Başlamak için, poli(A)zenginleştirilmiş RNA'nın izolasyonu için 10 ila 20 mikrogram yüksek kaliteli toplam RNA hazırlayın. Bir RNA alikotunu nükleaz içermeyen 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü beş dakika boyunca 70 santigrat derecede bir ısı bloğunda inkübe edin ve ardından iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Oligo(dT) boncukları yeniden süspanse ettikten sonra, gerekli hacimde boncuk süspansiyonunu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve manyetik boncuklar bir pelet oluşturana kadar üç dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve eşit hacimde lizis tamponu ekleyin. Boncukları tekrar askıya alın.
Tüpü üç dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. İlk saflaştırma turu için, RNA numune tüpüne lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından karışımı oligo(dT)boncuklara aktarın ve pipetlemeyi en az 10 kez tamamen yeniden süspanse edin.
Numunelerin oda sıcaklığında sürekli rotasyonla inkübe edilmesine izin verin. 15 dakika sonra, numuneyi beş dakika boyunca veya süpernatan temizlenene kadar bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Süpernatanı atın.
Boncuklara bir tane olmak üzere 600 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve yeniden süspanse etmek için dikkatlice karıştırın. Daha sonra, boncuklara 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve yeniden süspanse etmek için dikkatlice karıştırın. Tüpü beş dakika boyunca veya süpernatan temizlenene kadar mıknatısın üzerine yerleştirin.
Süpernatanı atın. Daha sonra, numune tüpüne 30 mikrolitre soğuk 10 milimolar tris HCL ekleyin ve 70 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakika sonra, tüpü mıknatısın üzerine hızlıca aktarın.
Ve süspansiyon temizlendiğinde, ayrıştırılmış poli(A)zenginleştirilmiş RNA'yı içeren süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İkinci saflaştırma turu için, ayrıştırılmış RNA örneğine 120 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. İlk saflaştırma turunda kullanılan boncukları eşit hacimde lizis tamponu ile yıkayın.
Boncukları yeniden süspanse etmek için 10 kez pipetleyin ve ardından süpernatanı atmadan önce tüpü beş dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin. RNA lizis tampon karışımını yıkanmış boncuklara aktarın ve pipetleyerek iyice karıştırın. Boncukları daha önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, numune tüpüne 25 mikrolitre soğuk 10 milimolar tris HCL ekleyin ve 70 santigrat derecede inkübe edin.
Beş dakika sonra, tüpü hızlı bir şekilde mıknatısa aktarın ve süspansiyon temizlendiğinde, ayrıştırılmış poli(a)zenginleştirilmiş RNA içeren süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, bisülfit dönüşümü için, 19 mikrolitre saflaştırılmış poli(A)zenginleştirilmiş RNA örneğini 0,2 mililitrelik sekiz şeritli bir tüpe aktarın ve önceden belirlenmiş bir ila 10.000 miktar oranında bir mikrolitre sivri uçlu kontrol ekleyin. Tüplere 130 mikrolitre dönüşüm reaktifi ekledikten ve iyice karıştırdıktan sonra, tüpü PCR makinesine yerleştirin ve PCR programını başlatın.
PCR'den sonra, sütunu toplama tüpüne yerleştirin ve sütuna 250 mikrolitre RNA bağlama tamponu ekleyin. Daha sonra 150 mikrolitre bisülfit ile muamele edilmiş numuneyi kolona aktarın ve iyice pipetleyin. Kolona 400 mikrolitre% 95 ila% 100 etanol ekleyin, kapağı hızlı bir şekilde kapatın ve birkaç kez ters çevirin.
Tekrarlanan santrifüjleme, yıkama ve kükürt giderme tamponu ile nötralizasyondan sonra, kolonu yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kolona 20 ila 30 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve bir dakika bekletin. 25 santigrat derecede 30 saniye boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin ve RNA miktarını ve kalitesini değerlendirmek için 2.2 mikrolitre süpernatanı sekiz şerit tüpüne aktarın.
Poli(A)RNA zenginleştirme etkinliği, kapiler elektroforez toplam RNA testi ile değerlendirildi ve pankreas kanseri hücre hatlarında çift saflaştırmadan sonra ribozomal RNA kontaminasyonunun azalmasına neden oldu. Bisülfit tedavisinden önce ve sonra RNA miktarı kapiler elektroforez ile değerlendirildi. Bisülfit tedavisinden sonra, RNA boyut dağılımı, bisülfit reaksiyonunun neden olduğu parçalanma nedeniyle 200 ila 500 nükleotid zirvesi gösterdi.
Amplikonun kapiler elektroforezi, minimum primer kalıntısı ve aşırı amplifikasyon piki olmadan başarılı bir kütüphane hazırlığı gösterdi. Referans dizisine hizalanan sıralama okumalarından sonra, toplam okumaların ortalaması 2.440'ı ani yükselme dizisine eşlendi ve analiz edilen toplam C'den T'ye dönüşüm oranı ortalama% 99.81'e ulaştı
