutes blocking time showed good results compared to the 10 minutes blocking time. The higher temperatures in the microwave and water bath showed consistently moderate to good antigen retrieval. Whereas in a 60 degrees Celsius water bath there was only partially positive to no staining.For double staining, more favorable results were obtained for the samples incubated at 96 degrees Celsius water bath. However, exceeding the incubation time of 40 minutes at 96 degrees Celsius resulted in less intense antibody staining.